專(zhuān)利名稱(chēng)：一種時(shí)間分辨熒光法綜合檢測(cè)乳腺癌試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物和醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)綜合檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)CA125、CEA、CA153的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)試劑盒，同時(shí)還涉及該試劑盒在綜合檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺癌發(fā)病年齡分布在東西方國(guó)家有所不同，在高發(fā)區(qū)如北歐、北美等國(guó)家，乳腺癌從20歲左右開(kāi)始出現(xiàn)，在絕經(jīng)期即45-50歲之前保持快速上升勢(shì)頭，大約年齡每增長(zhǎng)10-20歲發(fā)病率上升I倍，絕經(jīng)期后上升相對(duì)緩慢，75-85歲達(dá)到最高。而在亞洲等低發(fā)地區(qū)，乳腺癌的發(fā)病率在絕經(jīng)后會(huì)略下降，一般乳腺癌的發(fā)病高峰在45-55歲之間，亞洲人移居西方國(guó)家后仍保持這種年齡分布特征。早期發(fā)現(xiàn)、確診乳腺癌，實(shí)施手術(shù)切除，依然是目前該疾病最有效的治療方法。因此，在早期、更加準(zhǔn)確的確診乳腺癌依然是治療該疾病的關(guān)鍵。目前，診斷乳腺癌的常用檢測(cè)指標(biāo)有CA125、CEA、CA153等幾種。在實(shí)際診斷乳腺癌時(shí)，一般是用CA125、CEA、CA153三種指標(biāo)綜合確診乳腺癌，因?yàn)槿?xiàng)指標(biāo)綜合分析在特異性和敏感度上明顯高于單一指標(biāo)。目前常規(guī)實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)療單位用于檢測(cè)該三項(xiàng)指標(biāo)通常分別采用單一試劑盒，即一個(gè)試劑盒針對(duì)一種腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，此種方式存在的缺點(diǎn)是:1、檢測(cè)步驟繁多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；2、幾種標(biāo)記物分別采用幾種單指標(biāo)試劑盒檢測(cè)，由于不同生產(chǎn)廠(chǎng)家的試劑盒存在差異，且同一廠(chǎng)家的不同試劑盒由于檢測(cè)的標(biāo)記物不同可能會(huì)存在控制條件、參數(shù)的差異而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果存在誤差，此種誤差在綜合分析三種標(biāo)記物的特異性和敏感性上會(huì)產(chǎn)生較大的影響，可能導(dǎo)致判斷結(jié)果相差甚遠(yuǎn)。因此，開(kāi)發(fā)一種能夠在相對(duì)同一的檢測(cè)條件下同時(shí)能夠檢測(cè)該三種腫瘤標(biāo)記物的試劑盒，就能降低由于人為原因造成的檢測(cè)誤差，大大提高綜合分析檢測(cè)結(jié)果的特異性和敏感性，為下一步的研究或判斷做出準(zhǔn)確的結(jié)論提供更充分的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供一種在同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)綜合檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)CA125、CEA、CA153的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的目的還在于提供一種該試劑盒的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種時(shí)間分辨熒光法綜合檢測(cè)乳腺癌試劑盒，把三種乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA> CA153綜合在同一微孔的同一反應(yīng)體系內(nèi)，采用時(shí)間分辨熒光免疫法檢測(cè)，該試劑盒包括:分別抗CA125、CEA、CA153第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板；用Eu3+標(biāo)記的抗CA125、Tb3+標(biāo)記的抗CEA、Sm3+標(biāo)記的抗CA153第二株單克隆抗體混合抗體；分析緩沖液；共用熒光增強(qiáng)劑；洗滌液；質(zhì)控品。所述的第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板的制備方法為:把分別抗CA125、CEA、CA153第一株單克隆抗體混合抗體用包被緩沖液稀釋?zhuān)频每贵w包被液，然后向微孔板的每個(gè)孔中分別加入ΙΟΟμ I的所述抗體包被液，于37°C包被2小時(shí)，然后用生理鹽水沖洗微孔板三次，然后再向微孔板的每個(gè)孔中分別加入200μ I的封板液，于室溫封閉2小時(shí)，然后用生理鹽水沖洗微孔板兩次，冷凍干燥，制得第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板。其中，所述抗體包被液中，分別抗CA125、CEA、CA153的第一株單克隆抗體的濃度均為 0.009 0.014g/L。