專利名稱：一種檢測乳腺球蛋白的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測乳腺球蛋白的方法及其試劑盒。系一種用抗乳腺球蛋白單克隆抗體標(biāo)記的乳膠顆粒通過乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白的方法。
背景技術(shù)：
乳腺癌是婦女常見的惡性腫瘤，占所有女性惡性腫瘤的22％。全世界每年約有120萬婦女患乳腺癌，50萬人死于乳腺癌。在西歐、北美等發(fā)達(dá)國家，乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤首位。乳腺癌在發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率是貧窮國家的兩倍。據(jù)1992-1996年統(tǒng)計，在美國乳腺癌的發(fā)病率是110.6/10萬人。雖然亞洲是乳腺癌低發(fā)區(qū)，但是，我國乳腺癌的發(fā)病率也正在逐年上升。用世界標(biāo)準(zhǔn)人口調(diào)整計算的發(fā)病率1982年到1984年時，上海僅為10萬分之19，而1988年到1992年已升至10萬分之25.6。目前抽樣調(diào)查到的天津、北京、哈爾濱、武漢等地的發(fā)病率都占到當(dāng)?shù)嘏詯盒阅[瘤的第一或第二位；而死亡率都為女性惡性腫瘤的第四或第五位。我國乳腺癌特點，除發(fā)病率逐年增長外，在發(fā)病年齡上，與西方國家有明顯差別。從30歲以后就開始增加，發(fā)病年齡高峰在40-49歲，比西方婦女早10-15年，以中年人居多，這個時期婦女處于最佳工作年齡狀態(tài)，因此乳腺癌發(fā)病率的增加無疑會對社會及家庭產(chǎn)生巨大影響。由于經(jīng)濟(jì)文化發(fā)展的限制，我國乳腺癌病人就診時的病期相對偏晚，術(shù)前偏晚的III、IV期病人的比例約為30％，而同期美國約為15％。病期越晚，治療越加困難。
降低乳腺癌死亡率的根本途徑在于臨床早期診斷。傳統(tǒng)的乳腺癌早期診斷包括乳房檢查、X線檢查、CT檢查、活體組織檢查及血清乳腺癌腫瘤標(biāo)志物檢查。前三種方法或者陽性率低，檢查方法繁瑣，費用昂貴；或者對病人有侵入性。早期、簡單、便宜，及非侵入的乳腺癌血清腫瘤標(biāo)志物檢查不失為最佳方法，特別是在中國這樣的發(fā)展中國家，人們還負(fù)擔(dān)不起昂貴的乳癌檢測費用。
在癌變過程中，由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生、分泌的細(xì)胞組織成份以蛋白質(zhì)、DNA或mRNA的形式存在于病人的血液中，這類物質(zhì)稱腫瘤標(biāo)志物?，F(xiàn)在已知的與乳腺癌有關(guān)的腫瘤標(biāo)志物有(1)癌胚抗原(CEA)為非特異性抗原，在許多來源于上皮腫瘤及某些非腫瘤疾病血清中都有升高，無鑒別診斷價值，可作為乳腺癌患者術(shù)前檢查的一項指標(biāo)，約有20％～30％乳癌病人血中CEA含量升高，晚期及轉(zhuǎn)移性入癌患者中則有50％～70％出現(xiàn)CEA高值；(2)鐵蛋白血清鐵蛋白反映體內(nèi)鐵的儲存狀態(tài)，在很多惡性腫瘤如白血病、胰腺癌、胃腸道腫瘤、乳腺癌患者血清中都有鐵蛋白的升高；(3)CA15-3對乳腺癌診斷符合率為33.3％～57％。它們都不是乳腺癌特異性的腫瘤標(biāo)記物，因而不能用于乳腺癌的血清鑒別診斷。
美國學(xué)者于1998首先發(fā)現(xiàn)乳腺球蛋白基因(SEQ ID NO4)，乳腺球蛋白基因定位于染色體11q12.2上。乳腺球蛋白由93氨基酸組成(SEQ ID NO5)，分子量大約10.5kDa，與人類克拉拉細(xì)胞(Clara cell)分泌的子宮珠蛋白/親脂蛋白〔uteroglobin/lipophilin〕有關(guān)(Watson M.A.等，《腫瘤基因》(Oncogene)16817-824，1998)。正常乳腺腺上皮分泌微量的乳腺球蛋白，正常女性血清乳腺球蛋白的濃度與妊辰，哺育及良性乳腺增生性疾病有關(guān)。正常西方人血清乳腺球蛋白的濃度為0.1-0.4μg/L。血清中乳腺球蛋白的濃度升高與腫瘤臨床分期及腫瘤大小有關(guān)。乳腺癌組織分泌大量的乳腺球蛋白，乳腺癌病人血清乳腺球蛋白的濃度一般高于1.7μg/L。研究表明乳腺球蛋白是迄今為止檢測人類乳腺癌的最好的標(biāo)志(Zehentner BK and Carter D，《臨床化學(xué)》(Clin Chem)，37249-57，2004；Gillanders WE，Mikhitarian K，HebertR等，《外科年鑒》(Ann Surg)，239828-37，2004.)。
