用于擴(kuò)增斑潛蠅屬昆蟲線粒體基因組長片段的通用引物組的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于擴(kuò)增覆蓋斑潛蠅屬昆蟲線粒體全基因組的長片段的通用引物組，該引物組由兩對引物組成，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。采用本發(fā)明的擴(kuò)增引物，可以有效地擴(kuò)增出多種斑潛蠅屬物種線粒體基因組的長片段，有助于縮短獲取分子數(shù)據(jù)的周期，為斑潛蠅屬昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育研究及分子鑒定特異性引物位點(diǎn)選擇提供了重要工具。
【專利說明】
用于擴(kuò)増斑潛蠅屬昆蟲線粒體基因組長片段的通用引物組
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及兩對用于擴(kuò)增斑潛蠅屬昆蟲線粒體基因組長片段的通用引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 斑潛繩屬（Liriomyza Mik)隸屬于雙翅目（Diptera)，潛繩科(Agromyzidae)，植潛 繩亞科(Phtomyzinae)，是一類危害蔬菜、花丼的世界性害蟲。斑潛繩寄主范圍廣，成、幼蟲 均可對作物造成危害，幼蟲潛食寄主植物葉片或葉柄，嚴(yán)重影響寄主植物的光合作用，導(dǎo)致 寄主植物落葉、落花，發(fā)育延遲并枯死，成蟲在葉片上取食、產(chǎn)卵，植物受害傷口還為病菌入 侵提供了途徑。根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)記載和各地普查的情況統(tǒng)計，目前該屬有19種害蟲在我國 有分布(包括我國臺灣和香港特別行政區(qū)），包括全世界最危險、發(fā)生最嚴(yán)重的四種典型的 多食性斑潛繩：美洲斑潛繩（L. sativae Blanchard) (1938)、三葉斑潛繩（L. trifoli i Burgess) (1880)和南美斑潛繩（L.huidobrensis Blanchard) (1926)，以及番前斑潛繩 (L.bryoniae Kaltenbach)(1858)〇
[0003] 斑潛蠅屬內(nèi)各種昆蟲之間大部分在外形上非常相似，僅從形態(tài)學(xué)上難以區(qū)分，為 準(zhǔn)確防治帶來困難。因此利用長片段擴(kuò)增技術(shù)測定并分析斑潛蠅屬的線粒體基因組特征， 希望從分子水平深入全面的挖掘斑潛蠅的遺傳信息，并為斑潛蠅屬近緣種的鑒定和種群分 化研究及進(jìn)一步準(zhǔn)確有效的控制其危害提供科學(xué)依據(jù)。
[0004] 近年來，隨著分子技術(shù)和高通量技術(shù)的快速發(fā)展，線粒體基因組已成為區(qū)分物種 和研究物種進(jìn)化關(guān)系的熱點(diǎn)研究對象。因此，利用線粒體基因組對斑潛蠅屬昆蟲進(jìn)行系統(tǒng) 發(fā)育分析是一種較好的方法。目前，昆蟲遺傳研究過程中，小規(guī)模線粒體基因組研究的主流 方法仍然是傳統(tǒng)的基于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的引物步移法。該方法使用的引物數(shù)量較多、擴(kuò)增效率 低、對模板純度要求高、耗時長，并且缺少足夠的特異性，這將阻礙昆蟲線粒體基因組分子 數(shù)據(jù)的快速積累。而基于長PCR方法不僅能保證得到足夠的線粒體全基因組數(shù)量，而且排除 了核中線粒體假基因的干擾。長PCR擴(kuò)增的難度隨擴(kuò)增片段長度增加而增加，一次性擴(kuò)增 16kb的片段難度很大，最有效的方法是將全線粒體基因組分為2-3個相互重疊的長片段進(jìn) 行擴(kuò)增，近年來迅速應(yīng)用于動物的線粒體測序工作。目前國際上沒有專門針對擴(kuò)增斑潛蠅 屬昆蟲線粒體基因組長片段的通用引物的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種斑潛蠅屬昆蟲線粒體基因組長片段擴(kuò)增的通用引物組，它 能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。
[0006] 本發(fā)明用于擴(kuò)增斑潛蠅屬昆蟲線粒體基因組長片段的通用引物組，由兩對用引物 組成，其序列如SEQIDN0.1~SEQIDN0.4所示。
[0007] 本發(fā)明還公開了一種斑潛蠅屬昆蟲線粒體基因組長片段的擴(kuò)增方法，是采用上述 的引物，用25μ1 PCR體系在特定PCR擴(kuò)增條件下進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增。
[0008] 所述的25μ1 PCR體系是：5.8yL MiliQ H2〇,2.5yL添加 Mg2+的10Xbuffer，3.0uL dNTPs，2.5yL MgCl2,3.0yL上游引物，3.0yL下游引物，0.2yL TaKaRa LA Taq酶，5.0yL DNA 模板。
[0009] 所述的PCR擴(kuò)增條件是：93°C預(yù)變性2min;92°C變性10s，54°C退火30s，68°C延伸 8min，擴(kuò)增20個循環(huán);之后92°C變性10s，54°C退火30s，68°C延伸8min，且每一循環(huán)增加20s， 擴(kuò)增20個循環(huán);最后68°C延伸7min。
