專利名稱：豬流行性腹瀉病毒的套式pcr擴(kuò)增引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒的套式PCR擴(kuò)增引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬流行性腹灣(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹灣病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一種急性接觸性腸道傳染病，主要特征是腹灣、嘔吐、脫水以及高死亡率(Pensaert et al., , A new coronavirus-likeparticle associated with diarrhea in swine.Arch Virol.1978, 58(3): 243 247.；Ducatelle et al., Pathology of experimental CV777 coronavirus enteritis inpiglets.1.Histological and histochemical study.Vet Pathol.1982, 19(1):46 56.)。PEDV是冠狀病 毒屬的一個(gè)成員，未斷奶仔豬最易感，且這段日齡豬群的致死率可以達(dá)到95%。PEDV屬于冠狀病毒屬I群，是RNA病毒，基因組為單股正鏈，不分節(jié)段?；蚪M包含6個(gè)開放讀框(ORF)，從5'到3'順序依次為ORFl (20346 nt) ；S基因(4152 nt)；0RF3 基因(675 nt)；E 基因(231 nt)；M 基因(681 nt)和 N 基因(1326 nt) (Kocherhanset al., Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genomesequence[J].Virus Genes.2001, 23(2): 137 ~ 144.; Brian et al., Coronavirusgenome structure and replication.Curr Top Microbiol Tmmunol.2005, 287:Γ30.)。自2010年以來，一場大規(guī)模的PEDV流行在中國大陸發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。有文獻(xiàn)對此次流行的PEDV毒株及其基因進(jìn)行了細(xì)致的分析(Pan Y et al.，Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus inChina[J], Virol J.2012, Sep 12; 9:195.)，發(fā)現(xiàn)了變異毒株的與早前經(jīng)典毒株相比S基因有一些不同的基因特征。但目前還未有可以進(jìn)行變異和經(jīng)典豬流行性腹瀉病毒鑒別區(qū)分的快捷方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，通過對豬流行性腹瀉病毒S基因的分析，設(shè)計(jì)了兩對引物，并建立了套式PCR方法，可以對變異和經(jīng)典豬流行性腹瀉病毒進(jìn)行快捷的鑒別區(qū)分。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:
本發(fā)明提供了豬流行性腹瀉病毒的套式PCR擴(kuò)增引物，核苷酸序列如下:
Fl:CACTTAGCCTACCACAAGATGTCA (SEQ ID N0:1),
Rl:TCATTATCCCATGTTATGCCGA (SEQ ID N0:2)；
F2:GGTGAAAACCAGGGTGTCAA (SEQ ID NO:3)，R2:TCGCGCAGTAGCATTAGTGTTA (SEQ ID NO:4)。根據(jù)NCBI登陸的豬流行性腹瀉病毒基因組序列，登錄號:變異毒株(JN825712，JX088695, JX188454, JX489155, JX261936, JX112709, JX524137, JQ282909)和經(jīng)典毒株(AF353511，EF185992，Z25483，JQ023161, JN547228)提供的信息，經(jīng)過比對分析，設(shè)計(jì)了以上套式PCR的引物，使用上述引物進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，可以通過電泳鑒別經(jīng)典株和變異株，省去測序的步驟，節(jié)省了時(shí)間和成本。提取待檢測樣品中的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后先使用引物Fl和Rl進(jìn)行第一輪PCR，產(chǎn)物留一部分進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，另一部分繼續(xù)作為模板，以F2和R2為引物進(jìn)行第二輪PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察條帶，如果第一輪PCR產(chǎn)物僅有一條458 bp的條帶，第二輪沒有，則表明待檢樣品中含有經(jīng)典PEDV ;如果第一輪PCR產(chǎn)物僅有一條467bp的條帶，第二輪僅有一條201bp的條帶，則表明待檢樣品中含有變異的PEDV ;如果兩輪PCR產(chǎn)物均沒有條帶，表明待檢樣品中不含PEDV。本發(fā)明還提供了上述豬流行性腹瀉病毒的套式PCR擴(kuò)增引物在制備檢測經(jīng)典豬流行性腹瀉病毒和/或新型豬流行性腹瀉病毒的試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種檢測豬流行性腹瀉病毒的試劑盒，其特征在于，包括以下組分:
