專利名稱：加強(qiáng)了adpA表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌及構(gòu)建方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過加強(qiáng)adpA基因在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的表達(dá)提高豐加霉素產(chǎn)量，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豐加霉素是一種新型核苷類抗生素，分子式為C12H13N5O4,核糖C1連接類似鳥嘌呤的脫氮雜嘌呤環(huán)，核心結(jié)構(gòu)為吡咯嘧啶核苷類似物。作用機(jī)理主要是通過抑制微生物的轉(zhuǎn)錄而影響菌體的生長，其生物活性研究報(bào)道主要集中在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。近期有研究發(fā)現(xiàn)豐加霉素對(duì)多種植物疫病具有良好的防治效果，長期使用不會(huì)造成環(huán)境污染，而且對(duì)植物生長也具有一定的調(diào)節(jié)作用。因此，豐加霉素在農(nóng)業(yè)植物病害防治領(lǐng)域具有的應(yīng)用潛力。相對(duì)于化學(xué)合成法，生物法合成豐加霉素以可再生資源為原料，具有反應(yīng)條件溫和、污染少以及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此，生物合成法是目前豐加霉素工業(yè)化生產(chǎn)比較經(jīng)濟(jì)有效的方法。豐加霉素屬于鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，合成途徑復(fù)雜，受到多種因素的限制與調(diào)控，導(dǎo)致豐加霉素合成水平較低，難以規(guī)?；a(chǎn)。解決該問題的現(xiàn)有辦法一般都是通過傳統(tǒng)的誘變育種作為主要手段篩選高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的生產(chǎn)菌株，但篩選到高效菌株的不確定因素多、周期長。隨著分子生物學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，如何利用先進(jìn)技術(shù)提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量成為研究的熱點(diǎn)。有研究表明，a辦A基因是鏈霉菌A-因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的中心轉(zhuǎn)錄多效調(diào)控因子，參與多種生命活動(dòng)，可激活很多形態(tài)分化和次級(jí)代謝產(chǎn)物所需基因的表達(dá)?；疑溍咕?，天藍(lán)色鏈霉菌和阿維鏈霉菌的adpk基因均被成功克隆，研究發(fā)現(xiàn)adpk基因缺失株形態(tài)分化受阻，次級(jí)代謝產(chǎn)物合成量降低，通過基因互補(bǔ)可恢復(fù)突變株形態(tài)分化和次級(jí)代謝物合成能力。同時(shí)，將模式菌株天藍(lán)色鏈霉菌3辦八基因在其他鏈霉菌中的異源表達(dá)可以提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。但是此策略只在少數(shù)特定的菌株，及特定目標(biāo)產(chǎn)物上成功過。對(duì)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌來說，從表達(dá)體系的建立到目標(biāo)產(chǎn)物的提高涉及到復(fù)雜的因素，目前尚無報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種加強(qiáng)了 adpA表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌及構(gòu)建方法與用途。淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌^Streptomyces diastatochromogenes) 1628 是一株拮抗放線菌，其發(fā)酵液對(duì)多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，經(jīng)分離提取，確定其主要有效成分為豐加霉素，尚未見淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的代謝工程分子改造方面的的研究報(bào)道。本發(fā)明首先從以淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌i^treptomyces diastatochromogenes) 1628(菌株的保藏編號(hào)為CGMC C N0.2060)中克隆出中心轉(zhuǎn)錄多效調(diào)控因子^辦八基因，并將該基因與鏈霉菌整合表達(dá)型質(zhì)粒PIB139連接，成功構(gòu)建了攜帶aW基因的重組載體pIB139-aW，并利用接合轉(zhuǎn)移法將其整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628染色體上。一種產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌，它的染色體上過量整合了中心轉(zhuǎn)錄多效調(diào)控因子adpk基因，具有比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌{Streptomycesdi as ta tochromogenes) 1628更高的豐加霉素合成能力。所述的產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌的構(gòu)建方法，過程如下:
1)構(gòu)建表達(dá)載體pIB139-adpA；
2)利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達(dá)載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的工程菌。所述的方法，利用PIB139載體上的啟動(dòng)子permE*啟動(dòng)adpA基因的表達(dá)，利用接合轉(zhuǎn)移法將載體pIB139_adpA特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌iStreptomycesdi as ta tochromogenes) 1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的工程菌。所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌生產(chǎn)豐加霉素的用途，重組菌豐加霉素合成途徑的關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平顯著增強(qiáng)，與原始菌株相比，重組菌豐加霉素產(chǎn)量至少提高了31.6%。本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明加強(qiáng)中心轉(zhuǎn)錄多效調(diào)控因子a辦A基因在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中過量表達(dá)后使其豐加霉素合成途徑的關(guān)鍵酶基因toyF轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)，最終合成豐加霉素的能力比原始菌提高了 31.6%。為進(jìn)一步提高豐加霉素產(chǎn)量，早日實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。



圖1是重組質(zhì)粒pIB139-adpA的構(gòu)建示意圖。圖2是重組質(zhì)粒pMD18-T_adpA的酶切驗(yàn)證。1.DNA Marker DL2000 ； 2.pMD18-T_adpA/M/e l+Not I ；3.adpA 基因。圖3是重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒pIB139_adpA的酶切電泳驗(yàn)證圖。1.adpk gene ；2.ρΙΒ139-3φΑ/Λ<3ι9 l+Not I ；3.λ YMk/Hin III Marker ；4.pIB139/M/e I。圖4是重組菌1628-ADPA的PCR電泳驗(yàn)證圖。1.原始菌株；2-5.基因工程菌株；6.DL2000 Marker。圖5是重組菌1628-ADPA和原始菌toyF基因的轉(zhuǎn)錄水平分析圖。1.重組菌1628-AD PA ;2.原始菌株。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1:目的基因的擴(kuò)增及重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的構(gòu)建
以 51 di as ta tochromogenes 1628 染色體基因組為模板，以 PadpA F Nde I 和 PadpAR Not I為引物，PCR擴(kuò)增獲得含有Λ汝I和Afoi I兩個(gè)酶切位點(diǎn)的aobA基因，與pMD18_TVector 連接，構(gòu)建克隆載體 pMD18-T-ai//7A (.Nde I + Not I )，將克隆載體 pMD18-T_ai//7A(Me I + Not I)轉(zhuǎn)化至受體大腸桿菌中，涂布于含Amp的LB瓊脂平板上，37 1:培養(yǎng)過夜后，隨機(jī)挑取陽性轉(zhuǎn)化子酶切鑒定后送上海生工測序并進(jìn)行序列分析，用I和Not I雙酶切得到含有I和Not I兩個(gè)酶切位點(diǎn)的<3辦八基因，與同樣雙酶切的鏈霉菌整合型穿梭表達(dá)載體PIB139連接(圖1)，得到重組穿梭表達(dá)載體pIB139-adpA經(jīng)酶切驗(yàn)證后，將其轉(zhuǎn)入E coli ET12567(pUZ8002)，在卡那抗性和阿泊拉霉素抗性的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子疋 coli ET12567(pUZ8002，pIB139-ai//7A)，以萬.coli ET12567 (pUZ8002, ρΙΒ139-3φΑ)為供體，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌為受體，利用接合轉(zhuǎn)移法將pIB139-adpA整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌51 di as ta tochromogenes 1628染色體上，在阿泊拉霉素抗性MS平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，即得到重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-ADPA。以51 di as ta tochromogenes 1628染色體為模板，設(shè)計(jì)兩條引物，PCR擴(kuò)增adpA,引物設(shè)計(jì)如下:
adpA F Nde 1:5，-CGCCATATGATGAGCCAGGACTCCGC -3，adpA R Not 1:5，-CGCGCGGCCGCCTACGGGGCGCTGCGC-3，
重組質(zhì)粒pMD18-T-adpA以限制性內(nèi)切酶I和Not I雙酶切驗(yàn)證如圖2所示，重組質(zhì)粒pMD18-T-adpA雙酶切獲得約1.2 kb和2.7 kb的DNA片段，分別與adpA基因片段和質(zhì)粒pMD18-T的大小一致，說明重 組克隆載體連接正確。對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-T-adpA進(jìn)行測序，序列分析表明插入片段為1263 bp的序列，編碼420個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量大小分別約為46 kDa，與已報(bào)道的許多鏈霉菌屬的3辦六基因具有較高的同源性，其中最高為89%。擴(kuò)增獲得的adpA基因GenBank登錄號(hào)為:JX847412.1。整合型重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒pIB139_adpA的酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示，重組質(zhì)粒pIB139-adpA經(jīng)Λ汝I和Not I雙酶切釋放1.2 kb的片段與aobA基因大小一致，說明質(zhì)粒pIB139_adpA構(gòu)建正確，以接合轉(zhuǎn)移法將其整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌{Streptomycesdi as ta tochromogenes) 1628的染色體上,在阿泊拉霉素抗性平板上隨機(jī)挑取若干單菌落于CP培養(yǎng)基中培養(yǎng)多次后，提取染色體。PCR均能擴(kuò)增出阿泊拉霉素抗性基因a/Tr (圖4)，證明重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-ADPA構(gòu)建成功，且遺傳穩(wěn)定。實(shí)施例2 =AdpA基因的表達(dá)對(duì)豐加霉素合成關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-ADPA和原始菌株分別在CP培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，收取菌體，使用試劑盒提取總RNA以及除去DNA。通檢測260和280 nm處光吸收的比值和瓊脂糖凝電泳來確定RNA樣品的純度和質(zhì)量。檢測260處的光吸收來調(diào)整各RNA樣品的濃度，使其一致，使用試劑盒一步法進(jìn)行RT-PCR?；蚴秦S加霉素生物合成的關(guān)鍵酶基因之一，使用引物:toyF F: 5’ -CTGTCGCTGGAGCTGGTGCG ；toyF R: 5’ -CAGCGACGAGGGCGCGGCGG.可以擴(kuò)增出 toyF 基因的 400 bp 片段，16SrDNA 作 RT-PCR 分析的參照。16S rDNA F: 5’-CGATTACTAGCAACTCCGAC ;16S rDNA R:5’-GGGGTGATGGGGACTCACAG.可以擴(kuò)增出16S rDNA基因的200 bp片段。與原始菌株1628相比基因的過量表達(dá)增強(qiáng)了豐加霉素合成途徑關(guān)鍵酶基因toyF的轉(zhuǎn)錄水平(如圖5所示)。實(shí)施例3:淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌原始菌及重組菌的發(fā)酵性能驗(yàn)證
