一種檢測(cè)微小核糖核酸與胃癌組織的相關(guān)程度的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)微小核糖核酸與胃癌組織 相關(guān)程度的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃癌是一種世界范圍內(nèi)的普通癌癥，但在東亞地區(qū)屬于高發(fā)癌癥。常年以來，醫(yī)療 工作者在胃癌的發(fā)病機(jī)理和新的診斷標(biāo)志物和治療目標(biāo)方面做了大量研究，然而在胃癌的 發(fā)病機(jī)理方面仍沒有突破進(jìn)展。近年來，在傳統(tǒng)的癌癥基金和腫瘤抑制基因的研究已經(jīng)拓 展到一個(gè)新的種類-微小核糖核酸(microRNAs)，微小核糖核酸（以下稱miR)的發(fā)現(xiàn)提 供的一種研究治療癌癥的新的契機(jī)。miR作為新發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)控因子，是一類分布廣泛 的小的非編碼蛋白質(zhì)的RNA，可抑制靶基因轉(zhuǎn)錄或蛋白翻譯從而沉默靶基因的表達(dá)。近年來 眾多研究表明miR在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中起到了關(guān)鍵作用，其主要以干預(yù)mRNA翻譯的方式負(fù) 向調(diào)控基因的表達(dá)，參與腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展。研究表明，某些miR在不同腫瘤表達(dá)具有特 異性，可作為某些腫瘤診斷的標(biāo)志物，從而提高腫瘤的診斷和治療，為人類腫瘤治療提供了 新的方向和手段。
[0003] 有研究表明，miR-433在多種腫瘤組織中低表達(dá)，其特異性的表達(dá)水平降低與腫瘤 的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)miR-433可以通過抑制cAMP應(yīng)答元件CREBl進(jìn)而抑 制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，并且發(fā)現(xiàn)miR-433可能與miR-127 -起參與了肝癌的發(fā)生和發(fā) 展。miR-433在肝癌組織低表達(dá)，并且還抑制了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。miR-433對(duì)胃癌細(xì) 胞系HGC-27的生長(zhǎng)，細(xì)胞周期，細(xì)胞遷移及細(xì)胞侵襲具有顯著的抑制作用，其可能是通過 KRAS和MAPK4信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)節(jié)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了研究微小核糖核酸與胃癌組織的相關(guān)程度，本發(fā)明提出了一種新的檢測(cè)微小 核糖核酸與癌癥組織相關(guān)程度的檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明提出的一種檢測(cè)微小核糖核酸與癌癥組織相關(guān)程度的檢測(cè)方法，其檢測(cè)過 程為：
[0006] 1、標(biāo)本的準(zhǔn)備：選取手術(shù)切除的胃癌標(biāo)本80例，每例標(biāo)本均留取腫瘤組織和距腫 瘤邊緣5cm以上的配對(duì)癌旁組織；手術(shù)標(biāo)本離體后，于20-35min內(nèi)液氮速凍，保存于-80°C 冰箱備用；根據(jù)2010年國際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期I，II，III和IV期 各20例；所有病例均確診為胃癌，臨床資料完整，均未接受放化療。
[0007] 2、組織總RNA的提取：采用Trizol裂解細(xì)胞，具體步驟參照說明書操作，分別提取 胃癌組織及配對(duì)癌旁組織總RNA;分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完 整性。
[0008] 3、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈：逆轉(zhuǎn)錄過程按照所購逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明書進(jìn) 行。
[0009] 4、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR):熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR)體系使用了miR 和內(nèi)參U6 引物以及PCR試劑盒；PCR程序?yàn)?95°C10min，95°C10s，60°C20s，72°C42s共 40 個(gè)循環(huán)，并進(jìn)行溶解曲線檢測(cè)；所有樣品均做3個(gè)重復(fù)，陰性對(duì)照以水代替cDNA模板。
[0010] 5、用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差纟I±s>表示，應(yīng)用 SPSS18. 0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)。
[0011] 優(yōu)選的：所述RNA抽提試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑 盒（All-in-One?miRNAFirst-StrandcDNASynthesisKit)和SYBRGreenIqPCR試劑 盒（All-in-〇ne?miRNAqPCRKit)均購自廣州復(fù)能基因有限公司。qPCR儀為美國ABI7500 系統(tǒng)。
[0012]優(yōu)選的：所述熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR)體系中的miR為miR-433。
[0013]優(yōu)選的：所述熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR)體系中的miR-433和內(nèi)參U6引物以 及PCR試劑盒（All-in-One?miRNAqPCRKit)均購自廣州復(fù)能基因有限公司。
【附圖說明】
[0014] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明： 圖1為溶解曲線分析miR-433擴(kuò)增效率和內(nèi)參U6擴(kuò)增效率。 下面，通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明提出的一種檢測(cè)微小核糖核酸與癌癥組織相關(guān)程度的檢測(cè)方法，其檢測(cè)過 程為：
[0016] 1、標(biāo)本的準(zhǔn)備：選取手術(shù)切除的胃癌標(biāo)本80例，其中男60例，女20例，每例標(biāo)本 均留取腫瘤組織和距腫瘤邊緣5cm以上的配對(duì)癌旁組織；手術(shù)標(biāo)本離體后，于30min內(nèi)液氮 速凍，保存于_80°C冰箱備用；根據(jù)2010年國際抗癌聯(lián)盟制定的IT#分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分 期I，II，III和IV期各20例；所有病例均確診為胃癌，臨床資料完整，均未接受放化療。
[0017] 2、組織總RNA的提取：采用Trizol裂解細(xì)胞，具體步驟參照說明書操作，分別提取 胃癌組織及配對(duì)癌旁組織總RNA;分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完 整性；所述RNA抽提試劑Trizol購自美國Invitrogen公司。
