一種檢測(cè)白血病干細(xì)胞是否存在的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及白血病診斷試劑盒，更具體地講，涉及利用新發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞程序開(kāi)發(fā) 檢測(cè)白血病干細(xì)胞是否存在的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)普遍認(rèn)為白血病復(fù)發(fā)的主要原因是由于現(xiàn)有的治療方法無(wú)法清除體內(nèi)的白血 病干細(xì)胞（leukemicpropagatingcells,LPCs)，檢測(cè)LPCs是否存在是判斷白血病預(yù)后的 重要途徑。目前只有功能實(shí)驗(yàn)（如移植給免疫缺陷小鼠）才能判斷LPCs的存在，但是實(shí)驗(yàn) 要求苛刻、耗時(shí)很長(zhǎng)，不利于臨床應(yīng)用。目前也沒(méi)有確實(shí)的細(xì)胞表面分子可以檢測(cè)LPCs。
[0003] 作為干細(xì)胞，LPCs有自我更新能力和一定的分化能力，相應(yīng)地，LPCs-定有干細(xì) 胞程序（包括自我更新所需程序）。因此本發(fā)明根據(jù)功能已知的諸基因設(shè)計(jì)了一個(gè)造血干 細(xì)胞（hematopoieticstemcell,HSC)程序，利用普通的定量PCR技術(shù)檢測(cè)該程序基因在白 血病細(xì)胞的表達(dá)譜，就可以快速準(zhǔn)確地判定LPCs是否存在，并因此判斷病人的預(yù)后。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是，提供一種檢測(cè)白血病干細(xì)胞是否存在的試 劑盒。
[0005] 本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是，提供HSCB程序在制備檢測(cè)白血病干細(xì)胞 是否存在的試劑盒中的應(yīng)用。
[0006] 為了解決上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)白血病干細(xì)胞是否存在的 試劑盒，其特征在于，所述試劑盒通過(guò)檢測(cè)造血干細(xì)胞程序即HSCB程序來(lái)檢查白血病干細(xì) 胞的存在，所述HSCB程序包含以下基因：H0XB4、BMII、TEL、AMLl、PTEN、IKZFl、MLL、GFI1、 TCF3、EBF1、SPI1、IKZFl、DNTT、PAX5、VPREBl、RAGl/2、LEFl和IGLLl。
[0007] 作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述試劑盒包含以下引物（SEQIDNO. 1 -SEQIDNO. 36):

[0044] 為了解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了HSCB程序在制備檢測(cè)白血病干細(xì) 胞是否存在的試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述HSCB程序包含以下基因：H0XB4、BMI1、 TEL、AMLl、PTEN、IKZFl、MLL、GFII、TCF3、EBFl、SPII、IKZFl、DNTT、PAX5、VPREBl、RAG1/2、 LEFl和IGLLl。
[0045] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明設(shè)計(jì)的干細(xì)胞程序，即HSCB程序能忠實(shí)地反映造血細(xì) 胞的全轉(zhuǎn)錄組，判定造血細(xì)胞群的干性特征和分化階段。檢測(cè)HSCB在白血病細(xì)胞的表現(xiàn)并 與正常細(xì)胞群進(jìn)行比較，如果白血病細(xì)胞在HSCB的表現(xiàn)接近正常造血干細(xì)胞和/或早期祖 細(xì)胞，就可以判斷LPC的存在，預(yù)示病人的預(yù)后差。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的試劑盒檢測(cè)方便，準(zhǔn)確 可靠，可以廣泛用于白血病的診斷，檢測(cè)LPCs是否存在和判斷病人的預(yù)后。
【附圖說(shuō)明】
[0046] 圖IHSCB程序的設(shè)計(jì)和在正常臍帶（CB)血細(xì)胞的表現(xiàn)。A，HSC向B細(xì)胞分化的 模式圖和各個(gè)階段的調(diào)控基因，這些基因組成了HSCB程序。B，用流式分選儀分選不同的細(xì) 胞群。C，定量PCR檢測(cè)HSCB程序各基因在不同細(xì)胞群中的表達(dá)。D，生物信息學(xué)聚類(lèi)分析 HSCB程序在不同細(xì)胞群中的分布和相互關(guān)系。
