專(zhuān)利名稱(chēng)：一種表達(dá)REV env的重組MDV毒株的構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)REV env的重組MDV毒株的構(gòu)建和應(yīng)用，屬于獸用生物制品分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤是種雞和商品蛋雞的常發(fā)病，雖然其發(fā)病率和死亡率不高，但造成的經(jīng)濟(jì)損失很大，主要原因是致腫瘤病毒對(duì)雞體所引起的免疫抑制，并進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)各種疫苗免疫應(yīng)答的下降。近幾年來(lái)，在我國(guó)雞群中腫瘤病的發(fā)生率又有抬頭的趨勢(shì)。雞群中可引起腫瘤的病毒有三種，即馬立克氏病病毒(Marek’ s disease virus，MDV)、雞白血病病毒(Avian leucosis virus, ALV)和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒 (Reticuloendotheliosis viruses, REV)。長(zhǎng)期以來(lái)，在雞群中只要一出現(xiàn)腫瘤，就懷疑甚至斷言是馬立克氏病，而忽視了其它二種病毒的致病性。ALV的A、B、C、D亞型可在蛋用雞中誘發(fā)腫瘤，而ALV的J亞群則主要在肉用型種雞中誘發(fā)腫瘤。REV則在蛋用型和肉用型雞中均可誘發(fā)腫瘤。根據(jù)臨床病理變化和流行病學(xué)特點(diǎn)，雖然可以區(qū)別一些典型的馬立克氏病或白血病，但近幾年來(lái)雞群中實(shí)際發(fā)生的腫瘤的表現(xiàn)在逐漸變化，已很難僅僅根據(jù)病變來(lái)鑒別診斷究竟哪一種病毒引發(fā)的腫瘤。特別是，在同一雞群中及同一病雞中，二種不同病毒共感染的現(xiàn)象非常普遍，這更給鑒別診斷帶來(lái)了難度。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒(REV)，這是另一種反轉(zhuǎn)錄病毒，可自然感染多種鳥(niǎo)類(lèi)，在自然界分布廣泛。REV可能通過(guò)雞胚發(fā)生垂直感染，垂直感染或早期感染的雛雞，最易發(fā)生矮小綜合癥和免抑制綜合癥，同時(shí)也會(huì)誘發(fā)腫瘤。很難根據(jù)臨床病變與MDV或ALV腫瘤相區(qū)另O。目前，我國(guó)雞群中REV感染相當(dāng)普遍，毫無(wú)疑問(wèn)，有一定比例的腫瘤與REV感染有關(guān)。近二、三年中，即使在一些已用MDV CV1988/Rispens株液氮苗(本發(fā)明又簡(jiǎn)稱(chēng) CV1988疫苗)免疫的雞群，仍有腫瘤發(fā)病率抬頭的趨勢(shì)。由于人們?nèi)园阉鼩w罪于MDV，因此許多人都推測(cè)，是否出現(xiàn)了特超強(qiáng)毒型的流行株。但迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未能實(shí)驗(yàn)證明這一點(diǎn)。然而，從這類(lèi)雞場(chǎng)的腫瘤病雞，通過(guò)病毒分離，已發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)比例病雞存在著MDV和REV 的共感染。此外，在用REV和MDV 二種病毒同時(shí)作人工感染試驗(yàn)中，也確實(shí)能誘發(fā)不同細(xì)胞類(lèi)型的腫瘤結(jié)節(jié)。由于REV感染在我國(guó)雞群上已相當(dāng)普遍，有分析認(rèn)為，REV的共感染是造成CV1988 疫苗免疫雞群中腫瘤發(fā)病率升高的重要原因。由于在一些雞的REV感染造成免疫抑制，也引起了由CV1988疫苗誘發(fā)的保護(hù)性免疫下降，因而造成免疫雞群仍有腫瘤發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)室追蹤近5年廣州地區(qū)養(yǎng)殖雞群中REV的感染情況，結(jié)果表明，REV在我省雞群中的感染率從O到100%，平均約為20%。人工感染實(shí)驗(yàn)表明，REV對(duì)雛雞有很強(qiáng)的免疫抑制作用，它既顯著抑制中樞性免疫器官胸腺和法氏囊的發(fā)育，也顯著抑制感染雞對(duì)NDV 和AIV疫苗免疫后的抗體反應(yīng)，其中，對(duì)禽流感(Avian influenza virus,AIV)疫苗免疫的抑制作用更為顯著(孫淑紅，崔治中等，中國(guó)病毒學(xué)(英文版)，2006;李延鵬，崔治中等，中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008)。