一種安全快速鑒定食品中豬源性成分的檢測方法及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種食品檢測方法，具體地說是一種安全快速鑒定食品中豬源性成分 的檢測方法及其試劑盒，屬于食品檢測方法領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，對牛、羊肉的市場需求將不斷擴大，近年 來一些不法分子為了謀取高額利潤，在市場上出現(xiàn)一些在牛、羊肉中摻雜豬肉的假牛、羊肉 等冷凍肉卷及肉片造假產(chǎn)品，還出現(xiàn)了一些以豬頭肉、豬瘦肉，佐以八角、桂皮、花椒等調(diào)料 一同熬成的"假肉湯"。這些以豬肉冒充牛、羊肉、以假充真、摻雜使假的違法行為，僅靠肉 組織的形態(tài)學(xué)檢查已不能滿足對肉產(chǎn)品種屬鑒定的需要。為更好保護新疆、寧夏以及周邊 中亞地區(qū)等地少數(shù)民族的風(fēng)俗習(xí)慣，對其清真食品的食用安全提供保障，確保我國的社會 穩(wěn)定；故建立一種安全有效、準確、迅速鑒定各類制品中豬源性成分的檢測方法成為當(dāng)務(wù)之 急。
[0003] 目前分子生物學(xué)技術(shù)已越來越多地用于肉源種屬的鑒定，具有重復(fù)性好、靈敏度 高等優(yōu)點，并可以克服形態(tài)學(xué)鑒定中主觀性強等缺點。16SrRNA基因進化速度適中，遺傳 信息豐富，同時隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA序列數(shù)據(jù)庫也日益增長，在GenBank中已 經(jīng)積累了大量相關(guān)的序列信息資源，成為生物檢材種屬鑒定的基礎(chǔ)。本發(fā)明即采用mtDNA 16SrRNA基因序列直接測序的方法，實現(xiàn)對各類制品中豬源性成分的鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明設(shè)計了一種安全快速鑒定食品中豬源性成分的檢測方 法及其試劑盒，利用線粒體DNA基因測序方法對各類制品中的豬肉源性進行分析鑒定，結(jié) 果準確、靈明度高，能快速檢測食品中所含的豬肉成分，不但杜絕了以豬肉冒充牛、羊肉、以 假充真、摻雜使假的違法行為，也對新疆、寧夏和其周邊的中亞地區(qū)等少數(shù)民族聚居區(qū)清真 食品的食用安全提供了保障，也為我國社會的穩(wěn)定提供了可靠的技術(shù)支持。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案為： 一種安全快速鑒定食品中豬源性成分的檢測方法，具體包括以下步驟： (1) 設(shè)計引物：設(shè)計只能擴增豬線粒體DNA的豬特異性引物，所述特異性引物包括上游 引物和下游引物兩種，其序列如下： 上游引物F:5-ATGAAACAITGGAGTAGTCCTACTAITTACC-3 ; 下游引物R:5-CTACGAGGTCTGITCCGATATAAGG-3 ; (2) 模板DNA提?。翰捎梅?氯仿法提取模板DNA，并于質(zhì)量分數(shù)0. 8%的瓊脂糖電泳進 行檢測，提取的模板DNA于-20°C備存； (3) PCR擴增引物及反應(yīng)體系：反應(yīng)總體系25uL，包括12. 5uL的PCRMix，2. 5pmol/L 的步驟（1)制備的上游引物和下游引物各IUL，步驟（2)提取的模板DNA50~100ng，水補 余； (4)PCR擴增：在步驟（3)的條件下，依次進行預(yù)變性95°C、4min，變性94°C、45s，退火、 豬特異性引物60°C、30s，延伸72°C、60s，連續(xù)進行35個循環(huán)，最后延伸72°C、7min，得到模 板DNA即mtDNA的16SrRNA基因片段； (5) 擴增產(chǎn)物檢測：將步驟（4)豬特異性引物擴增mtDNA得到的16SrRNA基因片段， 用質(zhì)量分數(shù)1. 5%的瓊脂糖電泳檢測，將擴增后得到的基因片段進行序列測定，并根據(jù)測序 結(jié)果進行同源性匹配判斷。
