基于cdh6的eb病毒相關(guān)性鼻咽癌診斷試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種腫瘤的基因診斷試劑盒，具體地說(shuō)，是一種鼻咽癌診斷試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 邸病毒(Eptein-Barr virus,邸V)屬于丫瘤疹病毒中的一種，能感染90%的人類， 能在體外轉(zhuǎn)化B淋己細(xì)胞，與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。邸病毒在腫瘤發(fā)展的不同階段表 達(dá)各種分子，如邸NA1-6、S種潛伏膜蛋白LMPl，2A和2B W及miRNAs等。邸病毒潛伏膜蛋白1 (LMPUEB病毒的主要癌蛋白，能夠誘導(dǎo)多種信號(hào)通路，如NF-KB、MAPK kinase(ERK，p38和 JNK)、JAK/STAT等信號(hào)通路，引起上皮細(xì)胞形態(tài)與表型的改變，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換 (Elpithelial-mesenchymal transit ion，EMT)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，在邸病毒相關(guān) 腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要的致癌作用。
[0003] 在低分化和未分化鼻咽癌組織中，邸病毒潛伏蛋白1幾乎都能被檢測(cè)到，且越來(lái)越 多的研究結(jié)果表明，邸病毒的作用伴隨著鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。MicroRNAs是一類高度保守的 非編碼小RNA，主要通過(guò)與祀基因的3'末端非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)、從而抑制祀基因的轉(zhuǎn)錄和表 達(dá)，影響祀基因的生物學(xué)功能，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體細(xì)胞增殖、分化、侵襲轉(zhuǎn)移及病毒免疫逃逸等 多種而復(fù)雜的生命活動(dòng)進(jìn)程。一個(gè)miRNA可調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)祀基因，一個(gè)或不同的miRNAs都可能 參與調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。越來(lái)越多的證據(jù)表明:miRNAs表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展 有密切關(guān)系。
[0004] 巧粘蛋白（Ca化erin)家族基因 CDH6定位于5號(hào)染色體上，人DH6基因的mRNA序列在 NCBI的登錄號(hào)為NM_004932dCDH6參與細(xì)胞-細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞，在胚胎發(fā)育及上皮細(xì)胞 的微管形成等方面的作用與上皮細(xì)胞特性分子E-ca化erin的作用相反。有文獻(xiàn)報(bào)道，CDH6 異常表達(dá)在腎W及神經(jīng)組織中，與相關(guān)癌癥如腎癌的預(yù)后有重要關(guān)系，但C畑6在EB病毒相 關(guān)性鼻咽癌中尚無(wú)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的在于提出一種EB病毒相關(guān)性鼻咽癌的基因診斷試劑盒，在于為EBV 相關(guān)性鼻咽癌診斷提供一種簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、特異性高的基因診斷方法，為待測(cè)個(gè)體是 否患癌的臨床診斷提供參考W及作為鼻咽癌治療的分子祀標(biāo)。
[0006] 本發(fā)明依據(jù)國(guó)內(nèi)外鼻咽癌的分子遺傳學(xué)研究成果及課題組自身的研究結(jié)果，通過(guò) 對(duì)EBV陽(yáng)性或陰性細(xì)胞進(jìn)行miRNA忍片檢測(cè)，篩查出異常表達(dá)的miRNA。發(fā)明人前期研究證 明，在EB病毒相關(guān)的鼻咽癌中，LMPl能夠抑制miR-203的表達(dá)，使其低表達(dá)或表達(dá)缺失。該結(jié) 果在鼻咽癌組織中也得到證實(shí)。因此，miR-203能夠作為鼻咽癌在診斷和治療中的分子標(biāo)志 物。通過(guò)在線軟件化rgetScan發(fā)明人對(duì)miR-203祀基因進(jìn)行預(yù)測(cè)后分析發(fā)現(xiàn)，巧粘蛋白家族 基因 CD冊(cè)是miR-203的新的潛在祀基因。
[0007] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在邸病毒相關(guān)性鼻咽癌組織中，利用realtime-PCR技術(shù)，檢測(cè)CDH6 異常表達(dá)，因此，提示C畑6能夠與miR-203-樣，能夠作為邸V相關(guān)性鼻咽癌基因診斷和治療 中的分子祀標(biāo)。
[000引本發(fā)明的EB病毒相關(guān)性鼻咽癌診斷試劑盒為實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)試劑 盒，包括CD冊(cè)特異性引物和內(nèi)參e-act in特異性引物； 所述CD冊(cè)特異性引物序列為：