已有的比較實(shí)驗(yàn)表明，相對(duì)于其它免疫抑制性病毒，如MDV，CAV, ARV,ALV等，REV對(duì)雞表現(xiàn)出的免疫抑制作用最強(qiáng)(柳鳳祥，崔治中等，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009)。REV 單獨(dú)感染時(shí)可以表現(xiàn)出很強(qiáng)的免疫抑制作用，在與其它病毒共感染時(shí)，這種免疫抑制作用還會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)，表現(xiàn)出的免疫抑制更為嚴(yán)重。以對(duì)AIV-H5疫苗的免疫反應(yīng)為例，兩種病毒的共感染均顯著地抑制對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)。已有的研究結(jié)果對(duì)REV疫苗提出了迫切的要求，然而到目前為止，竟未出現(xiàn)一種 REV疫苗產(chǎn)品問(wèn)世！由于REV是反轉(zhuǎn)錄病毒，使用活疫苗存在轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞基因組的潛在風(fēng)險(xiǎn)；而REV的增殖速度又決定了目前無(wú)法通過(guò)大量培養(yǎng)REV以滿足滅活疫苗的生產(chǎn)需要。因此通過(guò)基因工程手段表達(dá)REV的免疫保護(hù)性基因，制造重組基因工程疫苗是解決這一問(wèn)題的良好方法。從雞群中MDV的流行來(lái)看，已從以弱病毒株(mMDV)為主，到以強(qiáng)病毒株(vMDV) 為主，以至近20年來(lái)超強(qiáng)病毒(vvMDV)株越來(lái)越普遍，10年前還出現(xiàn)了特超強(qiáng)病毒株(vv+MDV) (Witter RL. Increased virulenced of Marek' s Disease Viurs field isolates. Avian Pathology, 1997)?？茖W(xué)家利用各種方法構(gòu)建了各種MDV候選毒株試圖改進(jìn)疫苗的效果，但都不成功。例如，Witter和Kreager等比較了 10株新的疫苗候選株的保護(hù)性免疫效果，但結(jié)果都不比CVI988/Rispens株好(Witter，R. L. and K. S. Kreager. Serotype lviruses modified by backpassage or insertional mutagenesis approaching the threshold of vaccine efficacy in Marek' s disease. Avian Dis, 2004，48 (4) 768-782.)?？磥?lái)，面對(duì)MDV野毒株致病性增強(qiáng)的趨勢(shì)，用常規(guī)方法改進(jìn)疫苗似乎已走到了盡頭。但是，根據(jù)過(guò)去40多年中MDV演變規(guī)律，其毒力很有可能會(huì)在今后幾年變得更強(qiáng)。近年來(lái)，在我國(guó)，即使在一些已用CV1988疫苗免疫的雞群，仍有腫瘤發(fā)生率上升的趨勢(shì)，雖然國(guó)內(nèi)還沒(méi)有相關(guān)分離到特超強(qiáng)毒株的報(bào)道，但MDV的變異卻一直在進(jìn)行著。利用基因工程手段(插入、突變或缺失)失活強(qiáng)毒的致病性基因使病毒致弱是構(gòu)建MDV疫苗的一個(gè)重要策略。美國(guó)禽病腫瘤實(shí)驗(yàn)室利用粘粒系統(tǒng)分別敲除了超強(qiáng)毒株rMD5 的 pp38、 vIL18 禾口 Meq 基因(Reddy, S. M. ，B. Lupiani, I. M. Gimeno, R. F. Silva, L. F. Lee and R. L. Witter. Rescue of a pathogenic Marek' s disease virus with overlapping cosmid DNAs :use of a pp38 mutant to validate the technology for the study of gene function. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002,99 (10) 7054 ~ 7059. ；Cui， X.