[0006] 其中，所述 12. 5uL的PCRMix包括PCR緩沖液 10UL，2. 5mmol/L的dNTPs 2. 0UL，5U/UL的Taq酶 0? 5UL。
[0007] -種安全快速鑒定食品中豬源性成分的檢測試劑盒，包括特異性引物、DNA提取試 劑、PCRMix以及水，所述的四種物質(zhì)混合后即得到PCR反應(yīng)體系混合液的總體積為25uL， 其中，所述特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物各IuL;所述DNA提 取試劑包括A溶液、B溶液、C溶液、D溶液、E溶液五部分，每克檢測樣本需Iml的A溶液； 所述PCRMix的用量為12. 5ul;水補余。
[0008] 所述PCR反應(yīng)體系混合液中PCR Mix為總混合液體積的0. 5倍；上游引物和下游 引物各為混合液總體積的1/25, ；DNA總量為50-100ng ;如果上述成分體積加起來不足總體 積，不足的部分用水補足即可。
[0009] 另外，所述檢測試劑盒中還可以含有瓊脂糖，用于檢測樣本在提取模板DNA后來 進行瓊脂糖電泳檢測，以及特異性引物擴增模板DNA既mtDNA得到的16SrRNA基因片段進 行瓊脂糖電泳檢測，所述瓊脂糖每次檢測用量為3克。
[0010] 其中，所述的上游引物和下游引物的序列如下： 上游引物F: 5-ATGAAACAITGGAGTAGTCCTACTAITTACC-3， 下游引物R: 5-CTACGAGGTCTGITCCGATATAAGG-3 ; 所述DNA提取試劑的構(gòu)成包括A溶液、B溶液、C溶液、D溶液、E溶液五部分；其中， A溶液：200 U g/ml的蛋白酶K ;10mmol/L的pH8.0的Tris - Cl ;0? lmol/L的pH8.0的EDTA ;質(zhì)量分數(shù)0.5%的SDS ;20 ii g/ml的RNase A ;用量為每克樣本加入Iml ; B溶液：平衡酚，并用0. 5mmol/L的Tris-Cl飽和，pH8. 0 ;用量為A溶液體積的0. 5 倍； C溶液：氯仿/異戊醇，體積比為24 : 1 ; D溶液：冷無水乙醇AR; E溶液：TE緩沖液，lOmmol/L的Tris-Cl、lmol/L的pH8. 0 的EDTA; 所述PCRMix包括PCR緩沖液 10UL，2. 5mmol/L的dNTPs2. 0UL，5U/UL的Taq酶 0. 5uL； 所述瓊脂糖粉即瓊脂糖ME。
[0011] 上述檢測試劑盒的使用方法如下： (一)、DNA提取試劑的使用： (1) 將待檢測樣本剪碎，每克樣本加入Iml的A溶液，渦旋振蕩30秒后，室溫放置5分 鐘，并12000rpm離心3分鐘，取上清液； (2) 將步驟（1)得到的上清液加入B溶液，顛倒混勻，12000rpm離心3分鐘，取上清液； (3) 將步驟（2)得到的上清液加入等體積的C溶液，顛倒混勻，12000rpm離心3分鐘， 取上清液； (4) 將步驟（3)得到的上清液加入Iml溶液D，顛倒混勻，12000rpm離心3分鐘，棄去上 清后，剩余加入E溶液即可得到基因組DNA溶液即模板DNA; (二)、將PCRMix用移液器吸取12. 5ul，將上游引物和下游引物各用移液器吸取lul，以 及步驟(一）制備的模板DNA50~lOOng，混合，水補余，得到PCR反應(yīng)體系混合液25uL; (三）PCR擴增：將步驟(二）的PCR反應(yīng)體系混合液，依次進行預(yù)變性95 °C、4min，變 性94°C、45s，退火、豬特異性引物60°C、30s，延伸72°C、60s，連續(xù)進行35個循環(huán)，最后延伸 72°C、7min，得到mtDNA的 16SrRNA基因片段； (四)擴增產(chǎn)物檢測：將步驟(三)特異性引物擴增mtDNA得到的16SrRNA基因片段，進 行序列測定，并根據(jù)測序結(jié)果進行同源性匹配判斷。
