線粒體基因組檢測方法及引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及線粒體基因組檢測方法及引物。
【背景技術】
[0002] 隨著科學技術的迅猛發(fā)展，DNA檢驗技術在法醫(yī)學領域中的作用越來越重要。1985 年，英國遺傳學家A.J.Jeffreys教授應用DNA指紋檢驗幫助認定了某地的強奸案罪犯，偵 破了此案，開啟了DNA檢驗技術在法醫(yī)領域的應用，極大地推動了法醫(yī)學的發(fā)展。從此，DNA 檢驗技術在法醫(yī)學領域得到了廣泛應用，如兇案現場殘留物證的鑒定、尸源認定、親子鑒 定、性別鑒定、建立罪犯基因指紋庫等諸多方面。
[0003] 為了給案件偵查提供準確可靠的依據，經常需要進行人體組織物證的鑒定。然而， 對于現場遺留的人體軟組織已經遭到嚴重破壞的情況下，核DNA發(fā)生嚴重降解，已經無法 滿足物證鑒定要求，這就需要進行線粒體DNA分析。線粒體DNA廣泛存在于人體各種組織， 包括毛發(fā)，指甲等角化組織中，具有較核DNA片段短，拷貝數多，突變率極高，母系遺傳等特 點。對現場遺留的毛發(fā)，指甲，骨骼，牙齒等進行線粒體DNA分析，并用于法醫(yī)個體識別及親 緣認定，使法醫(yī)學中陳舊，降解，微量檢材的鑒定得以解決，能夠給案件偵破提供更多的線 索和強有力的科學依據。在強奸及兇殺案現場，遺留較多的物證就是血跡，毛發(fā)，指甲等；在 失蹤多年的無名尸、碎尸案及重大災難中，尸體通常已經白骨化，核DNA提取困難。
[0004] 人類線粒體DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)是唯一分布于細胞核外的DNA，具 有自我復制，轉錄和編碼的功能。1981年，劍橋大學的Anderson等公布了線粒體基因組 的全長序列，該序列被稱為Anderson序列或劍橋序列。mtDNA全長由16596bp組成，呈雙 鏈閉合環(huán)狀，分為編碼區(qū)和控制區(qū)?？刂茀^(qū)由l〇22bp組成，其中置換環(huán)區(qū)（displacement loopregionD環(huán)區(qū)）包括三個高變區(qū)，分別是16024_16365bp的高變1區(qū)（hypervariable regionI，HVI)，73_340bp的高變2 區(qū)（hypervariableregionII，HVII)和438_574bp 的高變3區(qū)（hypervariableregionIII，HVIII)。這三個可變區(qū)的多態(tài)性在個體間表現出 高度差異性，對法醫(yī)學個體識別及親緣鑒定具有重要的意義。
[0005] 目前國際法醫(yī)學界的線粒體DNA的檢測范圍主要集中在高變區(qū)，Alves-SilvaJ 等和YaoYG等報道了HVI和HVII區(qū)域的序列變異。但由于線粒體具有異質性，編碼區(qū) 相對控制區(qū)大15倍，顯然存在大量信息，對個體身份識別具有十分重要的作用。法醫(yī)物證 鑒定的DNA檢測技術有很多，如DNA指紋技術、限制性片段長度多態(tài)性（RFLR)、單鏈構象多 態(tài)性（SingleStrandConformationalPolymorphism，SSCP)、雜交技術等，但均存在諸多缺 點，有的特異性差，靈敏度低，有的準確度低，有的對樣本的要求高。許傳超等，應用基質輔 助激光解吸電離飛行時間質譜技術（matrixassistedIasterdesorptionionizationtime offlightmassspectrometry,MALDI一T0FMS)對HVI區(qū)基因突變頻率進行篩查，該法不能 獲得線粒體DNA的序列信息。張茂雷等公布了口腔脫落細胞的線粒體DNA檢測方法，檢測 的含有核DNA的樣本，而法醫(yī)鑒定中，毛發(fā)，指甲這類角化組織樣本比較常見，核DNA極少甚 至已經完全降解，用該法可能不適用于這類樣本的檢測。。
[0006] 目前法醫(yī)領域還沒有可以廣泛應用的檢測線粒體全長序列的方法，因此，如何檢 測法醫(yī)鑒定中這類微量檢材特殊樣本的線粒體DNA全長序列，使其快速應用于法醫(yī)學領 域，是一個亟待解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明一個目的是提供一種用于擴增線粒體基因組的引物組。
[0008] 本發(fā)明提供的用于擴增線粒體基因組的引物組，包括4個引物對；
[0009]所述4個引物對分別為由MitlF引物和MitlR引物組成的引物對1、由Mit2F引 物和Mit2R引物組成的引物對2、由Mit3F引物和Mit3R引物組成的引物對3以及由Mit4F 引物和Mit4R引物組成的引物對4 ;
[0010] 所述MitlF引物的核苷酸序列為序列表中序列1 ;
[0011] 所述MitlR引物的核苷酸序列為序列表中序列2 ;
[0012] 所述Mit2F引物的核苷酸序列為序列表中序列3 ;
[0013] 所述Mit2R引物的核苷酸序列為序列表中序列4 ;
[0014] 所述Mit3F引物的核苷酸序列為序列表中序列5 ;