， L F. Lee, H. D. Hunt，W. M. Reed, B. Lupiani and S. M. Reddy. A Marek' s disease virus vIL-8 deletion mutant has attenuated virulence and confers protection against challenge with a very virulent plus strain. Avian Dis，2005，49 (2) :199 206.； Cui,X. ,L. F. Lee,W. M. Reed,H. J. Kung and S. M. Reddy. Marekr s disease virus-encoded vIL一Sgeneis involved in early cytolytic infection but dispensable for es tablishment of latency. J Virol, 2004, 78 (9) :4753 4760. ；Lupiani, B.，LF.Lee， X. Cui，I. Gimeno, A. Anderson，R. W. Morgan，R. F. Silva，R. L. Witter, H. J. Kung and S. M. Reddy. Marekr s disease virus-encoded Meq gene is involved in transformation of lymphocytes but is dispensable for replication. Proc Natl Acad Sci USA， 2004,101(32) :11815 11820.；)，結(jié)果顯示上述基因的敲除均能使MDV的毒力減弱或消失，利用上述基因缺失株作為候選疫苗來(lái)免疫雞，均能對(duì)雞提供一定程度的保護(hù)。其中，缺失Meq基因的毒株是最有前景的。最新的研究表明在用超強(qiáng)毒和特超強(qiáng)毒攻擊后，Meq基因缺失毒株能夠提供比CVI988更好的保護(hù)，這也是目前報(bào)道的保護(hù)效果最好MDV候選疫苗株(Lee, L. F. , B. Lupiani, R. F. Silva, H. -J. Kung and S. Μ. Reddy. Recombinant Marek' s disease virus (MDV) lacking the Meq oncogene confers protection against challenge with a very virulent plus strain of MDV. Vaccine,2008,26(15) :1887 1892. ；Lee, L. F. , K. S. Kreager, J. Arango, A. Paraguassu, B. Beckman, H. Zhang, A. Fadly, B. Lupiani and S.M.Reddy. Comparative evaluation of vaccine efficacy of recombinant Marek' s disease virus vaccine lacking Meq oncogene in commercial chickens. Vaccine,2010,28(5) :1294 1299)。本發(fā)明以本發(fā)明人2007年從廣東某種雞場(chǎng)分離到的MDV強(qiáng)毒株作為載體，將其基因組構(gòu)建到細(xì)菌人工染色體(BAC)上，利用recE/T介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，首先缺失其中 1個(gè)Meq基因，然后用REV env表達(dá)盒替換另一個(gè)Meq基因，從而構(gòu)建成2個(gè)Meq基因缺失的，能表達(dá)REV env基因的MDV弱毒疫苗株。該重組毒株將同時(shí)滿足保護(hù)MDV和REV的雙重需要，而MDV疫苗早期免疫的特性又符合免疫抑制性病毒需要早期進(jìn)行免疫的要求。重組MDV-REV疫苗的成功研制將為控制MDV、REV以及MDV-REV共感染對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)所造成的災(zāi)難帶來(lái)有力的武器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在構(gòu)建MDV⑶07細(xì)菌人工染色體(BAC)的基礎(chǔ)上，采用recE/T高效重組技術(shù)，通過(guò)兩次重組，最終缺失了 MDV⑶07基因組中的兩個(gè)與MDV致腫瘤相關(guān)的Meq基因， 并在其中一個(gè)Meq的位置插入了禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(REV)囊膜蛋白env基因表達(dá)框， 使最終獲得的重組病毒既失去了 MDV原有的致瘤能力，又保留了良好的免疫原性，同時(shí)還對(duì)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥具有一定的免疫保護(hù)效果。是通過(guò)利用recE/T介導(dǎo)的突變技術(shù)敲除MDV⑶07株病毒中的1個(gè)Meq基因，并再次通過(guò)Red/ET介導(dǎo)技術(shù)，用REV env表達(dá)盒替代另一個(gè)Meq基因。