Watson及Fleming利用RT-PCR方法研究乳腺球蛋白在乳腺癌組織內(nèi)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)與正常人乳腺組織比較，23％乳腺癌內(nèi)有10倍以上的乳腺球蛋白表達(dá)(Watson M.A.and Fleming T.P.《癌癥研究》(Cancer Res)，56860-865，1996)。在最近的一項研究中，Leygue等用原位雜交方法(FISH)發(fā)現(xiàn)乳腺球蛋白只在乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)而不在間質(zhì)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(Leygue E.等，《病理學(xué)雜志》(J.Pathol.)，18928-33，1999)。Nunez-Villar等利用RT-PCR方法檢測乳腺球蛋白mRNA在乳腺癌內(nèi)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)乳腺球蛋白的高表達(dá)與雌激素及孕激素在乳腺癌的表達(dá)有關(guān)。他們還發(fā)現(xiàn)乳腺球蛋白在乳腺癌內(nèi)的表達(dá)與腫瘤的分化及愈后有關(guān)即分化好的乳腺癌表達(dá)高水平的乳腺球蛋白(Nunez-Villar MJ，Martinez arribas F，Pollan M，Lucas AR，Sanchez J，Tejerina A，等，《乳腺癌研究》(Breast Cancer Res)，565-70，2003)。研究人員在對100例原發(fā)乳腺癌做免疫組織化學(xué)檢測后發(fā)現(xiàn)，81例呈陽性反應(yīng)(81％)。當(dāng)乳腺球蛋白免疫組織化學(xué)與另一乳腺癌標(biāo)志GCDFP-15結(jié)合，檢測的陽性率可以高達(dá)84％。因此乳腺球蛋白免疫組織化學(xué)可以作為檢測原發(fā)乳腺癌的標(biāo)志(Watson M.A.等，《癌癥研究》(Cancer Res.)，593028-3031，1999；Fanger GR等，《腫瘤生物學(xué)》(Tumour Biol.)，23212-21，2002；WherlingRW等，《現(xiàn)代病理學(xué)》(Modern Pathology)15(1)56A，2002)。
研究發(fā)現(xiàn)乳腺球蛋白是迄今為止最好的PCR檢測淋巴結(jié)內(nèi)乳腺癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。用乳腺球蛋白RT-PCR方法檢測淋巴結(jié)及乳腺原發(fā)癌發(fā)現(xiàn)，所有13例組織學(xué)淋巴結(jié)陽性的乳腺癌病人的守衛(wèi)(sentinel)淋巴結(jié)內(nèi)有乳腺球蛋白mRNA，而7例組織學(xué)陰性守衛(wèi)淋巴結(jié)內(nèi)沒有乳腺球蛋白mRNA的表達(dá)。利用RT-PCR方法還發(fā)現(xiàn)119例組織學(xué)陰性的守衛(wèi)淋巴結(jié)中有9例呈陽性；247例組織學(xué)陰性正常淋巴結(jié)有13例呈陽性。乳腺球蛋白免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)11例有乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)病例中的10例表達(dá)乳腺球蛋白；而陰性淋巴結(jié)內(nèi)沒有乳腺球蛋白的表達(dá)(Min CJ等，《癌癥研究》(Cancer Res.)，584581-4584，1998；Zehentner BK等，《臨床化學(xué)》(Clin Chem.)，481225-31，2002；BranaganG等，《英國外科雜志》〔Br J Surg)，8986-9，2002；Leygue E等，《病理學(xué)雜志》〔J.Pathol.〕，18928-33，1999；Gillanders WE等，《外科年鑒》(AnnSurg)239828-37，2004)。
晚期乳腺癌的特徵就是癌細(xì)胞經(jīng)血液轉(zhuǎn)移到身體的其它部位。利用RT-PCR方法檢測27例健康女性血液乳腺球蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)所有27例全是陰性；而114例乳腺癌病人有29例檢測到乳腺球蛋白mRNA的存在(25％)。所有27例陽性病人都有血漿CEA水平下降。而沒有乳癌轉(zhuǎn)移的病人血漿CEA水平也下降?？傊?，乳腺球蛋白對周圍血乳癌細(xì)胞的特異性要高于CEA或細(xì)胞角質(zhì)蛋白19(兩種常用的周圍血乳癌細(xì)胞標(biāo)志)(Zach O等，《臨床腫瘤學(xué)雜志》(J.Clin.Oncol.)，172015-2019，1999；Carter D等，《臨床癌癥研究》(Cancer Res.)9749-54，2003；Gal S等，《紐約科學(xué)院年鑒》(Ann N Y Acad Sci.)945192-4，2001；Grunewald K等，《 》(Lab.Invest.)801071-1077，2000；Zehantner BK等，《臨床化學(xué)》(Clin Chem)，37249-57，2004)。Zehantner等發(fā)現(xiàn)77％乳癌病人血清有乳腺球蛋白mRNA的表達(dá)。
乳腺球蛋白通常在正常乳腺組織表達(dá)很低，而在乳腺癌組織內(nèi)高表達(dá)。Zehentner(2004)研究142乳癌病人的血清乳腺球蛋白發(fā)現(xiàn)100例(70％)陽性(Zehantner BK等，《臨床化學(xué)》(Clin Chem)，37249-57，2004)。血清的乳腺球蛋白濃度隨腫瘤的大小、臨床分期而變化。乳腺球蛋白在結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌及前列腺癌組織內(nèi)均不表達(dá)。因此可以利用乳腺球蛋白發(fā)展一種高靈敏度的ELISA方法來早期檢測乳腺癌。但是這方面的研究還是空白(Fanger GR等，《腫瘤生物學(xué)》(Tumour Biol.)，23212-21，2002；Han JH等，《 》(Archpathol Lab Med.)1271330-7，2003)。