所述用Eu3+標(biāo)記的抗CA125、Tb3+標(biāo)記的抗CEA、Sm3+標(biāo)記的抗CA153第二株單克隆抗體混合抗體中，用Eu3+標(biāo)記的抗CA125抗體、Tb3+標(biāo)記的抗CEA抗體、Sm3+標(biāo)記的抗CA153抗體的質(zhì)量配比為:Eu3+標(biāo)記的抗CA125抗體:Tb3+標(biāo)記的抗CEA抗體:Sm3+標(biāo)記的抗CA153抗體=(7 13): (6 11): (6.5 13)。分析緩沖液的制備方法為:向每升濃度為0.05mol/L、pH值為8.0的Tris-Hcl緩沖液中加入9g NaCU0.5g NaN3UOg BSA、0.1ml吐溫_40、5g聚乙二醇，混合均勻，即制得分析緩沖液。所述共用熒光增強(qiáng)劑的制備方法為:解離部分:將70 200 μ mol的PTA、2 7 μ mol的氧化乾、0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合,用水定容至I升,用乙酸調(diào)pH值至3.5，制得解離部分；增強(qiáng)部分:將0.1 0.4mmol的鄰菲羅啉和0.2mol的Tris混合，用水定容至1L，制得增強(qiáng)部分。所述洗滌液的制備方法為:在濃度為0.01mol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中加入吐溫-20，混勻，制得吐溫-20質(zhì)量百分比濃度為0.05%的PBS溶液，然后用質(zhì)量百分比濃度為0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得洗滌液。所述質(zhì)控品為CA125、CEA、CA153標(biāo)準(zhǔn)品的混合物。一種時(shí)間分辨熒光法綜合檢測(cè)乳腺癌試劑盒在綜合檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153 中的應(yīng)用。所述的試劑盒在綜合檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153中的應(yīng)用，包括以下步驟:(I)用分析緩沖液稀釋質(zhì)控品，制成具有系列濃度梯度包含有CA125、CEA、CA153標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液；(2)將待測(cè)樣品與步驟(I)制備的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液分別加入抗CA125、CEA、CA153第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板的不同孔中，然后再向孔中加入能分別與CA125、CEA、CA153結(jié)合的標(biāo)記有稀土離子螯合物的第二株單克隆抗體混合抗體，之后加入共用熒光增強(qiáng)劑，進(jìn)行時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)，得到發(fā)光值；(3)根據(jù)測(cè)定的具有系列濃度梯度的包含CA125、CEA、CA153標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液的發(fā)光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；(4)以測(cè)定的待測(cè)樣品中的CA125、CEA、CA153發(fā)光值和標(biāo)準(zhǔn)品中CA125、CEA、CA153各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的發(fā)光值做比較，得出待測(cè)樣品中CA125、CEA、CA153各自的含量。所述待測(cè)樣品為人體血清。進(jìn)一步的，所述包被緩沖液的制備方法為:取濃度為0.05mol/L、pH值為8.5的碳酸鹽緩沖液，然后用質(zhì)量百分比濃度為0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得包被緩沖液。所述封板液的制備方法為:向濃度為0.02mol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中加入BSA,配制成BSA質(zhì)量百分比濃度為1%的BSA的PBS緩沖液，然后用質(zhì)量百分比濃度為0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得封板液。本發(fā)明提供的試劑盒，采用時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)同時(shí)綜合檢測(cè)三項(xiàng)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153的目的。時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)是一種以稀土離子為標(biāo)記物，根據(jù)稀土離子螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)定特異性熒光的技術(shù)方法。TRFIA利用稀土離子的激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)不同，同時(shí)發(fā)射光具有長(zhǎng)的衰減時(shí)間，這樣可以有效的排除非特異性熒光的干擾，具有線(xiàn)性范圍寬、靈敏度高和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，另外，可以利用不同的稀土離子的不同的發(fā)射光波長(zhǎng)和不同的衰減時(shí)間，實(shí)現(xiàn)同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)標(biāo)志物，這樣和單個(gè)指標(biāo)分開(kāi)檢測(cè)相比可以節(jié)約時(shí)間、人員、試劑等，這些特點(diǎn)正好適合本發(fā)明的同時(shí)在同一反應(yīng)體系內(nèi)檢測(cè)多指標(biāo)。