(O反轉(zhuǎn)錄部分:
RT預(yù)混液1:隨機(jī)引物和dNTP mix ；
RT預(yù)混液2:5倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液，RNA酶抑制劑，反轉(zhuǎn)錄酶，不含RNA酶的雙蒸水；
(2)PCR 部分:
外套PCR預(yù)混液:DNA聚合酶，引物Fl和Rl，無菌雙蒸水；
內(nèi)套PCR預(yù)混液:DNA聚合酶，引物F2和R2，無菌雙蒸水。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了一組套式PCR的擴(kuò)增引物，該引物特異性和靈敏度都較高，且能夠檢測出變異的PEDV，可以對各種臨床樣品進(jìn)行檢測、鑒別，從而可以快捷的對流行的PEDV毒株進(jìn)行區(qū)分，操作簡單、實(shí)用。


圖1:樣品檢測電泳圖，泳 道1、2、3、4、5分別為PEDV經(jīng)典株細(xì)胞培養(yǎng)液、PEDV變異株細(xì)胞培養(yǎng)液、腸道病料、糞便病料、DMEM。圖2:區(qū)分變異和經(jīng)典豬流行性腹瀉病毒的PCR特異性檢驗(yàn)電泳圖，A為第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，B為第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，泳道I為PEDV經(jīng)典毒株，泳道2為PEDV變異毒株，泳道3-8分別為豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒。圖3:區(qū)分新型和經(jīng)典豬流行性腹瀉病毒的PCR方法靈敏性檢驗(yàn)電泳圖，圖中所示為第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中泳道1、2、3、4、5、6、7分別表示待檢樣品中cDNA含量為 1.58 μ g、0.158 μ g、0.0158 μ g、1.58ng、0.158ng、0.0158ng、1.58pg。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
(I)待檢樣品RNA提取:200μ 細(xì)胞培養(yǎng)液(感染自主分離毒株CHGD-OI，該毒株經(jīng)鑒定為變異的PEDV)、20(^L細(xì)胞培養(yǎng)液(感染自主分離毒株ShQT，該毒株經(jīng)鑒定為經(jīng)典PEDV)、IOOmg的腸道病料和IOOmg糞便(病料和糞便未知是否感染病毒)以及DMEM (細(xì)胞培養(yǎng)基，不含PEDV)作為待檢樣品，分別進(jìn)行以下操作:
加入ImL PBS緩沖液進(jìn)行充分研磨，-20°C反復(fù)凍融3次,8000 rpm離心10 min,取上清液200 μ L，加入0.2mL氯仿，震蕩混勻15s后在室溫下(15°C 30°C )放置2 3min后，12000g (2°C 8°C)離心15min ;取上層水相置于新EP管中，加入0.5mL異丙醇，在室溫下(15°C 30°C)放置lOmin，12000g (2V 8°C)離心IOmin ;棄上清，加入ImL 75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7500g (2°C 8°C )離心5min，棄上清；讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥后加入20μ Rnase-Free H2O溶解，即為RNA模板。提取的RNA放于_80°C保存。(2)提取的RNA加入到反轉(zhuǎn)錄預(yù)混反應(yīng)液中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA模板。反轉(zhuǎn)錄體系及過程:8 μ L的RNA與2 μ L RT預(yù)混液I混勻，65°C反應(yīng)5min，然后迅速置于冰上2min。此反應(yīng)混合溶液再加入到RT預(yù)混液2中，混勻后置于PCR儀上，按如下條件反應(yīng):30°C IOmin ；42°C 60min ；70°C 15min (無循環(huán))。其中，RT預(yù)混液 1:Ramdom 9 mer (50M-M)和 dNTP mix (IOmM)各 IKL ；RT 預(yù)混液2:5XPrimeScirpt Buffer 4M-L, Rnase Inhibitor (40U/M-L) 0.5M-L, PrimeScript ReverseTranscriptase (200U/M-L) 1M-L, Rnase free H2O 4.5KL,均購自大連 TaKaRa 公司。