[0015] 所述Mit3R引物的核苷酸序列為序列表中序列6 ;
[0016] 所述Mit4F引物的核苷酸序列為序列表中序列7 ;
[0017] 所述Mit4R引物的核苷酸序列為序列表中序列8。
[0018] 上述引物組中，由上述4個引物對組成。
[0019] 其中，用每一對引物分別進行PCR擴增。
[0020] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于擴增線粒體基因組的PCR試劑。
[0021] 本發(fā)明提供的PCR試劑，包括含有上述引物對1的PCR試劑1、含有上述引物對2 的PCR試劑2、含有上述引物對3的PCR試劑3和含有上述引物對4的PCR試劑4。
[0022] 上述PCR試劑，由含有上述引物對1的PCR試劑1、含有上述引物對2的PCR試劑 2、含有上述引物對3的PCR試劑3和含有上述引物對4的PCR試劑4組成。
[0023] 上述PCR試劑中，引物對中的每條引物在其對應的PCR試劑中的工作液濃度為 10UM0
[0024]每一種PCR試劑包括 10XLAPCRbufferII、dNTPMixture、對應的引物對、LATaq 和水。
[0025] 含有上述引物或含有上述PCR試劑的試劑盒也是本發(fā)明保護的范圍。
[0026] 上述引物、上述PCR試劑在制備用于法醫(yī)鑒定檢材的產品中的應用也是本發(fā)明保 護的范圍；
[0027] 或上述引物、上述PCR試劑在制備用于法醫(yī)鑒定檢材的線粒體基因組測序產品中 的應用也是本發(fā)明保護的范圍；
[0028] 或上述引物、上述PCR試劑在制備用于線粒體基因組測序的產品中的應用也是本 發(fā)明保護的范圍；
[0029] 或上述引物、上述PCR試劑在線粒體基因組擴增中的應用也是本發(fā)明保護的范 圍；
[0030] 或上述引物、上述PCR試劑在線粒體基因組測序中的應用也是本發(fā)明保護的范 圍；
[0031] 或上述引物、上述PCR試劑在制備用于法醫(yī)鑒定個體身份識別產品中的應用也是 本發(fā)明保護的范圍。
[0032] 上述應用中，所述檢材為角化組織或骨頭或牙齒或血斑或口腔脫落細胞。
[0033] 上述應用中，所述角化組織為無毛囊毛發(fā)或指甲。
[0034] 上述應用中，所述檢材的樣本量為如下：
[0035] 所述無毛囊毛發(fā)的數量不少于1根、總長度不小于5cm ;具體為無毛囊毛發(fā)的數量 為1根、長度為5-lOcm;
[0036] 或所述指甲的表面積不小于0. 2cm2;具體為指甲的表面積為0. 2-0. 5cm2;
[0037] 或所述血斑的直徑不小于1cm，具體為血斑的直徑為l_5cm。
[0038] 上述應用中，所述廣品為試劑盒。
[0039] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種線粒體基因組DNA的擴增方法，用上述4個引物 對對線粒體基因組DNA進行PCR擴增。
[0040] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種線粒體基因組DNA測序方法。
[0041] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：
[0042] 1)分別用上述4個引物對對線粒體基因組DNA進行PCR擴增，得到4種PCR擴增 產物；
[0043] 2)以所述4種PCR擴增產物構建待測序線粒體DNA文庫；
[0044] 3)測序所述待測序線粒體DNA文庫，得到線粒體基因組DNA序列。
[0045] 上述方法中，所述檢材為角化組織或骨頭或血斑或口腔脫落細胞或牙齒。
[0046] 上述方法中，所述角化組織為無毛囊毛發(fā)或指甲。
[0047] 上述方法中，所述檢材的樣本量為如下：
[0048] 所述無毛囊毛發(fā)的數量不少于1根、總長度不小于5cm ;具體為無毛囊毛發(fā)的數量 為1根、長度為5-lOcm;
[0049] 或所述指甲的表面積不小于0. 2cm2;具體為指甲的表面積為0. 2-0. 5cm2;
[0050] 或所述血斑的直徑不小于1cm，具體為血斑的直徑為l-5cm。
[0051] 步驟2)中，所述構建包括如下步驟：
[0052]A、混合所述4種PCR擴增產物，得到混合DNA片段；
[0053]B、打斷所述混合DNA，得到斷裂后DNA片段；
[0054]C、將所述斷裂后DNA片段依次經末端修復、連接接頭、片段選擇，選取460_480bp DNA片段構成待測序線粒體DNA文庫。
[0055] 步驟B中，所述斷裂后DNA片段為200-500bp。
[0056] 上述方法中，步驟3)測序是以2100檢測結果為準，應用IonPGM測序儀按照PGM indexSE400程序對待測序線粒體DNA文庫進行測序，獲得線粒體全長序列。
[0057] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明通過針對線粒體基因組設計4對引物，并擴增、建庫、 測序，最終得到樣本的線粒體全長序列，得到更準確的線粒體序列信息；另外，本發(fā)明采用 先進的第二代高通量測序技術檢測，一次可以檢測多達上千個樣品；更重要的是本發(fā)明檢 測樣本為法醫(yī)