綜上所述，乳腺球蛋白的表達(dá)具有乳腺組織特異性，其基因表達(dá)的失調(diào)對于乳腺癌的早期鑒別具有重要意義，可以作為乳腺癌的標(biāo)志物。通過對外周淋巴結(jié)和外周血中乳腺球蛋白轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分析，對于檢測隱匿的乳腺癌轉(zhuǎn)移同樣具有指示性意義。
中國專利申請(申請?zhí)朇N 98809313)公開了一種用免疫印跡法檢測乳腺球蛋白的方法，該方法可以用于乳腺球蛋白的定性檢測，每次試驗?zāi)軌蛱幚淼臉颖緮?shù)量受制于電泳印跡設(shè)備的限制，而且試驗所需時間較長。目前尚缺乏快速高靈敏度的定性檢測乳腺球蛋白的方法和可以全定量和/或半定量檢測乳腺球蛋白的方法。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，以提供一種高度靈敏的可以定量和/或半定量的檢測乳腺球蛋白的方法，該目的可以通過乳膠凝集抑制法和雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法實現(xiàn)。進(jìn)而發(fā)明人對此兩種方法及其檢測試劑盒進(jìn)行了廣泛的研究。
因而，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種檢測乳腺球蛋白的方法以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的處理樣本數(shù)量少、定性檢測時間長及不能定量測定乳腺球蛋白的技術(shù)缺陷。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供一種檢測乳腺球蛋白的試劑盒，使上述檢測乳腺球蛋白的方法更加方便實施。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的根據(jù)免疫學(xué)凝集抑制試驗的原理，乳腺球蛋白抗原能夠與結(jié)合了抗乳腺球蛋白抗體的乳膠顆粒結(jié)合，因而含有乳腺球蛋白抗原的樣本就會發(fā)生凝集反應(yīng)，可以用于定性或半定量測定乳腺球蛋白。雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法廣泛用于抗原檢測，可以用于乳腺球蛋白的定量測定。另外對該乳腺球蛋白檢測方法的試劑盒進(jìn)行研究。
本發(fā)明提供了乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白的方法，包括如下步驟a)將抗乳腺球蛋白抗體標(biāo)記的乳膠顆粒與待測樣本混合，和b)根據(jù)是否出現(xiàn)凝集反應(yīng)判定檢測結(jié)果。
抗乳腺球蛋白抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。制備抗乳腺球蛋白抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如用提純的天然乳腺球蛋白來免疫兔或鼠產(chǎn)生專一性的抗乳腺球蛋白單克隆漿細(xì)胞株，單克隆漿細(xì)胞株再與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到骨髓雜交瘤細(xì)胞。骨髓雜交瘤細(xì)胞在經(jīng)過反復(fù)的篩選克隆便可以產(chǎn)生針對乳腺球蛋白有特異性的單克隆細(xì)胞株。培養(yǎng)該單克隆細(xì)胞株，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)檢測培養(yǎng)上清中有無抗乳腺球蛋白單克隆抗體產(chǎn)生。所謂天然的意思是乳腺球蛋白可以從天然來源(如正?；虿∽兩矬w)中分離得到并未經(jīng)人工改造。
優(yōu)選地，本發(fā)明使用的抗乳腺球蛋白單克隆抗體為RO28或RO48。該抗體使用權(quán)由申請人在美國的公司(ZETA CORPORATION)從美國CORIXA公司獲得。
待測樣本的含義指其可以是組織活檢樣品或血液、血漿、血清等，根據(jù)需要也可以對其進(jìn)行處理。優(yōu)選地，本發(fā)明的待測樣本是血清。
優(yōu)選地，乳膠凝集法檢測乳腺球蛋白的方法，包括如下步驟a)用抗乳腺球蛋白抗體RO28或RO48標(biāo)記乳膠顆粒；b)將標(biāo)記的乳膠顆粒保存在HEPES緩沖液內(nèi)(pH8.2)；c)以乳腺球蛋白抗原為陽性對照，正常健康女性血清為陰性對照；d)等體積的待測樣本、陰性對照和陽性對照分別與同一體積的標(biāo)記乳膠顆?；旌?、反應(yīng)；和e)根據(jù)是否出現(xiàn)凝集反應(yīng)判定檢測結(jié)果。
優(yōu)選地HEPES緩沖液含有0.2g/L疊達(dá)鈉。
本發(fā)明提供了用于乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白的試劑盒。該試劑盒包含包裝于容器中的抗乳腺球蛋白抗體、乳腺球蛋白抗原、正常健康女性血清陰性對照和乳膠顆粒。