[0010] 本發(fā)明根據(jù)昆蟲綱昆蟲的線粒體基因組存在保守區(qū)域的特性，通過比對Genbank 中不同目昆蟲的線粒體基因組序列設(shè)計出擴(kuò)增引物。采用本發(fā)明的斑潛蠅屬線粒體基因組 長片段擴(kuò)增引物，可以有效地擴(kuò)增出斑潛蠅屬不同種物種的長片段序列，填補(bǔ)了斑潛蠅屬 長片段沒有通用的擴(kuò)增引物的空白，對斑潛蠅屬不同種的昆蟲進(jìn)行大規(guī)模的長片段測序， 將產(chǎn)物直接進(jìn)行高通量測序或者通過Sub-PCR擴(kuò)增，能有效縮短分子數(shù)據(jù)的獲取周期，為我 國斑潛蠅屬昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育和種群遺傳結(jié)構(gòu)研究提供了重要工具。本發(fā)明涉及的擴(kuò)增引物 較過去傳統(tǒng)方法有較大的優(yōu)勢，具體表現(xiàn)為:本引物能有效擴(kuò)增出總長近16000bp的長片 段，完全覆蓋線粒體基因組全長，而過去的傳統(tǒng)方法有效擴(kuò)增長度一般為l〇〇〇bp左右，且擴(kuò) 增效率低，不利于上述研究的數(shù)據(jù)分析。利用本引物對斑潛蠅屬昆蟲進(jìn)行大規(guī)模的系統(tǒng)發(fā) 育進(jìn)化分析，能顯著降低實(shí)驗(yàn)成本，縮短實(shí)驗(yàn)周期，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0011] 圖1是本發(fā)明引物在擴(kuò)增斑潛蠅屬4種昆蟲線粒體長片段的引物覆蓋圖。
[0012] 圖2是本發(fā)明引物對斑潛蠅屬4種昆蟲線粒體長片段的擴(kuò)增效果圖。1-2為三葉斑 潛蠅;3-4為美洲斑潛蠅;5-6為南美斑潛蠅;7-8為番茄斑潛蠅;Μ為Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明的斑潛蠅屬線粒體基因組長片段的擴(kuò)增引物篩選方法共分兩個步驟：1.據(jù) 弓丨物設(shè)計原則，通過對已測出的六足總綱動物mtDNA序列的比對，盡量在保守區(qū)域進(jìn)行引物 的設(shè)計，同時考慮引入簡并位點(diǎn)增加引物通用性，最終設(shè)計2對長PCR引物，通過長PCR分別 擴(kuò)增2條相互重疊并覆蓋全線粒體基因組的大片段;2.將合成的引物對斑潛蠅屬昆蟲線粒 體基因組進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其在斑潛蠅屬中的通用性和擴(kuò)增效率。
[0014] 下面結(jié)合實(shí)例對發(fā)明做進(jìn)一步說明：
[0015] 1.樣品準(zhǔn)備:樣品均使用存放于揚(yáng)州大學(xué)應(yīng)用昆蟲研究所標(biāo)本室內(nèi)存放于100% 酒精的斑潛蠅屬不同種的昆蟲，包括三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、番茄斑潛蠅等 不同種斑潛蠅屬昆蟲。
[0016] 2. DNA提取:Axygen試劑盒提取DNA，具體步驟參照說明書。
[0017] 3 .數(shù)據(jù)來源：數(shù)據(jù)來源于美國國立生物技術(shù)信息中心（NCB I，h 11 p : / www.ncbi.nlm.gov/)。
[0018] 4.序列比對:利用ClustalX軟件將不同目昆蟲的線粒體基因組全序列進(jìn)行比對， 找出比較保守、堿基變異度最小的序列區(qū)域。
[0019] 5.引物合成：根據(jù)上述的比對結(jié)果，利用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5在堿基 變異度最小的序列區(qū)域設(shè)計出2對引物。引物序列為
[0021] 6.引物擴(kuò)增:將上述擴(kuò)增引物分別應(yīng)用于PCR擴(kuò)增所采集的樣本。
[0022] 7.擴(kuò)增結(jié)果檢測：擴(kuò)增引物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，該引物 可以有效地擴(kuò)增斑潛蠅屬昆蟲的線粒體長片段。利用這2對引物擴(kuò)增出的DNA片段總長度約 為16000bp，覆蓋斑潛蠅屬昆蟲線粒體基因組（圖1)，且瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶較為單一 (圖2)。本發(fā)明引物可以有效地擴(kuò)增出斑潛蠅屬不同種的線粒體基因組長片段，且測序結(jié)果 較準(zhǔn)確。
[0023] 8.引物擴(kuò)增條件：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于擴(kuò)增斑潛蠅屬昆蟲線粒體全基因組長片段的通用引物組，其特征在于，由兩對 引物組成，其序列如SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO.4所示。2. -種斑潛蠅屬昆蟲線粒體全基因組序列的擴(kuò)增方法，其特征是采用權(quán)利要求1所述 的引物組，用25μ1 PCR體系在PCR擴(kuò)增條件下進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的25μ1 PCR體系是:5.8yL MiliQ Η20,2.5 yL添加 Mg2+的 10 X buffer，3 · OuL dNTPs，2 · 5yL MgCl2，3 · OyL上游引物，3 · OyL下游引物，0 · 2 yL TaKaRa LA Taq酶，5 .OyL DNA模板。4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增條件是:93 °C預(yù)變性2min; 92 °C 變性1〇8,54°(：退火3〇8,68°(：延伸81^11，擴(kuò)增20個循環(huán)；之后92°(：變性1〇8,54°(：退火3〇8,68 °C延伸8min，且每一循環(huán)增加20s，擴(kuò)增20個循環(huán);最后68 °C延伸7min。
【文檔編號】C12N15/10GK105950618SQ201610539895
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月8日
【發(fā)明人】杜予州, 常亞文
【申請人】揚(yáng)州大學(xué)