[0012] 另外，所述步驟(一）得到的模板DNA還可以用瓊脂糖電泳檢測；所述步驟（四）得 至_特異性引物擴增模板DNA即mtDNA得到的16SrRNA基因片段可以用瓊脂糖電泳進行 檢測，所述瓊脂糖每次檢測用量為3克。瓊脂糖每次用量天平稱取3克，加入30ml水，用微 波爐煮沸熔解后，倒入制膠器即可。
[0013]本發(fā)明通過豬特異性引物檢測時，含豬源性成分的樣本可檢出豬特異性陽性條 帶，即可判定為此肉制品中含有豬源性成分。為了驗證結(jié)果的可靠性，可進一步進行測序和 同源性查詢比較，若樣本16SrRNA基因序列與豬同源性達到95%以上，可確認上述判定。
[0014]本發(fā)明能夠簡單有效、迅速的實現(xiàn)對各類肉制品中含有的豬源性成分進行準確鑒 定，通過本發(fā)明的引物及反應(yīng)體系，運用瓊脂糖電泳檢測能準確檢測各制品中的豬源性成 分；檢出率99. 7%，最低檢出限lug/kg，一次能夠處理48個樣本，完成檢測只需4個小時，檢 測的速度和準確度也大大提高，為快速檢測鑒定豬源性成分提供了技術(shù)保障。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點在于：結(jié)果準確、靈敏度高，能快速檢測食品中所含的豬肉成分，不 但杜絕了以豬肉冒充牛、羊肉、以假充真、摻雜使假的違法行為，也對新疆、寧夏和其周邊的 中亞地區(qū)等少數(shù)民族聚居區(qū)清真食品的食用安全提供了保障，也為我國社會的穩(wěn)定提供了 可靠的技術(shù)支持。
[0016] 下面結(jié)合附圖和實施對本發(fā)明作進一步說明。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明實施例3模板DNA的瓊脂糖電泳圖； 圖2為本發(fā)明實施例3擴增后16SrRNA基因片段的瓊脂糖電泳圖。
【具體實施方式】
[0018] 以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用 于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0019] 除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分數(shù)均為重量百分數(shù)。
[0020] 實施例1 一種安全快速鑒定食品中豬源性成分的檢測方法，具體包括以下步驟： (1)設(shè)計引物：設(shè)計只能擴增豬線粒體DNA的豬特異性引物，所述特異性引物包括上游 引物和下游引物兩種，其序列如下： 上游引物F:5-ATGAAACAITGGAGTAGTCCTACTAITTACC-3 ; 下游引物R:5-CTACGAGGTCTGITCCGATATAAGG-3 ; (2) 模板DNA提?。翰捎梅?氯仿法提取模板DNA，并于質(zhì)量分數(shù)0. 8%的瓊脂糖電泳進 行檢測，提取的模板DNA于-20°C備存； (3) PCR擴增引物及反應(yīng)體系：反應(yīng)總體系25uL，包括12. 5uL的PCRMix，2. 5pmol/L 的步驟（1)制備的上游引物和下游引物各IUL，步驟（2)提取的模板DNA50~100ng，水補 余； (4)PCR擴增：在步驟（3)的條件下，依次進行預(yù)變性95°C、4min，變性94°C、45s，退火、 豬特異性引物60°C、30s，延伸72°C、60s，連續(xù)進行35個循環(huán)，最后延伸72°C、7min，得到模 板DNA即mtDNA的16SrRNA基因片段； (5) 擴增產(chǎn)物檢測：將步驟（4)豬特異性引物擴增mtDNA得到的16SrRNA基因片段， 用質(zhì)量分數(shù)1. 5%的瓊脂糖電泳檢測，將擴增后得到的基因片段進行序列測定，并根據(jù)測序 結(jié)果進行同源性匹配判斷。
[0021] 其中，所述 12. 5uL的PCRMix包括PCR緩沖液 10UL，2. 5mmo