重PCR反應(yīng)的試劑為DNA聚合酶、緩沖液和dNTP混合物。試劑盒還包括5X Ion AmpliSeq? HiFi Mix緩沖液和Nuclease-free Water。在總體積為20iU的PCR反應(yīng)體系中含有下述組 分：多重PCR引物混合液lOiil，每種引物的濃度為0.1皿ol/l;5XIon AmpliSeq? HiFi Mix 緩沖液化l，Nuclease-free Water SiUaOiig/山DNA模板化1。本發(fā)明的多重PCR引物組或 試劑盒用于檢測(cè)F8基因突變。
[0096] -種用于體外檢測(cè)F8基因突變的方法，包括W下步驟：（1)采集受檢者標(biāo)本，如外 周血，提取基因組DNA; (2)應(yīng)用基因組DNA作為模板，使用本發(fā)明的由65對(duì)引物組成的引物 組，在適于擴(kuò)增目的核酸的條件下，采用多重PCR技術(shù)對(duì)F8進(jìn)行祀向擴(kuò)增，其中每一對(duì)引物 由正向引物和反向引物構(gòu)成；（3)對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，采用Ion AmpliSeq L化ra巧Kit 2.0 進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加上序列標(biāo)簽及測(cè)序接頭，不同樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所用序 列標(biāo)簽彼此不同，W區(qū)分不同DNA樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物；（4)對(duì)已加接頭的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，得 到l個(gè)受檢者的PCR產(chǎn)物文庫(kù)；（5)將多個(gè)受檢者的PCR產(chǎn)物文庫(kù)進(jìn)行等量混合直接構(gòu)建單一 文庫(kù)；（6)采用Ion PGM Xpress Template 200Kit在Ion OneTouchlXife Technologies)上 進(jìn)行乳液PCR，對(duì)模板陽(yáng)性磁珠顆粒（Ion Sphere Particles, ISPs)在Ion OneTouch ES 化ife Technologies)上進(jìn)行富集；（7)采用Ion PGM Sequencing 200Kit及Ion Torrent 316忍片在Ion Torrent PGM測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，獲得多重PCR產(chǎn)物的序列；（8)基于標(biāo)簽序 列區(qū)分不同的基因組DNA樣品，采用Ion Torrent Suite v3.0軟件通過(guò)識(shí)別序列結(jié)果中的 標(biāo)簽序列，建立各個(gè)標(biāo)簽對(duì)應(yīng)DNA樣品測(cè)序結(jié)果的數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)分析將單個(gè)樣品測(cè) 序獲得的DNA序列片段比對(duì)到參考F8基因上，進(jìn)行SNVs和Indels提取，經(jīng)化SNP數(shù)據(jù)庫(kù)過(guò)濾 后，檢索千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得千人基因組最小等位基因頻率，排除多態(tài)性變異，獲得該 標(biāo)本F8基因突變信息。
[0097]實(shí)施例
[009引基因組DNA提?。?br>[0099] 采集受檢者外周血2ml，置于抓TA抗凝管中。取抓TA抗凝外周血標(biāo)本0.2ml，按全血 DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNAdDNA濃度及純度用如bit 2.0進(jìn)行分析，提取的基因組DNA準(zhǔn) 備做下一步PCR模板用。本次研究共對(duì)8個(gè)基因 DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)，均存在已知致病突變位 點(diǎn)。
[0100] 多重PCR擴(kuò)增：
[0101] 根據(jù)F8基因序列，設(shè)計(jì)合成65對(duì)F8基因特異性引物，采用Ion AmpliSeq化Fi Master Mix進(jìn)行多重PCR，共擴(kuò)增65個(gè)短片段序列，分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64和65,引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物大小如表1所示。采用Ion AmpliSeq化Fi Master Mix,設(shè) 定反應(yīng)條件在Veriti 96-well Thermal切cler PCR儀上進(jìn)行多重PCRJCR反應(yīng)總體積為 2化1，包括每種口0?引物為0.1皿〇1/1的混合液，10化；5乂1〇114111口11569了》化尸1]\|1義，4化； Nuclease-free Water，^L lOng/化曲NA模板化L JCR循環(huán)參數(shù):99°C酶激活2min，99°C變 性15sec，60°C退火及延伸4min，共18個(gè)循環(huán)，最后4°C保持。PCR反應(yīng)在Veriti 96-well Thermal Cycler PCR儀(美國(guó)ABI公司）上完成。