具體實(shí)施例方式一、馬立克氏病疫苗病毒⑶07-env株的的構(gòu)建1. REV env表達(dá)框的構(gòu)建。(1)通過(guò)引物擴(kuò)增REV env的完整閱讀框(ORF)，并將PCR產(chǎn)物用HindIII酶和 XbaI酶消化后克隆進(jìn)pBudCE4. 1載體質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒pBud-env。F(envl) :5，-CGCCAAGCTTGACAACCAAGAAGAATG-3，(序列 1，含 HindIII 位點(diǎn))R(envl) :5，-CGTATCTAGACCTAGGGTATCCATCTC-3，(序列 2，含 XbaI 位點(diǎn))(2) PCR擴(kuò)增env基因表達(dá)框。以pBud-env為模板，設(shè)計(jì)如下引物進(jìn)行PCR F (env2)5，-atggccatgtggtctctacggcgcaaatctagcaggagtgtgcaactccgGCGCGCGTT GACATTGATTA-3，(序列3大寫(xiě)字母表示的堿基序列對(duì)應(yīng)于env基因表達(dá)框l#_20#bp的位置)。R(env2)5， -ttataagtaggattccccgtctcctgttggcgattcccgaagatttgtcaCCCCAACTT GTTTATTGCAG-3，(序列4大寫(xiě)字母表示的堿基序列對(duì)應(yīng)于env基因表達(dá)框2673#_2692#bp 的位置)。
本對(duì)引物所擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物既包含了用于同源重組的馬立克病毒基因組Meq 上、下游各50bp的同源臂(小寫(xiě)字母表示)，又包含了 P(。mv)啟動(dòng)子的全部序列，同時(shí)也包含了 SV40的早期的mRNApolyA結(jié)構(gòu)。

2. Meq基因的敲除參照已發(fā)表的研究(李延鵬馬立克氏病病毒meq基因缺失株生物學(xué)特性及其免疫效果研究，博士學(xué)位論文，2010，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所)，利用卡那霉素抗性基因 (Kanr)取代一個(gè)meq基因后，挑取菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中搖振培養(yǎng)，待其OD值達(dá)到 0. 5時(shí)，加10%的阿拉伯糖誘導(dǎo)lh，使宿主菌內(nèi)的質(zhì)粒flp重組酶被激活，從而去除Karf基因。誘導(dǎo)后將菌分別涂布于含有30 μ g/mL氯霉素或50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上 32°C過(guò)夜培養(yǎng)，篩選只在含有30 μ g/mL氯霉素的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)，但不能在含50 μ g/mL 卡那霉素的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌，即為重組菌。該重組質(zhì)粒中在被去掉的第一個(gè)Meq基因所在的位置仍保留一個(gè)flp重組酶識(shí)別的位點(diǎn)(flp recognition target，F(xiàn)RT)。3. REV env表達(dá)框替代另一個(gè)Meq基因(1)利用Red/ET同源重組將選擇標(biāo)記基因rpsL-neo表達(dá)盒替換另一個(gè)Meq基因。敲除一個(gè)Meq基因并經(jīng)驗(yàn)證后，參照本實(shí)驗(yàn)室前期的研發(fā)方法(陳瑞愛(ài).基于BAC 平臺(tái)表達(dá)REV env基因的重組rCVI988-erw的構(gòu)建及其免疫效果評(píng)價(jià).