優(yōu)選地上述試劑盒所述之抗乳腺球蛋白抗體是RO28或RO48。所述的乳腺球蛋白抗原是天然乳腺球蛋白。所述的乳膠顆粒直徑為2-10μm，優(yōu)選地其直徑為2μm。優(yōu)選地該試劑盒還包括具有小池的試驗板，如有試驗池的玻片。更優(yōu)選地該試劑盒還包括包裝于容器中的HEPES緩沖液和包裝于容器中的PBS緩沖液。
另一方面，本發(fā)明提供了一種雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法。該方法包括如下步驟a)使抗乳腺球蛋白抗體(包被抗體)與固相載體結(jié)合形成固相抗乳腺球蛋白抗體；b)去除未結(jié)合抗乳腺球蛋白抗體及其它雜質(zhì)；c)封閉固相抗體；d)向每份固相抗體加入乳腺球蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本，反應(yīng)；e)去除未結(jié)合部分；f)加入標(biāo)記的抗天然乳腺球蛋白抗體(酶標(biāo)抗體)，反應(yīng)；g)洗去未結(jié)合的部分；h)加入標(biāo)記的辣根過氧化酶，反應(yīng)；i)洗去未結(jié)合的部分；j)加入顯色底物，反應(yīng)，用50mmol硫酸終止；和k)讀數(shù)。
其中，步驟a)中的包被抗體是特異性抗乳腺球蛋白抗體，優(yōu)選地是抗乳腺球蛋白單克隆抗體，更優(yōu)選地是抗體RO48。
所述的固相載體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的96孔板或其他合適的器材，如方便使用的酶標(biāo)排條。
步驟f)中所述的酶標(biāo)抗體可以是標(biāo)記的特異性抗乳腺球蛋白抗體，優(yōu)選地是標(biāo)記的抗乳腺球蛋白抗體RO28。標(biāo)記的含義在本領(lǐng)域是已知的，如用生物素標(biāo)記該抗體。
步驟h)中的標(biāo)記的辣根過氧化酶與f)相應(yīng)，如用鏈霉素抗生物素蛋白標(biāo)記辣根過氧化酶(streptoavidin-horseradish peroxidas)。
顯色底物在本領(lǐng)域是已知的，如可以是N-四甲聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidine)、ABTS即2，2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸(2，2′-Azino-bis-(3-ethylbenztbiozoline 6-sulfonic acid)。
封閉固相抗體的封閉液在本領(lǐng)域是已知的，例如可以是脫脂牛奶或者動物白蛋白。
所說的乳腺球蛋白抗原是天然乳腺球蛋白。每一步驟所用的緩沖液、反應(yīng)溫度及其反應(yīng)時間可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的知識確定。
優(yōu)選地，本發(fā)明的雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法在向每份固相抗體加入等體積乳腺球蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本時，同時加入等體積正常健康女性血清。
值得一提的是，當(dāng)乳腺球蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品以梯度序列加入固相抗體時，即可以定量測定待測樣本中的乳腺球蛋白，方法是用450nm光譜儀(如本領(lǐng)域常用的酶標(biāo)儀)讀數(shù)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線從而計算出待測樣本中乳腺球蛋白的含量。而當(dāng)僅有一個或兩個或三個乳腺球蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)濃度或者盡管以梯度序列加入乳腺球蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)但用目視檢測時，可以半定量檢測乳腺球蛋白。
本發(fā)明提供了雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法所用的試劑盒，該試劑盒包含包括于容器中的包被抗體、酶標(biāo)抗體、乳腺球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和正常健康女性血清。優(yōu)選地所說的包被抗體是抗乳腺球蛋白抗體RO48，所說的酶標(biāo)抗體是標(biāo)記的抗乳腺球蛋白抗體RO28，更優(yōu)選地該酶標(biāo)抗體是生物素標(biāo)記的抗乳腺球蛋白抗體RO28。
優(yōu)選地，用雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測乳腺球蛋白所用的試劑盒還包括標(biāo)記的辣根過氧化酶，更優(yōu)選地該標(biāo)記的辣根過氧化酶是鏈霉素抗生物素蛋白標(biāo)記辣根過氧化酶。
實施本發(fā)明提供的檢測乳腺球蛋白的方法時，可以先用乳膠凝集抑制法檢測樣本，對呈陽性反應(yīng)者再用雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法定量測定樣本中的乳腺球蛋白含量。
MDA-MB-415細(xì)胞分泌高濃度的天然乳腺癌球蛋白，培養(yǎng)MDA-MB-415細(xì)胞，離心或過濾除去細(xì)胞，收集上清經(jīng)過分離提取天然乳腺癌球蛋白。測定提取的大然乳腺癌球蛋白的濃度。