(3)將2 μ L cDNA模板加入到外套PCR預(yù)混液中，配制25 μ L反應(yīng)體系，并混合均勻。其中，外套 PCR 預(yù)混液:Premix Taq (包含 DNA Polymerasel.25U/25M-L ；BufferTris-HCl, pH8.3 20mM, KCl IOOmM, MgCl2 3mM ；dNTP Mixture 各 0.4mM) 12.5μ ，F(xiàn)l 和 Rl(均為20pmol)各0.5μ ,無菌雙蒸水9.5μ ,均購自大連TaKaRa公司。(4)將步驟(3)的PCR管置于PCR儀上進(jìn)行第一輪循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為:98°C預(yù)變性30s ;然后98°C 10s,55°C 30s, 72°C Imin共進(jìn)行35次循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0(5)取2 μ L第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，加入到內(nèi)套PCR預(yù)混液中，配制25 μ L反應(yīng)體系，混合均勻。內(nèi)套 PCR 預(yù)混液:Premix Taq (包含 DNA Polymerasel.25U/25M-L ；BufferTris-HCl, pH8.3 20mM, KCl IOOmM, MgCl2 3mM ；dNTP Mixture 各 0.4mM) 12.5μ ，F(xiàn)2 和 R2(均為20pmol)各0.5 ,無菌雙蒸水9.5 ,均購自大連TaKaRa公司。擴(kuò)增條件為:98°C預(yù)變性30s ;然后98°C 10s，55°C 30s，72°C Imin共進(jìn)行35次循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。(6)兩輪PCR各取5 μ L反應(yīng)產(chǎn)物在1% (質(zhì)量比)的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳鑒定。(7)結(jié)果判定:第一輪PCR產(chǎn)物大小458bp (經(jīng)典株)或467bp (變異株)，第二輪PCR產(chǎn)物大小201bp。兩輪PCR產(chǎn)物電泳同時(shí)有兩條產(chǎn)物467 bp和201bp條帶出現(xiàn)的即為變異株流行性腹瀉病毒，有一條458 bp條帶出現(xiàn)的為經(jīng)典豬流行性腹瀉病毒，無條帶出現(xiàn)的為陰性。檢測結(jié)果見圖1和表I。表I待檢樣品檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.豬流行性腹瀉病毒的套式PCR擴(kuò)增引物，其特征在于，核苷酸序列如下:Fl:CACTTAGCCTACCACAAGATGTCA,Rl:TCATTATCCCATGTTATGCCGA ；F2:GGTGAAAACCAGGGTGTCAA,R2:TCGCGCAGTAGCATTAGTGTTA。
2.權(quán)利要求1所述豬流行性腹瀉病毒的套式PCR擴(kuò)增引物在制備檢測經(jīng)典豬流行性腹瀉病毒和/或變異豬流行性腹瀉病毒的試劑中的應(yīng)用。
3.—種檢測豬流行性腹瀉病毒的試劑盒，其特征在于，包括以下組分: (O反轉(zhuǎn)錄部分: RT預(yù)混液1:隨機(jī)引物和dNTP mix ； RT預(yù)混液2:5倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液，RNA酶抑制劑，反轉(zhuǎn)錄酶，不含RNA酶的雙蒸水； (2)PCR 部分: 外套PCR預(yù)混液:DNA聚合酶，權(quán)利要求1所述的引物Fl和R1，無菌雙蒸水； 內(nèi)套PCR預(yù)混液:DNA聚合酶，權(quán)利要求1所述的引物F2和R2，無菌雙蒸水。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬流行性腹瀉病毒的套式PCR擴(kuò)增引物及其應(yīng)用，屬于動(dòng)物病毒學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的豬流行性腹瀉病毒的套式PCR擴(kuò)增引物，核苷酸序列如SEQIDNO:1~4所示。上述引物可用于制備檢測豬流行性腹瀉病毒的試劑盒，不但能夠檢測經(jīng)典的PEDV，還能精確檢測新型的變異毒株，且檢測的靈敏度高，對于臨床糞便、腸道內(nèi)容物等樣品都能方便、快捷地檢測，有利于制定針對性的防控措施，對于改善PEDV防控效果，保證養(yǎng)豬生產(chǎn)平穩(wěn)進(jìn)行有較大的作用。
文檔編號C12R1/93GK103243179SQ20131016845
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者王東東, 宋延華, 周慶豐, 潘永飛 申請人:廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司