博士學(xué)位論文， 2010，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué))，利用GeneBridge公司試劑盒(Red/ET重組系統(tǒng)Counter-Selection BAC Modification Kit)中的rpsL-neo質(zhì)粒為PCR模板，擴(kuò)增兩側(cè)帶有MDV基因組Meq基因上、下游各50bp大小同源臂的選擇標(biāo)記基因rpsL-neo表達(dá)盒。引物設(shè)計(jì)如下 F(rpsL-neo)5，-atggccatgtggtctctacggcgcaaatctagcaggagtgtgcaactccgGGCCT GGTGATGATGGCGGG-3'(序列 5)。R(rpsL-neo)5， -ttataagtaggattccccgtctcctgttggcgattcccgaagatttgtcaTCAGA AGAACTCGTCAAGAA-3，(序列 6)。引物中的大寫(xiě)字母是用來(lái)擴(kuò)增rpsL-neo的序列，小寫(xiě)字母為MDVMeq基因50bp的
同源重組臂。取回收純化后的rpsL-neo基因表達(dá)盒PCR產(chǎn)物1 2 μ L(約0. 1 0. 2 μ g)加入到30 μ L預(yù)先制備好的既包含了 PRedET質(zhì)粒又包含MDV⑶07 (in BAC)的DH10B感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化(2000ν，100Ω，25μΡ)。電擊完成后，立即加入ImL事先預(yù)熱至37°C 的LB培養(yǎng)液中混勻，吸入到1. 5mL滅菌的EP管中，37 °C，220r/min,振蕩活化70min (此時(shí)，在Red α /Red β蛋白的介導(dǎo)下發(fā)生同源重組)，取100 μ L細(xì)胞懸液涂布于含有氯霉素 (Cmr, 30 μ g/mL)、四環(huán)素(Tet，3 μ g/mL)和卡那霉素(Kan，15 μ g/mL)的三種抗生素的固體瓊脂平板上，在30°C恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，挑選具有這三種抗性的陽(yáng)性菌落，接種到同樣加入三種抗生素的5mL LB培養(yǎng)液中，30°C，220r/min，避光振蕩培養(yǎng)16h左右，取少量菌液劃線接種于含有氯霉素(Cmr，30 μ g/mL)、卡那霉素(Kan，15 μ g/mL)和鏈霉素(Str， 50 μ g/mL)三種抗生素的平板上，37°C恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h左右，用以驗(yàn)證選擇標(biāo)記基因rpsL-neo表達(dá)盒的表達(dá)功能是否能夠正常得發(fā)揮；同時(shí)取0. 5mL菌液按1 %的比例接種到IOOmL同時(shí)含有氯霉素(Cmr，30 μ g/mL)、卡那霉素(Kan，15 μ g/mL)和四環(huán)素(Tet， 3 μ g/mL)三種抗生素的LB培養(yǎng)液中，37°C，220r/min，避光振蕩培養(yǎng)16h左右中量提取并純化重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)凝膠電泳初步觀察為大分子DNA的克隆然后進(jìn)一步做PCR鑒定；鑒定結(jié)果表明具有氯霉素、四環(huán)素和卡那霉素抗性而不具有鏈霉素抗性，而且能特異性的擴(kuò)增到 rpsL-neo基因的細(xì)菌克隆即為重組克隆。 (2)利用Red/ET同源重組將env基因表達(dá)盒替換掉rpsL-neo表達(dá)盒。將鑒定正確的包含rpsL-neo基因的重組陽(yáng)性克隆劃線接種到含有氯霉素(Cmr， SOyg/mL)、四環(huán)素(Tetdyg/mL)和卡那霉素(Kan，15 μ g/mL)三種抗生素的LB固體瓊脂平板上，30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h左右，挑取陽(yáng)性單個(gè)菌落，將其制備成電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。取1 2yL env基因表達(dá)盒PCR回收產(chǎn)物加入到50 μ L上述新鮮制備的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻后，置于冰浴上預(yù)冷3 5min，然后轉(zhuǎn)入到冰浴預(yù)冷的0. 2cm電轉(zhuǎn)杯中，電轉(zhuǎn)參數(shù)設(shè)置為200(^，100 0，25 4 1mm。電擊完成后立即加入ImL事先預(yù)熱至37°C 不含抗生素的LB培養(yǎng)液，混勻后立即轉(zhuǎn)入到新的1. 