本發(fā)明提供的另一種檢測樣本中乳腺球蛋白表達(dá)的方法是通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測樣品中的乳腺球蛋白mRNA實現(xiàn)的。該方法包括如下步驟a)用常規(guī)方法提取樣本中mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，b)提供兩端段PCR引物，該引物所包含的寡聚核苷酸位于編碼乳腺球蛋白的cDNA的兩測或位于其中，c)用PCR擴(kuò)增編碼乳腺球蛋白的cDNA，和d)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。由mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA的方法在本領(lǐng)域是公知的。優(yōu)選地所提供的PCR引物包含核苷酸序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的方法可以是瓊脂糖電泳，也可以是用標(biāo)記探針雜交，優(yōu)選地該標(biāo)記探針包含核苷酸序列SEQ ID NO3。
優(yōu)選地，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物可以這樣進(jìn)行將標(biāo)記探針用包被液點樣于平均孔徑2-10μm的高分子聚合物膜上，然后干燥之；再將該檢測膜與上述RT-PCR產(chǎn)物接觸，檢測RT-PCR產(chǎn)物是否與探針反應(yīng)。包被探針和雜交試驗的條件在本領(lǐng)域是公知的。
在另一方面，本發(fā)明提供了RT-PCR檢測樣品中的乳腺球蛋白表達(dá)的試劑盒。該試劑盒包括包裝于容器中的兩段PCR引物，它們包含的寡聚核苷酸位于編碼乳腺球蛋白的cDNA的兩測或位于其中，該兩段引物包含核苷酸序列SEQ IDNO1和SEQ ID NO2。優(yōu)選地，該試劑盒還包括檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交探針，該探針包含核苷酸序列SEQ ID NO3。優(yōu)選地，該試劑盒還包括檢測膜，該檢測膜為平均孔徑2-8μm的高分子聚合物膜。更優(yōu)選地該檢測膜為平均孔徑2-8μm的高分子聚合物膜，標(biāo)記探針固定在該檢測膜上。
最優(yōu)選地，該試劑盒還包括乳腺球蛋白cDNA陽性對照品，其核苷酸序列包含核苷酸序列SEQ ID NO4。
乳腺球蛋白的表達(dá)具有組織特異性，是乳腺癌的特異性標(biāo)記物，而且其基因表達(dá)的失調(diào)在乳腺癌的早期即已發(fā)生，因而檢測乳腺球蛋白對于早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌形成性細(xì)胞的存在、檢測乳腺癌轉(zhuǎn)移及評價愈后具有重要意義。檢測乳腺球蛋白與乳房X照相術(shù)結(jié)合能夠提高對乳腺癌預(yù)測的準(zhǔn)確性。
本發(fā)明提供的檢測乳腺球蛋白的方法，乳膠凝集抑制法和雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測乳腺球蛋白均具有顯著優(yōu)點可以同時處理大量樣本，乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白較之免疫印跡法，試驗所需時間大大縮短；雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測乳腺球蛋白能夠定量檢測樣本中乳腺球蛋白的含量。例如，在實施例3中，當(dāng)采用96孔板進(jìn)行雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測時，乳腺球蛋白標(biāo)準(zhǔn)梯度設(shè)定7個濃度，每一濃度做兩個復(fù)孔，每個樣品業(yè)同樣做兩個復(fù)孔，如此每板可同時處理40余個樣本，由于每個樣本做兩個復(fù)孔，其試驗結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。方法簡單，易操作，易為大多國內(nèi)醫(yī)院臨床實驗室所掌握。利用本發(fā)明的試劑盒，所有的檢測試驗將更加簡單便捷。
基于如上所述該發(fā)明有及強(qiáng)的臨床實用性，易普及，可以大大地提高我國乳腺癌的早期診斷率。同時該發(fā)明的方法的成本低，方法的使用成本要比現(xiàn)行的檢查乳腺癌方法(X線，CT斷層掃描等方法)的成本低兩倍以上，因此很適合我國的國情。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但它們都是說明性的，不以任何形式限制本發(fā)明的范圍。
實施例1將2.7-4.5ml病人血液收集于內(nèi)含EDTA的采集管內(nèi)，混勻，移去血漿，將血漿離心15分鐘(2500×g)，取上清冰凍。用抗乳腺球蛋白抗體RO28標(biāo)記乳膠顆粒(直徑2μm)。將標(biāo)記的乳膠顆粒保存在(2-8℃)含有0.2g/L疊達(dá)鈉的HEPES緩沖液內(nèi)(pH8.2)。取出所有試劑放置室溫下10分鐘。正常健康女性血清陰性對照及乳腺球蛋白陽性對照試管各加入200μl PBS，靜置10分鐘，然后混勻。反復(fù)混勻試管內(nèi)的凝膠顆粒。使用有試驗池的玻片，先向不同的池中滴入20μl病人血漿及20μl陰性對照和20μl陽性對照，左右搖晃1～2分鐘使之混勻，然后各加入乳膠顆粒一滴，再搖2～3分鐘使兩者充分混合，5分鐘后觀察結(jié)果，出現(xiàn)均勻一致的凝集小顆粒者為陽性反應(yīng)，無凝集者為陰性反應(yīng)。