本發(fā)明提供的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)試劑盒，具有非常好的線(xiàn)性范圍，檢測(cè)CA125的線(xiàn)性范圍為25U/ml 660U/ml，檢測(cè)限為IOU/ml ;檢測(cè)CEA的線(xiàn)性范圍為3ng/ml 580ng/ml，檢測(cè)限為lng/ml ;檢測(cè)CA153的線(xiàn)性范圍為20U/ml 300U/ml，檢測(cè)限為5U/ml。各檢測(cè)指標(biāo)的正常參考值分別為:CA125為O 35U/ml ；CEA為O 6.5ng/ml ；CA153為O 30U/ml。本發(fā)明提供的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)試劑盒可用于乳腺癌的臨床輔助診斷、療效觀(guān)察及預(yù)后判斷，對(duì)乳腺癌腫瘤的治療和預(yù)防具有重要意義。采用本發(fā)明提供的試劑盒可實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)綜合檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)CA125、CEA、CA153，檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，步驟少，所需時(shí)間短，方便快捷；檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，避免了現(xiàn)有的采用三種單項(xiàng)試劑盒分別檢測(cè)指標(biāo)CA125、CEA、CA153，再進(jìn)行綜合判斷而引起的判斷誤差，大大提高了檢測(cè)結(jié)果的特異性和敏感性，為下一步的研究或判斷做出準(zhǔn)確的結(jié)論提供了可靠依據(jù)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒同一微孔內(nèi)同一反應(yīng)體系反應(yīng)原理不意圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒與羅氏公司的單指標(biāo)試劑盒測(cè)試CA125相關(guān)回歸分析圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒與Abbott公司的單指標(biāo)試劑盒測(cè)試CEA相關(guān)回歸分析圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒與北京熱景生物公司的單指標(biāo)試劑盒測(cè)試CA153相關(guān)回歸分析圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1本實(shí)施例提供的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)試劑盒，包括:抗CA125的抗體M32112M、抗CEA的抗體MAM02-008、抗CA153的抗體ab28081三種單克隆抗體組成的混合抗體包被的微孔板；用Eu3+標(biāo)記的M86306M抗體(抗CA125的抗體)、用Tb3+標(biāo)記的MAM02-881抗體(抗CEA的抗體)、用Sm3+標(biāo)記的ab70475抗體(抗CA153的抗體)三種單克隆抗體組成的混合抗體；分析緩沖液；共用熒光增強(qiáng)劑；洗滌液；CA125、CEA、CA153三種標(biāo)準(zhǔn)品混合組成的質(zhì)控品。該試劑盒還包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、底物等其它相關(guān)試劑。所述試劑盒中，抗體ab28081、抗體ab70475購(gòu)自abeam公司；抗體M32112M、抗體M86306M 和抗體 MAM02-008、抗體 MAM02-881 均購(gòu)自 Meridian 公司。M32112M、MAM02-008、ab28081混合抗體包被的微孔板的制備方法為:把混合抗體用包被緩沖液稀釋?zhuān)频没旌峡贵w包被液，混合抗體包被液中，分別抗CA125、CEA、CA153的第一株單克隆抗體的濃度均為0.010g/L,即混合抗體包被液中，抗體M32112M、MAM02-008、ab28081的濃度均為0.010g/L，然后向微孔板的每個(gè)孔中分別加入100 μ I的混合抗體包被液，于37°C包被2小時(shí)，然后用生理鹽水沖洗微孔板三次，然后再向微孔板的每個(gè)孔中分別加入200 μ I的封板液,于室溫封閉2小時(shí),然后用生理鹽水沖洗微孔板兩次,冷凍干燥,制得混合抗體包被的微孔板，密封于鋁箔袋中，4°C保存?zhèn)溆?。其中，包被緩沖液的制備方法為:取濃度為0.05mol/L、pH值為8.5的碳酸鹽緩沖液，然后用質(zhì)量百分比濃度為0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得包被緩沖液。封板液的制備方法為:向濃度為0.02mol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中加入BSA，配制成BSA質(zhì)量百分比濃度為1%的BSA的PBS緩沖液，然后用質(zhì)量百分比濃度為0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得封板液。