[0102] 表1，擴(kuò)增F8基因的多重PCR引物








[0112]注:F為正向引物(上游引物），R為反向引物（下游引物）。表中的PCR引物序列依次 為：SEQ ID N0:1、沈Q ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、沈Q ID N0:5、沈Q ID N0:6、 SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、WQIDN0:12、 SEQIDN0:13、WQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0:16、SEQIDN0:17、SEQIDN0: 18、沈Q ID N0:19、SEQ ID N0:20、沈Q ID N0:21、SEQ ID N0:22、沈Q ID N0:23、SEQ ID NO:24、沈Q ID NO:25、沈Q ID NO:26、沈Q ID NO:27、沈Q ID NO:28、沈Q ID NO:29、沈Q ID N0:30、沈Q ID N0:31、沈Q ID N0:32、沈Q ID N0:33、沈Q ID N0:34、沈Q ID N0:35、沈Q ID N0:36、沈Q ID N0:37、沈Q ID N0:38、沈Q ID N0:39、沈Q ID N0:40、沈Q ID N0:41、沈Q ID N0:42、沈Q ID N0:43、沈Q ID N0:44、沈Q ID N0:45、沈Q ID N0:46、沈Q ID N0:47、沈Q ID N0:48、沈Q ID N0:49、沈Q ID N0:50、沈Q ID N0:51、沈Q ID N0:52、沈Q ID N0:53、沈Q ID N0:54、沈Q ID N0:55、沈Q ID N0:56、沈Q ID N0:57、沈Q ID N0:58、沈Q ID N0:59、沈Q ID N0:60、沈Q ID N0:61、沈Q ID N0:62、沈Q ID N0:63、沈Q ID N0:64、沈Q ID N0:65、沈Q ID N0:66、沈Q ID N0:67、沈Q ID N0:68、沈Q ID N0:69、沈Q ID N0:70、沈Q ID N0:71、沈Q ID N0:72、沈Q ID N0:73、沈Q ID N0:74、沈Q ID N0:75、沈Q ID N0:76、沈Q ID N0:77、沈Q ID N0:78、沈Q ID N0:79、沈Q ID N0:80、沈Q ID N0:81、沈Q ID N0:82、沈Q ID N0:83、沈Q ID N0:84、沈Q ID N0:85、沈Q ID N0:86、沈Q ID N0:87、沈Q ID N0:88、沈Q ID N0:89、沈Q ID N0:90、沈Q ID N0:91、沈Q ID N0:92、沈Q ID N0:93、沈Q ID N0:94、沈Q ID N0:95、沈Q ID N0:96、沈Q ID N0:97、SEQ ID N0:98、SEQ ID N0:99、沈Q ID N0:100、沈Q ID N0:101、沈Q ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO: 107、WQIDN0:108、SEQIDN0:109、SEQIDN0:110、SEQIDN0:111、WQIDN0:112、SEQ ID N0:113、SEQ ID N0:114、SEQ ID N0:115、SEQ ID N0:116、SEQ ID N0:117、SEQ ID NO: 118、WQIDN0:119、SEQIDN0:120、SEQIDN0:121、SEQIDN0:122、WQIDN0:123、SEQ ID N0:124、SEQ ID N0:125、SEQ ID N0:126、SEQ ID N0:127、SEQ ID N0:128、SEQ ID NO: 129、沈Q ID NO:130。
[0113] 文庫(kù)構(gòu)建：
[0114] 文庫(kù)構(gòu)建采用Life technology Ion AmpliSeq? Ubra巧 Kit 2.0通用建庫(kù)試劑 進(jìn)行制備（美國(guó)Life Technologies公司），用Ion卻ress Barcode Adapters試劑（美國(guó) Life Technologies公司）對(duì)多重PCR產(chǎn)物加上文庫(kù)接頭(Barcode Adapter)，具體操作流程 詳見(jiàn)試劑說(shuō)明書(shū)。運(yùn)用BioAnalyzer進(jìn)行定性和定量分析，圖2為文庫(kù)質(zhì)檢圖，顯示片段大小 的分布，Ion torrent測(cè)序文庫(kù)質(zhì)檢合格。
