實時熒光pcr和探針法融解曲線結(jié)合的多重核酸檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及多重核酸檢測探針和檢測方法，具體涉及一種實 時熒光PCR和探針法融解曲線技術(shù)相結(jié)合的多重核酸檢測探針和檢測方法。本發(fā)明還涉及 所述探針或方法用于多重核酸檢測的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 自實時熒光定量PCR(Real-timePCR)技術(shù)發(fā)明以來，該技術(shù)通過實時監(jiān)測雜交探 針釋放的熒光信號，能夠定性或者定量檢測樣本中的核酸。由于其具備靈敏度高、特異性 強、污染少等特點，在核酸檢測領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。
[0003] 融解曲線（meltingcurve)技術(shù)主要運用染料法或者探針法對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行定 性檢測或者分析。其中，染料法主要通過在PCR終產(chǎn)物中加入飽和或者半飽和染料，該染料 能和產(chǎn)物的雙鏈DNA結(jié)合并發(fā)光，根據(jù)產(chǎn)物Tm值不同形成不同的融解峰。探針法融解曲線 主要利用熒光標(biāo)記的探針和PCR終產(chǎn)物進(jìn)行雜交，探針和產(chǎn)物雜交時會釋放熒光信號；不 同熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針代表不同的檢測項，并且也以探針和產(chǎn)物雜交時的Tm值對應(yīng)的融 解峰判斷陰陽性；探針法融解曲線技術(shù)可用于核酸定性檢測，主要應(yīng)用核酸突變方面的檢 測，因為探針的Tm值會隨不同的堿基突變而有所變化，形成不同融解峰，這樣就可以根據(jù) 融解峰的Tm值的不同具體判斷突位點。
[0004] 多重?zé)晒釶CR技術(shù)是指利用實時熒光定量PCR技術(shù)、在同一反應(yīng)體系內(nèi)用多對引 物及探針擴(kuò)增一種或多種不同擴(kuò)增子的檢測方法。由于其具備靈敏度高、特異性強、污染 少、快捷及節(jié)約成本等優(yōu)點，已成為目前該領(lǐng)域的主要研究及應(yīng)用熱點。但本技術(shù)受到檢測 設(shè)備通道數(shù)目限制，目前的多重?zé)晒舛縋CR儀檢測樣本數(shù)至多為四個或五個。如果能實 現(xiàn)在現(xiàn)有設(shè)備通道基礎(chǔ)上擴(kuò)大檢測樣本數(shù)目，那么將能夠進(jìn)一步節(jié)約時間、降低成本、提高 效率和擴(kuò)大應(yīng)用范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明通過將實時熒光PCR和探針法融解曲線技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)了核酸的實時檢 測分析和終點分析相結(jié)合，使在同一反應(yīng)體系內(nèi)可檢測的樣本數(shù)能夠達(dá)到基于實時熒光 PCR技術(shù)可檢測的樣本數(shù)的兩倍，由此完成了本發(fā)明。
[0006] 本發(fā)明第一方面涉及基于探針法融解曲線技術(shù)進(jìn)行多重核酸檢測的探針，其特征 在于該探針不能被DNA聚合酶水解，并且該探針與核酸結(jié)合的退火溫度比同一反應(yīng)體系中 實時熒光PCR的探針與核酸結(jié)合的退火溫度低3_20°C。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的探針，其中所述核酸為DNA或RNA。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的探針，其中所述DNA聚合酶具有5'_3'外切酶活性。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的探針，其5'端的五碳糖、堿基或者報告熒光基團(tuán)被 基團(tuán)修飾，所述基團(tuán)例如為氨基、硫基、甲基或生物素等。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的探針，所述探針與核酸結(jié)合的退火溫度比同一反應(yīng) 體系中熒光PCR探針與核酸結(jié)合的退火溫度低5-15°C。
[0011] 在本發(fā)明的實施方案中，所述探針與核酸結(jié)合的退火溫度比同一反應(yīng)體系中實時 熒光探針與核酸結(jié)合的退火溫度低12°c。
[0012] 在本發(fā)明中，降低探針與核酸結(jié)合的退火溫度的方法為本領(lǐng)域所公知，例如，縮短 探針的長度、改變核酸的堿基組成或者引入突變位點。
[0013] 在本發(fā)明中，通過引入突變位點降低探針與核酸結(jié)合的退火溫度的方法為本領(lǐng)域 所公知，例如正常引入一個A/T的突變，Tm值變化在2°C左右，引入一個G/C的突變，Tm值 變化在4 °C左右。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的探針，所述探針的長度為10_40bp，例如為 16_21bp。
[0015] 在本發(fā)明的實施方案中，所述融解曲線探針的長度為20bp。