5mL滅菌的EP管中，37°C，220r/min振蕩培養(yǎng)70min左右，10000r/min,離心2min，棄去上清，用100 μ L不含抗生素的LB培養(yǎng)液重新懸浮菌體，涂布于含有氯霉素(Cmr，30yg/mL)和鏈霉素(Str，50 μ g/mL)兩種抗生素的固體瓊脂平板上，37°C恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h左右，待單個(gè)菌落長(zhǎng)到合適大小時(shí)，同一單菌落用兩只細(xì)小的槍頭各挑取一定量菌體，分別接種到含有氯霉素(Cmr，30y μ g/mL) 與鏈霉素(Str，50 μ g/mL)的兩種抗生素的LB培養(yǎng)液和含有氯霉素Cmr，30 μ g/mL)與卡那霉素(Kan，15yg/mL)兩種抗生素的LB培養(yǎng)液中，驗(yàn)證選擇標(biāo)記基因rpsL-neo是否被替換掉，具有氯霉素與鏈霉素兩種抗性，但不具備卡那霉素抗性的細(xì)菌單克隆為所需克隆，該克隆被命名為⑶07-env。4.重組病毒的拯救根據(jù)QIAGEN plasmid Maxi kit試劑盒(QIAGEN公司)的操作說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行重組質(zhì)粒⑶07-env的大量提取。按照轉(zhuǎn)染試劑LipfectamineTM2000 (Invitrogen公司)的說(shuō)明書(shū)，取QIAGEN plasmid Maxi kit試劑盒提取的經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒⑶07_env DNA Iyg 于 100μ LDMEM(Gibco 公司)中，取 IOyL Iipfectamine 于 100 μ L DMDM 中，將兩者混勻，室溫放置20min后，將混合物用DMDM補(bǔ)充至lmL，加入到細(xì)胞平鋪至90 %的6孔板中，37°C， 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，將6孔板中的液體換為含5%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)幾天，待病毒蝕斑形成后，將細(xì)胞消化，傳至已長(zhǎng)成單層的原代CEF，如此連續(xù)傳3 4代以擴(kuò)大病毒量，待擴(kuò)增到一定量時(shí)，用0. 25%胰酶(含0.01%的EDTA)將細(xì)胞消化，離心收集細(xì)胞，用凍存液(DMS0 小牛血清DMEM為1:3:6)重懸細(xì)胞后將其凍存于液氮中保存。該命名為 Marek’ s disease virus GD07/Δ 2Meq_env,簡(jiǎn)稱(chēng) Marek’ s disease virus ⑶07-env，或MDV⑶07_env)。該病毒株已于2011年08月29日保藏在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 5169。二、馬立克氏病病毒⑶07-env株的鑒別特性該病毒基因組上帶有三個(gè)位于特定位點(diǎn)的特定序列可作為本病毒的鑒別性標(biāo)志(1)在Meq基因缺失的位點(diǎn)留下一個(gè)34bp的FRT序列(5 ‘ -GAAGTACCTATTCTTTCTAGAGAATAGGAACTTC-3 ‘)(序列 7)；(2)在Meq基因被REV-env替代的位點(diǎn)，有env基因表達(dá)框，可用如下引物鑒定
F(env) 5' -GCGCGCGTTGACATTGATTA-3‘(序列 8)R(env) 5' -CCCCAACTTGTTTATTGCAG-3‘(序列 9)。本對(duì)引物所擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物包含了 P(。mv)啟動(dòng)子，env 0RF,以及polyA結(jié)構(gòu)。PCR 產(chǎn)物序列大小為2692bp。三.MDV⑶07-env株病毒對(duì)雞的致病性和保護(hù)性免疫作用為了研究重組MDV⑶07-env在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)馬立克氏病病毒強(qiáng)毒京-1和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒的的免疫保護(hù)效果，將1日齡SPF雞210只隨機(jī)分為7組，每組30只， 分別飼養(yǎng)于7個(gè)帶有正壓過(guò)濾空氣的SPF動(dòng)物飼養(yǎng)隔離罩內(nèi)。