用Eu3+標(biāo)記的M86306M抗體、用Tb3+標(biāo)記的MAM02-881抗體、用Sm3+標(biāo)記的ab70475抗體三種單克隆抗體組成的混合抗體的制備方法為:將Eu3+標(biāo)記的M86306M抗體、Tb3+標(biāo)記的MAM02-881抗體、Sm3+標(biāo)記的ab70475抗體以質(zhì)量比:Eu3+標(biāo)記的M86306M抗體:Tb3+標(biāo)記的MAM02-881抗體:Sm3+標(biāo)記的ab70475抗體=10:8:11混合，制得混合抗體。其中用Eu3+標(biāo)記的M86306M抗體、用Tb3+標(biāo)記的MAM02-881抗體、用Sm3+標(biāo)記的ab70475抗體的制備方法為:每種抗體的標(biāo)記流程步驟相同，只是分別抗CA125、CEA、CA153的抗體分別對(duì)應(yīng)的稀土離子螯合物標(biāo)記物為N1-對(duì)異硫氰酸芐基-DTTA-Eu、N1-對(duì)異硫氰酸芐基-DTTA-Tb、Nl-對(duì)異硫氰酸芐基-DTTA-Sm。下面以N1-對(duì)異硫氰酸芐基-DTTA-Eu標(biāo)記的M86306M抗體為例，其標(biāo)記的具體制備方法和步驟為:(I)標(biāo)記前應(yīng)用截留分子量為50kDa的離心柱對(duì)M86306M抗體進(jìn)行標(biāo)記前純化處理，具體步驟如下:懸空加入Img M86306M抗體于50kDa的離心柱中，9000rpm離心8分鐘，棄掉濾液；往離心柱中加入200 μ I標(biāo)記緩沖液，9000rpm離心8分鐘，棄掉濾液，該步驟重復(fù)四次，最后一次將離心管取出，棄掉濾液；往離心柱中加入50 μ I標(biāo)記緩沖液，讓其靜置I分鐘，然后將離心柱的濾膜反轉(zhuǎn)裝入離心管中，SOOOrpm離心6分鐘，收集濾液，即得到待標(biāo)記的Μ86306Μ抗體；其中，標(biāo)記緩沖液為50mmol/L、pH值為9.0的碳酸鹽緩沖液；(2)稱(chēng)取稀土離子螯合物標(biāo)記物N1-對(duì)異硫氰酸芐基-DTTA-Eu 0.2mg，W；V80yl超純水進(jìn)行溶解，制成螯合試劑；將螯合試劑加入到盛有待標(biāo)記抗體M86306M的EP管中，混合均勻；置于搖床上4°C過(guò)夜，制得標(biāo)記好的抗體M86306M，即用Eu3+標(biāo)記的M86306M抗體；用三倍柱體積的PBS緩沖液作為柱平衡液平衡Superdex 2001 X 30cm柱，用移液器吸取用Eu3+標(biāo)記的M86306M抗體緩慢上樣，用洗脫液進(jìn)行洗脫，流速控制在lml/min，蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)到蛋白峰收集樣品，將收集的目的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)0.22 μ m濾膜除菌；用比活度測(cè)定方法對(duì)標(biāo)記抗體進(jìn)行標(biāo)記率的計(jì)算與分析。長(zhǎng)期儲(chǔ)存標(biāo)記抗體可以將高純度的BSA加入到標(biāo)記抗體溶液中，BSA的終濃度為0.1%，可置于4°C或_20°C進(jìn)行保存。分析緩沖液的制備方法為:向每升濃度為0.05mol/L、pH值為8.0的Tris-Hcl緩沖液中加入9g NaCU0.5g NaN3UOg BSA、0.1ml吐溫_40、5g聚乙二醇，混合均勻，即制得分析緩沖液。共用熒光增強(qiáng)劑的制備方法為:解離部分:將100 μ mol的ΡΤΑ、7 μ mol的氧化釔、
0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合,用水定容至I升,用乙酸調(diào)pH值至3.5,制得解離部分；增強(qiáng)部分:將0.1mmol的鄰菲羅啉和0.2mol的Tris混合,用水定容至I升，制得增強(qiáng)部分。洗滌液的制備方法為:在濃度為0.0lmol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中加入吐溫-20，混勻，制得吐溫-20質(zhì)量百分比濃度為0.05%的PBS溶液，然后用質(zhì)量百分比濃度為
0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得洗滌液。質(zhì)控品為CA125、CEA、CA153標(biāo)準(zhǔn)品的混合物。CA125、CEA購(gòu)自Abnova公司，CA153購(gòu)自abeam公司。實(shí)施例2本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒在綜合檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153中的應(yīng)用，即采用本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒，同時(shí)綜合檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)方法，其反應(yīng)原理如圖1所示，采用雙抗體夾心法，包括以下步驟:(I)用分析緩沖液稀釋CA125、CEA、CA153蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合物，即質(zhì)控品，制成具有系列濃度梯度包含有CA125、CEA、CA153蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液；(2)分別取100μ I待測(cè)樣品人體血清和步驟(I)制備的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，力口入抗體Μ32112Μ、抗體ΜΑΜ02-008、抗體ab28081三種單克隆抗體組成的混合抗體包被的微孔板的不同孔中，37°C溫育I小時(shí)，三次洗滌(洗滌時(shí)所用洗滌液的配制方法為:每升PBS緩沖液中加入9g氯化鈉、0.5ml吐溫-20，搖勻，即可)，之后加入100μ I混合標(biāo)記抗體工作液(用分析緩沖液以體積比1:3000稀釋混合標(biāo)記抗體儲(chǔ)存液，制得混合標(biāo)記抗體工作液，每100 μ I該混合標(biāo)記抗體工作液中含有Eu3+標(biāo)記的Μ86306Μ抗體100ng、Tb3+標(biāo)記的MAM02-881抗體80ng、Sm3+標(biāo)記的ab70475抗體llOng，其余為分析緩沖液)，震蕩均勻，37°C溫育I小時(shí)，用洗滌液洗5次，在吸水紙上控干，加入200 μ I共用熒光增強(qiáng)劑的解離部分，震蕩5分鐘，加入20 μ I共用熒光增強(qiáng)劑的增強(qiáng)部分，震蕩8分鐘，在時(shí)間分辨熒光儀上測(cè)量熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)為315nm ;647nm、612nm、544nm分別為Sm3+、Eu3+、Tb3+的最強(qiáng)的發(fā)射光峰；500微秒、200微秒、50微秒分別為Eu3+、Tb3+、Sm3+的延遲時(shí)間；分別測(cè)量各自的發(fā)光值。把不同濃度的CA125、CEA、CA153蛋白混合標(biāo)準(zhǔn)品中各指標(biāo)分別和各自的發(fā)光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到不同指標(biāo)的各自標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，待測(cè)樣品人體血清的濃度按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得出。得到試劑盒的精密度:CA125分析內(nèi)和分析間的變異系數(shù)分別為3.9% 5.8%、5.1% 7.8% ；CEA分析內(nèi)和分析間的變異系數(shù)分別為3.9% 5.9%、4.7% 8.3% ；CA153分析內(nèi)和分析間的變異系數(shù)分別為4.4% 6.5%、6.0% 8.9%。實(shí)施例3用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)40份血清樣本得到的CA125、CEA、CA153三個(gè)指標(biāo)的數(shù)值和用同樣的40份血清樣本分別用羅氏公司的單指標(biāo)試劑盒測(cè)試CA125、Abbott公司的單指標(biāo)試劑盒測(cè)試CEA、北京熱景生物公司的單指標(biāo)試劑盒測(cè)試CA153所得到的數(shù)據(jù)分別做回歸相關(guān)性分析，分別對(duì)應(yīng)附圖2、3、4，從附圖可以看出，本發(fā)明試劑盒測(cè)試得到的各指標(biāo)數(shù)據(jù)和分別用單指標(biāo)試劑盒測(cè)試得到的數(shù)據(jù)具有很好的相關(guān)性。
權(quán)利要求
1.一種時(shí)間分辨熒光法綜合檢測(cè)乳腺癌試劑盒，把三種乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153綜合在同一微孔的同一反應(yīng)體系內(nèi)，采用時(shí)間分辨熒光免疫法檢測(cè)，其特征在于:該試劑盒包括:分別抗CA125、CEA、CA153第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板；用Eu3+標(biāo)記的抗CA125、Tb3+標(biāo)記的抗CEA、Sm3+標(biāo)記的抗CA153第二株單克隆抗體混合抗體；分析緩沖液；共用熒光增強(qiáng)劑；洗滌液；質(zhì)控品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測(cè)乳腺癌試劑盒，其特征在于:所述的第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板的制備方法為:把分別抗CA125、CEA、CA153第一株單克隆抗體混合抗體用包被緩沖液稀釋?zhuān)频每贵w包被液，然后向微孔板的每個(gè)孔中分別加入100 μ I的所述抗體包被液，于37°C包被2小時(shí)，然后用生理鹽水沖洗微孔板三次，然后再向微孔板的每個(gè)孔中分別加入200μ I的封板液，于室溫封閉2小時(shí)，然后用生理鹽水沖洗微孔板兩次，冷凍干燥，制得混合抗體包被的微孔板。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測(cè)乳腺癌試劑盒，其特征在于:所述抗體包被液中，分別抗CA125、CEA、CA153的第一株單克隆抗體的濃度均為0.009 0.014g/L0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測(cè)乳腺癌試劑盒，其特征在于:所述用Eu3+標(biāo)記的抗CA125、Tb3+標(biāo)記的抗CEA、Sm3+標(biāo)記的抗CA153第二株單克隆抗體混合抗體中，用Eu3+標(biāo)記的抗CA125抗體、Tb3+標(biāo)記的抗CEA抗體、Sm3+標(biāo)記的抗CA153抗體的質(zhì)量配比為:Eu3+標(biāo)記的抗CA125抗體:Tb3+標(biāo)記的抗CEA抗體:Sm3+標(biāo)記的抗CA153抗體=(7 13): (6 11): (6.5 