使用之前應(yīng)做對照試驗，出現(xiàn)如下結(jié)果試驗方可成立，否則應(yīng)重試，如重試仍不出現(xiàn)如下結(jié)果則停止使用乳腺球蛋白標(biāo)準(zhǔn)液加乳腺球蛋白抗體標(biāo)記的凝膠顆粒陽性凝集；正常健康女性血清加乳腺球蛋白抗體標(biāo)記的凝膠顆粒呈陰性凝集。
實施例2用抗乳腺球蛋白抗體RO48標(biāo)記乳膠顆粒(直徑2μm)，其他步驟同實施例1。
實施例3雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測乳腺球蛋白，步驟如下1)將特異性抗乳腺球蛋白RO48抗體稀釋至4μg/ml。將稀釋的50μl RO48抗體與固相載體96孔板反應(yīng)(200ng/孔)，4℃過夜。吸去多余上清，洗去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)；2)加入250μl脫脂牛奶(50g/L，PBS緩沖液稀釋)室溫下反應(yīng)2小時；3)吸去多余上清，洗去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)；4)標(biāo)準(zhǔn)組每孔加入30μl天然乳腺球蛋白5)(稀釋7個濃度5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml、78pg/ml)及10μl正常女性血清；測試樣本組每孔加入30μl稀釋液及10μl待測乳腺癌病人血清；標(biāo)準(zhǔn)組和測試樣本組均做兩個復(fù)孔；6)室溫下反應(yīng)3小時；
7)洗去未結(jié)合的部分；8)將生物素化(biotinylated)的RO28(1mg/L)抗天然乳腺球蛋白抗體用稀釋液稀釋。將50μl的稀釋后生物素化RO28抗體加入孔內(nèi)，室溫下反應(yīng)60分鐘；9)洗去未結(jié)合的部分；10)稀釋鏈霉素抗生物素蛋白標(biāo)記的辣根過氧化酶至0.1μg/ml。每孔加入50μl的稀釋的超生物素標(biāo)記的辣根過氧化酶，室溫下反應(yīng)30分鐘；11)洗去未結(jié)合的部分；12)每孔加入50μl底物N-四甲聯(lián)苯胺，在振動器上室溫下反應(yīng)2分鐘，反應(yīng)用0.05mol/L硫酸終止。
12〕450nm光譜儀讀數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測試樣本中乳腺球蛋白含量。
實施例4乳腺癌病人血清mRNA用常規(guī)方法提取，然后轉(zhuǎn)錄成cDNA。將待檢標(biāo)本cDNA熱變性為單股DNA作為模板，加一對人工合成的模板DNA兩端各20個堿基互補(bǔ)的引物5’-TGCCATAGATGAATGA AGGAATG(SEQ ID NO1)；和3’-TGTCATATATTAATTGCATAAACCACCTCA(SEQ ID NO2)，在耐熱DNA聚合酶作用下，使四種脫氧核苷按模板3’端引物向5’端延伸成DNA鏈，經(jīng)20～40循環(huán)。用同樣的方法擴(kuò)增乳腺球蛋白陽性乳腺癌DNA及陰性對照DNA。上述產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，然后用標(biāo)記探針雜交檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，雜交探針核苷酸序列為；TCTTAACCAAACGGATGAAACTCTGAGCAATG(SEQ ID NO3)。
實施例5RT-PCR擴(kuò)增乳腺球蛋白cDNA的方法同實施例4。將標(biāo)記探針用包被液點樣于平均孔徑2μm的高分子聚合物膜(硝酸纖維素膜)上，然后干燥之；將該檢測膜與上述RT-PCR產(chǎn)物接觸，檢測RT-PCR產(chǎn)物是否與探針反應(yīng)。
序列表<110>上海晶泰生物技術(shù)有限公司<120>一種檢測乳腺球蛋白的方法及其試劑盒<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1tgccatagat gaatgaagga atg 23
<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2tgtcatatat taattgcata aaccacctca30<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>3tcttaaccaa acggatgaaa ctctgagcaa tg 32<210>4<211>503<212>DNA
<213>人種(human sp.)<220>