[0016] 本發(fā)明第二方面涉及基于探針法融解曲線技術(shù)進(jìn)行多重核酸檢測的反應(yīng)體系，其 包含本發(fā)明第一方面任一項的探針。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的反應(yīng)體系，其中所述的探針個數(shù)與該檢測設(shè)備的檢 測通道個數(shù)相匹配，例如當(dāng)檢測通道為4個時，則探針可以為1-4個，當(dāng)檢測通道為5個時， 探針可以為1-5個。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的反應(yīng)體系，其還包含相應(yīng)的待測樣本、引物等。
[0019] 本發(fā)明第三方面涉及多重PCR反應(yīng)體系，其包括基于實時熒光PCR技術(shù)的反應(yīng)體 系以及本發(fā)明第二方面任一項的基于探針法融解曲線技術(shù)進(jìn)行多重核酸檢測的反應(yīng)體系。
[0020] 在本發(fā)明中，基于實時熒光PCR技術(shù)的反應(yīng)體系為本領(lǐng)域所公知。
[0021 ] 在本發(fā)明的實施方案中，所述實時熒光PCR技術(shù)為實時熒光PCR探針技術(shù)，例如為 Taqman探針實時熒光PCR。
[0022] 本發(fā)明第四方面涉及基于實時熒光PCR和探針法融解曲線技術(shù)相結(jié)合的多重核 酸檢測方法，所述檢測方法包括使用本發(fā)明第一方面任一項的探針、第二或第三方面任一 項的反應(yīng)體系的步驟。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明第四方面任一項的檢測方法，所述方法包括以下步驟：
[0024](1)在基于實時熒光PCR的基本反應(yīng)體系中，另外加入一種或多種待測核酸樣本， 以及與該待測核酸樣本對應(yīng)的一個或多個本發(fā)明第一方面任一項的探針；
[0025] (2)同時設(shè)定實時熒光PCR反應(yīng)程序，以及探針法融解曲線反應(yīng)程序，所述融解曲 線反應(yīng)程序的起始溫度與本發(fā)明第一方面任一項的探針的退火溫度相比，低3-20°C，例如 低 5-15。。；
[0026] (3)待反應(yīng)程序結(jié)束后，對得到的基于實時熒光PCR技術(shù)的擴(kuò)增曲線和基于探針 法融解曲線技術(shù)的融解曲線進(jìn)行分析。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明第四方面任一項的檢測方法，其中所述實時熒光PCR技術(shù)為實時熒光 PCR探針技術(shù)，例如為Taqman探針實時熒光PCR。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明第四方面任一項的檢測方法，其中步驟（1)中所述的另外加入的核酸 樣本數(shù)或本發(fā)明第一方面任一項的探針的個數(shù)最多與同一反應(yīng)體系中基于實時熒光PCR 技術(shù)可檢測的樣本數(shù)或探針數(shù)相同。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明第四方面任一項的檢測方法，其中步驟（1)的基本反應(yīng)體系中還含有 引物、實時熒光PCR探針及其它實時熒光PCR或探針法融解曲線技術(shù)所必需的成分。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明第四方面任一項的檢測方法，其中步驟（1)中的本發(fā)明第一方面任一 項的探針還連接有報告熒光基團(tuán)，當(dāng)該探針的數(shù)目為多個（例如為2、3、4、5個）時，這些探 針之間的報告熒光基團(tuán)不同。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明第四方面任一項的檢測方法，其中所述的融解反應(yīng)程序為：從比本發(fā) 明第一方面任一項的探針與核酸的退火溫度低5_15°C開始（即起始溫度），逐漸升溫至 90-99°C，每秒鐘升溫0.rc左右。
[0032] 在本發(fā)明的實施方案中，所述融解曲線反應(yīng)程序中的起始溫度與的探針的退火溫 度相比低TC左右。
[0033] 在本發(fā)明的實施方案中，所述融解反應(yīng)程序為40°C(即起始溫度）升溫到95°C， 每秒鐘升溫〇.rc，全程收集熒光信號。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明第四方面任一項的檢測方法，其中所述核酸為DNA或RNA。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明第四方面任一項的檢測方法，該方法可用于檢測2-10種核酸類型。
[0036] 在本發(fā)明的實施方案中，基于實時熒光PCR技術(shù)和探針法融解曲線技術(shù)檢測的核 酸類型個數(shù)各為一個。
[0037] 本發(fā)明第五方面涉及本發(fā)明第一方面任一項的探針、第二或第三方面的反應(yīng)體系 或第四方面任一項的檢測方法用于檢測核酸的用途。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明第五方面任一項的用途，其中所述的核酸為DNA或RNA。
[0039] 在本發(fā)明的實施方案中，所述檢測核酸是指定性檢測核酸。
[0040] 在本發(fā)明的實施方案中，所述檢測核酸是指用于檢測多重核酸，例如為檢測2-