[0047] 圖2HSCB程序在ALL白血病細(xì)胞群中的表現(xiàn)和與正常細(xì)胞群的比較。A，ALL細(xì)胞 群的分選。B，定量PCR檢測(cè)HSCB程序基因在ALL細(xì)胞群中的表達(dá)譜。C，聚類(lèi)分析HSCB程 序在各個(gè)ALL細(xì)胞群中的分布和相互關(guān)系。D，PCA分析HSCB程序在正常CB細(xì)胞群中的分 布和相互關(guān)系。E，PCA分析HSCB程序在ALL細(xì)胞群中的分布和相互關(guān)系。F，用PCA方法 比較ALL細(xì)胞群與正常CB細(xì)胞群之間的關(guān)系。G，根據(jù)PCA分析，計(jì)算ALL細(xì)胞群與CB各 細(xì)胞群之間差異。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú) 特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途 徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例 中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。
[0049] 實(shí)施例I.HSCB程序的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用
[0050] 1 ?設(shè)計(jì)HSCB程序。
[0051] 1)選擇調(diào)控HSC自我更新的基因
[0052] 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，如下基因已經(jīng)被功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)是調(diào)控HSC自我更新所必需的基 因：H0XB4、BMI1、TEL(或稱(chēng)為ETV6)、AMLl(或稱(chēng)為RUNX1)、PTEN、IKZF1、MLL和GFIl(圖 IA) 〇
[0053] 2)選擇調(diào)控B細(xì)胞發(fā)育的基因
[0054] 從HSC發(fā)育到成熟的B細(xì)胞要經(jīng)過(guò)早期淋巴祖細(xì)胞（ELPCP)、Pro_B祖細(xì)胞、Pre-B 祖細(xì)胞、不成熟和成熟B細(xì)胞（IM/M-B)。
[0055] 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，如下基因已經(jīng)被功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)是調(diào)控B細(xì)胞發(fā)育不同階段所必需 的基因：TCF3、EBFl、SPIl、IKZFl、DNTT、PAX5、VPREBl、RAGl/2、LEFl和IGLLl(圖 1A)。
[0056] 3)將上述兩方面的基因組成一個(gè)程序
[0057] 本發(fā)明將其命名為HSCB程序（HSCBprogram,圖1A)。
[0058] 2.從正常臍帶血分離不同造血細(xì)胞群，檢測(cè)HSCB程序在這些細(xì)胞群中的表達(dá)譜。
[0059] 1)取正常臍帶血（cordblood,CB)，用梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cell，MNC)，用免疫磁珠法分離⑶34+細(xì)胞。
[0060] 2)按如下干祖細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記，用流式分選儀分選各個(gè)干細(xì)胞群（圖 IB) ：
[0061]HSC，CD34+CD38CD19;
[0062] ELPCP，CD34+CD38+CD19 ;
[0063] Pro-B，CD34+CD38+CD19+;
[0064]Pre-B，CD34CD19+IgM;
[0065] 頂/M-B，CD34CD19+IgM+。
[0066] 3)利用定量Real-timePCR檢測(cè)HSCB程序組成基因的表達(dá)量，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，統(tǒng) 計(jì)結(jié)果如圖IC所示。所用引物系列分別為（SEQIDNO. 1 -SEQIDNO. 36):
[0067]H0XB4:正向引物 5' -TGAGCACGGTAAACCCCAATTACG-3，；
[0068]反向引物 5' -AGAGCGCGTGGGCGATCTC-3，；
[0107]聚類(lèi)分析結(jié)果顯示（圖ID)，HSCB程序在各個(gè)細(xì)胞群聚集非常好，并且從HSC到 IM/M-B依序排列。用PCA(principlecomponentsanalysis)方法分析也進(jìn)一步證明了這一 結(jié)果（圖2D)。這些結(jié)果說(shuō)明：①HSCB程序可以在細(xì)胞群水平進(jìn)行檢測(cè)分析；②HSCB程序 可以很好代表整個(gè)轉(zhuǎn)錄組；③HSCB程序可以作為干細(xì)胞程序來(lái)檢查白血病LPCs的存在。
[0108] 4.分離11例病人白血病細(xì)胞各個(gè)相應(yīng)細(xì)胞群，檢測(cè)HSCB程序在這些細(xì)胞群中的 表達(dá)譜。
[0109] 1)我們收集了 11例急性淋巴細(xì)胞性白血?。╝cutelymphoblastic leukemia,ALL)的白血病細(xì)胞。用梯度離心方法分離單個(gè)核細(xì)胞。用流式細(xì)胞分析儀分 離與正常細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞群（圖2A)，因?yàn)槲覀兒推渌芯拷M已經(jīng)報(bào)道這些細(xì)胞群含有 LPCs：
[0110]ALL特異性的細(xì)胞群（ALL-SP)，CD34+CD38CD19+);
[0111] ALL-Pro-B，CD34+CD38+CD19+;
[0112] ALL-Pre-B，CD34CD38+CD19+ ;