13)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測(cè)乳腺癌試劑盒，其特征在于:所述共用熒光增強(qiáng)劑的制備方法為:解離部分:將70 200 μ mol的PTA、2 7 μ mol的氧化釔、0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合,用水定容至I升，用乙酸調(diào)pH值至3.5,制得解離部分；增強(qiáng)部分:將0.1 0.4mmol的鄰菲羅啉和0.2mol的Tris混合,用水定容至1L,制得增強(qiáng)部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測(cè)乳腺癌試劑盒，其特征在于:所述洗滌液的制備方法為:在濃度為0.0lmol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中加入吐溫_20，混勻，制得吐溫-20質(zhì)量百分比濃度為0.05%的PBS溶液，然后用質(zhì)量百分比濃度為0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得洗滌液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測(cè)乳腺癌試劑盒，其特征在于:所述質(zhì)控品為CA125、CEA、CA153標(biāo)準(zhǔn)品的混合物。
8.—種權(quán)利要求1-7任一所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測(cè)乳腺癌試劑盒在綜合檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒在綜合檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟: (1)用分析緩沖液稀釋質(zhì)控品，制成具有系列濃度梯度包含有CA125、CEA、CA153標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液； (2)將待測(cè)樣品與步驟(1)制備的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液分別加入抗CA125、CEA、CA153第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板的不同孔中，然后再向孔中加入能分別與CA125、CEA、CA153結(jié)合的標(biāo)記有稀土離子螯合物的第二株單克隆抗體混合抗體，之后加入共用熒光增強(qiáng)劑，進(jìn)行時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)，得到發(fā)光值； (3)根據(jù)測(cè)定的具有系列濃度梯度的包含CA125、CEA、CA153標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液的發(fā)光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)； (4)以測(cè)定的待測(cè)樣品中的CA125、CEA、CA153發(fā)光值和標(biāo)準(zhǔn)品中CA125、CEA、CA153各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的發(fā)光值做比較，得出待測(cè)樣品中CA125、CEA、CA153各自的含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒在綜合檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153中的應(yīng)用，其特征在于:所述待測(cè)樣品`為人體血清。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物和醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)綜合檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)CA125、CEA、CA153的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)試劑盒，同時(shí)還涉及該試劑盒在綜合檢測(cè)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA125、CEA、CA153中的應(yīng)用。該試劑盒包括分別抗CA125、CEA、CA153第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板；用Eu3+標(biāo)記的抗CA125、Tb3+標(biāo)記的抗CEA、Sm3+標(biāo)記的抗CA153第二株單克隆抗體混合抗體；分析緩沖液；共用熒光增強(qiáng)劑；洗滌液；質(zhì)控品。本發(fā)明提供的試劑盒可用于乳腺癌的臨床輔助診斷、療效觀(guān)察及預(yù)后判斷，對(duì)乳腺癌腫瘤的治療和預(yù)防具有重要意義，同時(shí)檢測(cè)三個(gè)腫瘤標(biāo)志物，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟，提高了檢測(cè)數(shù)據(jù)綜合分析的特異性和靈敏性。
文檔編號(hào)G01N33/577GK103105384SQ201210512730
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者王嘎, 程自卿 申請(qǐng)人:河南生生醫(yī)療器械有限公司