對(duì)重組菌1628-ADPA以及原始菌51 di as ta tochromogenes 1628進(jìn)行250 mL搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，從發(fā)酵角度對(duì)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中adpk基因的過量表達(dá)對(duì)豐加霉素產(chǎn)量的提高作用進(jìn)行驗(yàn)證。往復(fù)式搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，28°C，發(fā)酵96h，對(duì)照組為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌出發(fā)株。發(fā)酵結(jié)束后，測定發(fā)酵液中豐加霉素含量。如表I所示，在整個(gè)發(fā)酵過程中重組菌豐加霉素的產(chǎn)量均高于原始菌，且重組菌豐加霉素最終產(chǎn)量達(dá)到177.62 mg/L，較原始菌提高了約31.6%。且重復(fù)性良好。說明在豐加霉素生產(chǎn)菌株51 di as ta tochromogenes 1628中增強(qiáng)次級(jí)代謝網(wǎng)絡(luò)多效調(diào)控基因一AdpA的表達(dá)有助于提高發(fā)酵過程中豐加霉素的產(chǎn)量。表I重組菌與原始菌最終豐加霉素產(chǎn)量的比較
權(quán)利要求
1.一種加強(qiáng)了 a辦A表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌，其特征在于:它表達(dá)了生物合成豐加霉素代謝網(wǎng)絡(luò)的多效調(diào)控基因<3辦八，具有比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌印tomycesdi as ta tochromogenes) 1628更高的豐加霉素表達(dá)能力。
2.如權(quán)利要求1所述的加強(qiáng)了adpk基因表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌，其特征在于:所述的原始菌為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌kStreptomyces diastatochromogenes) 16280
3.如權(quán)利要求1所述的加強(qiáng)表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌，其特征在于:所述的代謝網(wǎng)絡(luò)的多效調(diào)控基因a辦A來自于待重組的原始菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(S trep tomyces di as ta tochromogenes)。
4.如權(quán)利要求1所述的加強(qiáng)了表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌，其特征在于:所述的多效調(diào)控基因adpk整合入原始菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體。
5.一種如權(quán)利要求1所述的加強(qiáng)表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的構(gòu)建方法，其特征在于，過程如下: 1)構(gòu)建表達(dá)載體pIB139-a辦A； 2)利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達(dá)載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的工程菌。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用PIB139載體上的啟動(dòng)子permE*啟動(dòng)adpk基因的表達(dá)，利用接 合轉(zhuǎn)移法將載體pIB139-ai//7A特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌{Streptomyces di as ta tochromogenes) 1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的工程菌。
7.一種利用如權(quán)利要求1所述的加強(qiáng)了表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的用途，其特征在于，重組菌豐加霉素合成途徑的關(guān)鍵酶基因toyF轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)，與原始菌株相比，重組菌豐加霉素產(chǎn)量至少提高了 31.6%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種加強(qiáng)了adpA表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌及構(gòu)建方法與用途。它過量表達(dá)了次級(jí)代謝網(wǎng)絡(luò)中心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子adpA，具有比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628更高的豐加霉素合成能力。構(gòu)建過程如下1)構(gòu)建表達(dá)載體pIB139-adpA；2)利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達(dá)載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的工程菌。利用pIB139載體上的啟動(dòng)子permE*啟動(dòng)adpA基因的表達(dá)，利用接合轉(zhuǎn)移法將載體pIB139-adpA特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的工程菌。與原始菌株相比，重組菌豐加霉素合成途徑的關(guān)鍵酶基因toyF轉(zhuǎn)錄水平顯著增強(qiáng)，豐加霉素產(chǎn)量至少提高31.6%。為進(jìn)一步提高豐加霉素產(chǎn)量，早日實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/31GK103233018SQ20131016806
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者馬正, 俞曉平, 陶立彬, 申屠旭萍, 邊亞琳, 郝培應(yīng), 許益鵬 申請人:中國計(jì)量學(xué)院