1日齡時(shí)第1組雞以2000PFU/ 只的劑量腹腔接種⑶07-env，第2組雞以2000PFU/只的劑量腹腔接種CVI988/Rispens疫苗株，第3組為馬立克病毒強(qiáng)毒京-1攻毒對(duì)照組，第4組雞以2000PFU/只的劑量腹腔接種 ⑶07-env，第5組為網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒攻毒對(duì)照組，第6組以2000PFU/只的劑量腹腔接種⑶07-env用來(lái)檢測(cè)REV抗體。第7組為空白對(duì)照組。免疫接種7天后，第1、2、3組分別以500PFU/只的劑量攻擊MDV京-1株。免疫接種30天后，第4、5組用REV病毒SNV 株(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授饋贈(zèng))以105TCID50/只的劑量進(jìn)行攻毒，以后每隔IOd無(wú)菌采血，以雞胚成纖維細(xì)胞進(jìn)行血液病毒分離試驗(yàn)并采用間接免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，用來(lái)確定血液中REV病毒是否存在。通過(guò)ELISA標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(IDEXX公司)檢測(cè)血清中抗REV 抗體的變化。攻毒后每周觀察雞的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，⑶07-env免疫組、CVI988/Rispens免疫組以及京_1攻毒對(duì)照組雞只死亡后都進(jìn)行解剖、觀察病變，記錄死亡率以及由MD引起的病變情況。MD病變百分?jǐn)?shù)由病變雞除以存活雞與死亡雞的總和乘以100得來(lái)。疫苗免疫效力由保護(hù)指數(shù)(PI)來(lái)確定，PI計(jì)算方法為攻毒對(duì)照組產(chǎn)生MD病變百分?jǐn)?shù)減去免疫組雞產(chǎn)生MD病變百分?jǐn)?shù)再除以攻毒對(duì)照組雞產(chǎn)生MD病變百分?jǐn)?shù)乘以100，為了增加結(jié)果的客觀性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)一次。與空白對(duì)照組相比，攻毒對(duì)照組感染京-1后雞群個(gè)體小且大小不均，生長(zhǎng)發(fā)育狀況差，羽毛粗亂、無(wú)光澤，共濟(jì)失調(diào)，一肢或雙肢的不對(duì)稱(chēng)性、進(jìn)行性不全麻痹。⑶07-env與 CVI988/Rispens免疫組雞感染京_1后大小均一，長(zhǎng)勢(shì)正常，其中⑶07_env組有6雞只死亡，CVI988/Rispens組有7只雞死亡。⑶07_env組雞群個(gè)體大小均勻，長(zhǎng)勢(shì)正常。在攻毒后90天把所有存活雞處死并剖檢，進(jìn)行肉眼觀察。與空白對(duì)照組相比，攻毒對(duì)照組肝臟、脾臟、心臟腫瘤明顯，CVI988/Rispens免疫雞有極個(gè)別表現(xiàn)輕微的MDV癥狀外(無(wú)肉眼可見(jiàn)明顯病變)，其余雞均正常，而MDV⑶07-env免疫后感染京-1組有3只雞表現(xiàn)輕微的MDV 癥狀外(無(wú)肉眼可見(jiàn)明顯病變)，其余雞均正常。與空白對(duì)照組相比，REV攻毒對(duì)照組羽毛發(fā)育異常，體重明顯偏低，個(gè)體矮小，剖檢發(fā)現(xiàn)，胸腺和法氏囊嚴(yán)重萎縮，外周神經(jīng)腫大，腺胃出現(xiàn)慢性潰瘍性炎癥。⑶07-env免疫組雞群個(gè)體大小均勻，長(zhǎng)勢(shì)正常。剖檢并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)臟器的病變。通過(guò)觀察在SPF雞群中攻強(qiáng)毒京-1后產(chǎn)生的保護(hù)效果，比較了 MDV⑶07-env和 MDVCVI988/Rispens疫苗(簡(jiǎn)稱(chēng)CVI988)的保護(hù)率。未免疫SPF雞群表現(xiàn)出97%的馬立克氏病的特有的死亡和損傷現(xiàn)象(表1)，MDV⑶07-env免疫感染京-1組的全部雞和CVI988/ Rispens免疫后感染京-1的SPF雞群與空白對(duì)照組相比，大小均一，長(zhǎng)勢(shì)正常。與CVI988/ Rispens免疫組表現(xiàn)出11%的MD輕微癥狀相比，MDV⑶07_env免疫組表現(xiàn)出8. 5%的MD 輕微癥狀。因此，⑶07-env和CVI988/Rispens對(duì)強(qiáng)毒京_1的保護(hù)指數(shù)分別為91. 5%和89%。表IMDV GD07-env與MDV CVI988疫苗對(duì)SPF雞的免疫保護(hù)比較