[0018] 3、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈：逆轉(zhuǎn)錄過程按照所購逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明書進(jìn) 行。cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（All-in-One?miRNAFirst-StrandcDNASynthesisKit)購自廣 州復(fù)能基因有限公司。
[0019] 4、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR):熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR)體系使用 了miR-433和內(nèi)參U6引物以及PCR試劑盒。具體實(shí)驗(yàn)試劑及結(jié)果見表1。PCR程序?yàn)?95°C10min，95°C10s，60°C20s，72°C42s共40個(gè)循環(huán)，并進(jìn)行溶解曲線檢測(cè)。所有樣品均 做3個(gè)重復(fù)，陰性對(duì)照以水代替cDNA模板。所述熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR)體系中的 miR-433和內(nèi)參U6引物以及PCR試劑盒（All-in-One?miRNAqPCRKit)均購自廣州復(fù)能 基因有限公司。
[0020] 表1熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR)體系
[0021]
[0022] 5、用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（；±s)表示，應(yīng)用 SPSS18. 0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)。
[0023] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果：
[0024]a.總RNA提取鑒定：總RNAA2M/A2S。均為1. 8~2. 0,瓊脂糖凝膠電泳顯示28s、18s， 5s條帶清晰，28s/18s亮度比約I. 8,說明RNA純度較高且完整性良好。
[0025]b.PCR溶解曲線：miR-433擴(kuò)增效率和內(nèi)參U6擴(kuò)增效率接近。溶解曲線分析均成 單一峰，說明引物特異性良好（圖1)。
[0026]c.miR在胃癌和配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)：采用AACt法對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行分析，AACt = (CTmiR433 癌-CTU6 癌）-(CTmiR433 癌芳-CTU6 癌芳），AACt 值為負(fù)，miR的表達(dá) 上調(diào)，AACt值為正，miR的表達(dá)下調(diào)。
[0027]
[0028]
[0029] d.胃癌組織miR的表達(dá)與胃癌臨床病例特征的關(guān)系：在80例樣本中，男為60例， 女為20例，其AACt值分別為2. 57±1. 40和2. 51±1. 30 ;32例< 60歲患者和48例蘭60 歲，患者的AACt值分別為2. 56±1. 37和2. 56±1. 38 ;在35例腫瘤直徑< 5cm和45例腫 瘤直徑蘭5cm的患者中，AACt值分別為2. 06±1.49和2. 92±1. 17 ;24例低分化患者與 56例中-高分化患者的AACt值分別為1.80±1.33和2.88±1.27 ;在?!分期中，40例 I-II期患者和40例III-IV期患者的AACt值分別為1.82±1. 18和1.33±1. 15 ;而33例 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者與47例無淋巴結(jié)患者的AACt值分別為3. 44±0. 95和1.93±1. 23。 經(jīng)過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法分析各組患者的miR表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)miR在胃癌組織中的表 達(dá)與患者的年齡和性別無明顯相關(guān)（P>〇. 05)而與腫塊大小，分化程度，臨床分期和淋巴結(jié) 轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P〈〇.〇5)。
[0030] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)微小核糖核酸與胃癌組織相關(guān)程度的檢測(cè)方法，其特征在于，檢測(cè)過程 為： a、 標(biāo)本的準(zhǔn)備：選取手術(shù)切除的胃癌標(biāo)本80例，每例標(biāo)本均留取腫瘤組織和距腫瘤邊 緣5cm以上的配對(duì)癌旁組織；手術(shù)標(biāo)本離體后，于20-35min內(nèi)液氮速凍，保存于-80°C冰箱 備用；根據(jù)2010年國際抗癌聯(lián)盟制定的IT#分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期I，II，III和IV期各 20例；所有病例均確診為胃癌，臨床資料完整，均未接受放化療； b、 組織總RNA的提取：采用Trizol裂解細(xì)胞，具體步驟參照說明書操作，分別提取胃 癌組織及配對(duì)癌旁組織總RNA;分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整 性； c、 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈：逆轉(zhuǎn)錄過程按照所購逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明書進(jìn)行； d、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR):熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR)體系使用了miR和內(nèi) 參U6引物以及PCR試劑盒；PCR程序?yàn)?5°C 10 min，95°C 10s，60°C 20s，72°C 42s共40個(gè) 循環(huán)，并進(jìn)行溶解曲線檢測(cè)；所有樣品均做3個(gè)重復(fù)，陰性對(duì)照以水代替cDNA模板； e、 用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)均以均數(shù) -標(biāo)準(zhǔn)差(i-s)表示，應(yīng)用SPSS18. 0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì) 設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)。2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)微小核糖核酸與胃癌組織相關(guān)程度的檢測(cè)方法，其特征在 于，所述的miR為miR-433。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微小核糖核酸與胃癌組織的相關(guān)程度的檢測(cè)方法。檢測(cè)過程分為標(biāo)本的準(zhǔn)備，組織總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR），用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析等5個(gè)步驟，通過本方法能較為準(zhǔn)確的測(cè)定所檢測(cè)的微小核糖核酸與胃癌組織的相關(guān)程度。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105087766
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410215085
【發(fā)明人】顧掌生, 吳魏, 戴利成
【申請(qǐng)人】湖州市中心醫(yī)院
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2014年5月20日