<221>CDS<222>(61)..(339)<400>4gacagcggct tccttgatcc ttgccacccg cgactgaaca ccgacagcag cagcctcacc 60atg aag ttg ctg atg gtc ctc atg ctg gcg gcc ctc tcc cag cac tgc 108Met Lys Leu Leu Met Val Leu Met Leu Ala Ala Leu Ser Gln His Cys1 5 10 15tac gca ggc tct ggc tgc ccc tta ttg gag aat gtg att tcc aag aca 156Tyr Ala Gly Ser Gly Cys Pro Leu Leu Glu Asn Val Ile Ser Lys Thr20 25 30atc aat cca caa gtg tct aag act gaa tac aaa gaa ctt ctt caa gag 204Ile Ash Pro Gln Val Ser Lys Thr Glu Tyr Lys Glu Leu Leu Gln Glu35 40 45ttc ata gac gac aat gcc act aca aat gcc ata gat gaa ttg aag gaa 252Phe Ile Asp Asp Asn Ala Thr Thr Asn Ala Ile Asp Glu Leu Lys Glu50 55 60tgt ttt ctt aac caa acg gat gaa act ctg agc aat gtt gag gtg ttt 300
Cys Phe Leu Asn Gln Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Val Glu Val Phe65 70 75 80atg caa tta ata tat gac agc agt ctt tgt gat tta ttt taactttctg 349Met Gln Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe85 90caagaccttt ggctcacaga actgcagggt atggtgagaa accaactacg gattgctgca409aaccacacct tctctttctt atgtcttttt actacaaact acaagacaat tgttgaaacc469tgctatacat gtttatttta ataaattgat ggca503<210>5<211>93<212>PRT<213>人種(human sp.)<400>5Met Lys Leu Leu Met Val Leu Met Leu Ala Ala Leu Ser Gln His Cys1 5 10 15Tyr Ala Gly Ser Gly Cys Pro Leu Leu Glu Asn Val Ile Ser Lys Thr20 25 30Ile Asn Pro Gln Val Ser Lys Thr Glu Tyr Lys Glu Leu Leu Gln Glu35 40 45
Phe Ile Asp Asp Asn Ala Thr Thr Asn Ala Ile Asp Glu Leu Lys Glu50 55 60Cys Phe Leu Ash Gln Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Val Glu Val Phe65 70 75 80Met Gln Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe85 90
權(quán)利要求
1.一種乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白的方法，其特征在于，該方法包括下述步驟a)將抗乳腺球蛋白抗體標(biāo)記的乳膠顆粒與待測樣本混合，和b)根據(jù)是否出現(xiàn)凝集反應(yīng)判定檢測結(jié)果，其中，所述抗乳腺球蛋白抗體標(biāo)記的乳膠顆粒是用抗乳腺球蛋白抗體RO28或RO48標(biāo)記乳膠顆粒，該乳膠顆粒的直徑為2-10μm，并將標(biāo)記的乳膠顆粒保存在HEPES緩沖液內(nèi)，pH 8.2。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以乳腺球蛋白抗原為陽性對照，正常健康女性血清為陰性對照。
3.一種乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白的試劑盒，該試劑盒包含包裝于容器中的抗乳腺球蛋白抗體、乳腺球蛋白抗原、正常健康女性血清陰性對照和乳膠顆粒，其特征在于，所述的抗乳腺球蛋白抗體為RO28或RO48，乳膠顆粒的直徑為2-10μm，其中，所述的試劑盒包括包裝于容器中的HEPES緩沖液、包裝于容器中的PBS緩沖液和具有小池的試驗板。
4.一種雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟a)使包被抗體抗乳腺球蛋白抗體與固相載體結(jié)合形成固相抗乳腺球蛋白抗體；b)去除未結(jié)合抗乳腺球蛋白抗體及其它雜質(zhì)；c)封閉固相抗體；d)向每份固相抗體加入等體積乳腺球蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本，反應(yīng)；e)去除未結(jié)合部分；f)加入標(biāo)記的酶標(biāo)抗體抗天然乳腺球蛋白抗體，反應(yīng)；g)洗去未結(jié)合的部分；h)加入標(biāo)記的辣根過氧化酶，反應(yīng)；i)洗去未結(jié)合的部分；j)加入顯色底物，反應(yīng)，用50mmol硫酸終止；和k)讀數(shù)。
5.如權(quán)利要求4所述雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法，其特征在于，包被抗體是特異性抗乳腺球蛋白單克隆抗體RO48。