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)REV env的重組MDV毒株，其特征在于(1)該重組病毒既失去了MDV原有的致瘤能力，保留了良好的免疫原性，同時(shí)能表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒Reticuloendotheliosis virus囊膜蛋白env基因，對(duì)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥具有一定的免疫保護(hù)效果；(2)該重組病毒MDV⑶07-env株已于2011年8月29日保藏在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路 1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏號(hào)為 CGMCC No. 5169 ；(3)該病毒基因組上帶有二個(gè)位于特定位點(diǎn)的特定序列可作為本病毒的鑒別性標(biāo)志1)在原有的二個(gè)Meq基因位點(diǎn)，在敲除Meq基因后，在其中一個(gè)Meq基因的位置上留下一個(gè) 34bp 的序列 FRT 該序列為5，-GAAGTACCTATTCTTTCTAGAGAATAGGAACTTC-3，；2)在另一個(gè)Meq基因的位置上，含有REVenv基因表達(dá)框。
2.如權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)REVenv的重組MDV毒株，其特征在于該重組病毒的構(gòu)建是通過(guò)利用recE/T介導(dǎo)的突變技術(shù)敲除MDV⑶07株病毒中的1個(gè)Meq基因，并再次通過(guò)Red/ET介導(dǎo)技術(shù)，用REV env表達(dá)盒替代另一個(gè)Meq基因。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)REV env的重組MDV毒株在制備用于預(yù)防雞馬立克氏病或/和雞網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥的雞馬立克氏病-網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥活疫苗中的用途。
4.一種預(yù)防雞馬立克氏病或/和雞網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥的方法，其中向雞給予預(yù)防有效劑量的雞馬立克氏病_網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥活疫苗，所述的疫苗包含權(quán)利要求1所述的表達(dá)REV env 的重組 MDV GD07_env 株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達(dá)REV env的重組MDV毒株的構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明所涉及毒株一株以雞馬立克氏病疫苗病毒(MDV)廣東分離株(GD07)為載體，重組進(jìn)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)囊膜蛋白基因env的構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明所獲得的重組病毒MDV GD07-env株用作生產(chǎn)毒株所制備的疫苗，免疫1日齡雛雞，能夠預(yù)防超強(qiáng)毒株MDV誘發(fā)的雞馬立克氏病，其保護(hù)性免疫效果優(yōu)越于目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上應(yīng)用最廣泛的MDVCVI988/Rispens株疫苗；該重組病毒同時(shí)還能對(duì)REV病毒具有良好的免疫保護(hù)作用。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102344914SQ20111026302
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月7日
發(fā)明者陳瑞愛(ài) 申請(qǐng)人:廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司