[0115] Ion Torrent PGM測(cè)序
[0116] 乳液PCR和ISPs富集：采用Ion PGM Xpress Template 200Kit在Ion OneTouch (Life Technologies)上進(jìn)行乳液PCR，對(duì)模板陽(yáng)性磁珠顆粒（Ion S曲ereParticles，ISPs) 在Ion OneTouch ES(XifeTechnologies)上進(jìn)行富集。將已上樣的Ion Torrent 316忍片轉(zhuǎn) 移到Ion Torrent PGM測(cè)序儀的忍片槽中，采用Ion PGM? Sequencing 200Kit v2試劑盒， 按照Ion Torrent PGM測(cè)序儀說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)序操作，共500次核酸流動(dòng)注射(flows)。
[0117] 結(jié)果分析：
[om] 產(chǎn)出的測(cè)序結(jié)果是一系列DNA讀序(reads),采用Ion Torrent Suite v3.0軟件通 過(guò)識(shí)別序列結(jié)果中的標(biāo)簽序列，建立各個(gè)標(biāo)簽對(duì)應(yīng)DM樣品測(cè)序結(jié)果的數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息 學(xué)分析(Burrows-Wheeler Aligner，BWA)將單個(gè)樣品測(cè)序獲得的DNA序列片段讀序比對(duì)到 參考F8基因上，進(jìn)行SNVs和Indels提取，經(jīng)化SNP數(shù)據(jù)庫(kù)過(guò)濾后，檢索千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲 得千人基因組最小等位基因頻率，排除多態(tài)性變異，獲得該標(biāo)本F8基因突變信息。對(duì)比對(duì) BAM文件應(yīng)用Integrative Genomics Viewer(IGV)軟件進(jìn)行比對(duì)讀序的可視化分析。圖3顯 示F8基因 Ion Torrent PGM測(cè)序的覆蓋深度和覆蓋率，顯示所有外顯子平均覆蓋深度達(dá)到 300X，除第10外顯子外所有外顯子覆蓋率為100%。
[0119] 通過(guò)本發(fā)明檢測(cè)了 8例血友病A患者，發(fā)現(xiàn)了 8例F8突變檢測(cè)陽(yáng)性患者，圖4顯示運(yùn)8 例F8突變檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果，A為IVS5巧G〉A(chǔ)突變;B為c.2393_2394insT突變;C為c.l331A〉C突 變；D為 C.65440T突變；E為 c.6506G〉A(chǔ)突變;F為 C.430T突變；G為 c.6320delG突變；H為 C. 16480T突變。得到的F8基因突變結(jié)果與Sanger測(cè)序的結(jié)果是一致的，說(shuō)明本發(fā)明的方法 是可行的。
[0120]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開(kāi)如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書(shū)和實(shí)施方式中所列 運(yùn)用。它完全可W被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域。對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地 實(shí)現(xiàn)另外的修改。因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限 于特定的細(xì)節(jié)和運(yùn)里示出與描述的圖例。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于多重PCR特異性擴(kuò)增檢測(cè)F8基因突變的引物組，其特征在于，所述PCR引物共65 對(duì)，分別如下： 用于擴(kuò)增F8基因外顯子1和內(nèi)含子1的引物，其正向引物如SEQ ID N0:1所示，反向引物 如SEQ ID NO:2所示； 用于擴(kuò)增F8基因內(nèi)含子1到外顯子2的引物，其正向引物如SEQ ID N0:3所示，反向引物 如SEQ ID NO:4所示； 用于擴(kuò)增F8基因外顯子2到內(nèi)含子2的引物，其正向引物如SEQ ID N0:5所示，反向引物 如SEQ ID NO:6所示； 用于擴(kuò)增F8基因內(nèi)含子2到內(nèi)含子3的引物，其正向引物如SEQ ID N0:7所示，反向引物 如SEQ ID NO:8所示； 用于擴(kuò)增F8基因內(nèi)含子3到外顯子4的引物，其正向引物如SEQ ID N0:9所示，反向引物 如SEQ ID NO: 10所示； 用于擴(kuò)增F8基因外顯子4到內(nèi)