6.如權(quán)利要求5所述雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法，其特征在于，酶標(biāo)抗體是生物素標(biāo)記的特異性抗乳腺球蛋白單克隆抗體抗體RO28，標(biāo)記的辣根過氧化酶是鏈霉素抗生物素蛋白標(biāo)記的辣根過氧化酶。
7.如權(quán)利要求4至6任一所述雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法，其特征在于，乳腺球蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品以濃度梯度序列加入固相抗體。
8.一種雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的試劑盒，該試劑盒包含包括于容器中的包被抗體、酶標(biāo)抗體、乳腺球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和正常健康女性血清，其特征在于，包被抗體是特異性抗乳腺球蛋白單克隆抗體RO48、酶標(biāo)抗體是生物素標(biāo)記的特異性抗乳腺球蛋白單克隆抗體抗體RO28。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括包含于容器中的鏈霉素抗生物素蛋白標(biāo)記的辣根過氧化酶。
10.如權(quán)利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括乳腺球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、健康女性血清、96孔板和顯色底物。
11.一種RT-PCR檢測乳腺球蛋白表達(dá)的方法，包括如下步驟a)用常規(guī)方法提取樣本中mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；b)提供兩段PCR引物，該引物所包含的寡聚核苷酸位于編碼乳腺球蛋白的cDNA的兩測或位于其中；c)用PCR擴(kuò)增編碼乳腺球蛋白的cDNA；和d)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，其特征在于，該兩段PCR引物所包含的寡聚核苷酸是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
12.如權(quán)利要求13所述的方法，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，然后用標(biāo)記探針雜交，其特征在于，該探針核苷酸序列為SEQ ID NO3。
13.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，將標(biāo)記探針用包被液點樣于平均孔徑2-10μm的高分子聚合物膜上，然后干燥之；再將該檢測膜與上述RT-PCR產(chǎn)物接觸，檢測RT-PCR產(chǎn)物是否與探針反應(yīng)。
14.一種RT-PCR檢測乳腺球蛋白表達(dá)的試劑盒，該試劑盒包括包裝于容器中的兩段PCR引物，它們包含的寡聚核苷酸位于編碼乳腺球蛋白的cDNA的兩測或位于其中，其特征在于，該兩段引物包含核苷酸序列SEQ ID NO1和SEQ IDNO2，該試劑盒包括包裝于容器中的檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交探針，該探針包含核苷酸序列SEQ ID NO3。
15.如權(quán)利要求14所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括檢測膜，該檢測膜為平均孔徑2-8μm的高分子聚合物膜。
16.如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其特征在于，該檢測膜為平均孔徑2-8μm的高分子聚合物膜，在該檢測膜上已預(yù)先固定了探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測乳腺球蛋白的方法及其試劑盒。本發(fā)明一種乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白的方法，該方法包括下述步驟a)將抗乳腺球蛋白抗體標(biāo)記的乳膠顆粒與待測樣本混合，和b)根據(jù)是否出現(xiàn)凝集反應(yīng)判定檢測結(jié)果，其中，所述抗乳腺球蛋白抗體標(biāo)記的乳膠顆粒是用抗乳腺球蛋白抗體R028或R048標(biāo)記乳膠顆粒，該乳膠顆粒的直徑為2－10μm，并將標(biāo)記的乳膠顆粒保存在HEPES緩沖液內(nèi)，pH 8.2。同時還公開了用抗乳腺球蛋白單克隆抗體和生物素標(biāo)記抗乳腺球蛋白單克隆抗體通過雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測乳腺球蛋白的方法。另外還公開了一種RT－PCR檢測乳腺球蛋白表達(dá)的方法，也提供了用于檢測乳腺球蛋白的試劑盒。本發(fā)明的方法和試劑盒可用于乳腺癌形成性細(xì)胞存在的早期檢測。
文檔編號G01N33/531GK1766634SQ20051010661
公開日2006年5月3日 申請日期2005年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月13日
發(fā)明者初培國 申請人:上海晶泰生物技術(shù)有限公司