正向： 反向： ，分別如SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2所示； 所述內(nèi)參基因0-act in引物序列為：
正向 反向： ，分別如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示； 上述特異性引物的工作濃度為lOpM。
[0009 ]本試劑盒中還包括RNA提取試劑盒W及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。
[0010] 上述的試劑盒的使用過(guò)程如下：（1)收取鼻咽部組織40例，提取總RNA; (2) W總RNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄為CDNA;(3) Wc畑6特異性引物，巧光定量PCR檢測(cè)CD冊(cè)的表達(dá)，e-actin為內(nèi) 參基因。定量A Ct=待測(cè)基因 CDH6與內(nèi)參基因平均A Ct值的差值，判斷A Ct是否小于過(guò)等與 6.15,當(dāng)A Ct <6.15時(shí)，提示C冊(cè)6表達(dá)陽(yáng)性。
[0011] 本發(fā)明根據(jù)國(guó)內(nèi)外對(duì)鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制研究成果W及本課題組研究成果，發(fā)現(xiàn) CDH6能夠作為一種邸V相關(guān)性鼻咽癌的基因診斷分子。通過(guò)對(duì)基因 CD冊(cè)設(shè)計(jì)特異性引物，利 用realtime-PCR技術(shù)，為邸V相關(guān)性鼻咽癌診斷提供了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、可靠地檢測(cè)方 法。本發(fā)明可W定量檢測(cè)各人群中鼻咽部CDH6的表達(dá)情況，從而預(yù)測(cè)鼻咽部患癌的風(fēng)險(xiǎn)或 早期診斷，從而對(duì)鼻咽癌患者做出快速輔助診斷，具有巨大的普及推廣應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1是使用在線軟件化巧etScan預(yù)測(cè)CD冊(cè)和miR-203祀基因結(jié)合部位對(duì)照?qǐng)D； 圖2是Luciferase assay實(shí)驗(yàn)進(jìn)行miR-203勒!基因驗(yàn)證對(duì)比圖； 圖3是正常人和鼻咽癌患者鼻咽部組織組織樣本中LMPl的差異表達(dá)情況； 圖4是正常人和鼻咽癌患者鼻咽部組織組組織樣本中miR-203差異表達(dá)情況； 圖5是正常人和鼻咽癌患者鼻咽部組織組組織樣本中CD冊(cè)差異表達(dá)情況； 圖6是正常人和鼻咽癌患者鼻咽部組織組LMPl、miR-203和CD冊(cè)總體表達(dá)情況。
[0013] 其中，Normal tissue samples代表正常鼻咽組織樣本，EBV-LMPl-hi曲-Tumors代 表LMPl高表達(dá)組織樣本，EBV-LMPl-low-Tumors代表LMPl低表達(dá)組織樣本。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 在發(fā)明人團(tuán)隊(duì)前期研究中發(fā)現(xiàn)，LMPl高表達(dá)能夠抑制miR-203的表達(dá)，且miR-203 在鼻咽癌患者中表達(dá)較低，可W作為鼻咽癌患者診斷或治療的祀標(biāo)。
[0015] 申請(qǐng)人通過(guò)在線軟件化rgetScan預(yù)測(cè)CDH6是miR-203的祀基因（圖1)。具體實(shí)驗(yàn)過(guò) 程為：構(gòu)建CDH6基因野生型(Wtl，wt2)和突變型(mul，mu2)載體，Luciferase assay實(shí)驗(yàn)進(jìn) 行勒!基因驗(yàn)證，結(jié)果表明CDH6是miR-203的勒!基因（見(jiàn)圖2)。圖2中，*1:1-111；[111；[。3，'\￥12-mimics，mul-mimics，mu2-mimics，分別表示miR-203與CDH6 3' -UTR區(qū)結(jié)合的野生型Wtl， wt2 W及突變型mul，mu2，與miR-203類似物(mimics可W替代miR-203作用）共同處理;Wtl- nc，wt2-nc，mul-nc，mu2-nc則是對(duì)應(yīng)的miR-203類似物(mimics)的空白對(duì)照，即無(wú)關(guān)序列。
[0016] 實(shí)施例1:本發(fā)明邸病毒相關(guān)性鼻咽癌RT-PCR診斷試劑盒 本發(fā)明邸病毒相關(guān)性鼻咽癌診斷試劑盒為實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR/RT-PCR)試劑 盒，包括CD冊(cè)特異性引物和內(nèi)參e-act in特異性引物；
所述CD冊(cè)特?fù)疋缫镄蛄袨椋?正向： 反向： ，分別如SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2所示； 所述內(nèi)參基因0-act in引物序列為：
正向： 反向： '，分別如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示； 上述特異性引物的工作濃度為lOpM。
[0017