確定急性高血壓腎損傷時(shí)足細(xì)胞骨架蛋白及其標(biāo)志蛋白變化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物化學(xué)中的檢測(cè)方法，特別是涉及一種確定急性高血壓腎損傷時(shí)足細(xì)胞骨架蛋白及其標(biāo)志蛋白變化的方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]高血壓腎損傷導(dǎo)致慢性腎臟病(Chronic kidney diseases, CKD)已成為危害公眾健康的重要病因之一。蛋白尿是CKD的主要臨床表現(xiàn),也是終末期腎臟病(End stage renaldisease, ESRD)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。減少蛋白尿可延緩CKD的進(jìn)展，降低ESRD患病率及死亡率。因此，研究如何防止和減少蛋白尿的發(fā)生，對(duì)CKD的防治具有重要意義。
[0003]目前關(guān)于蛋白尿產(chǎn)生機(jī)制的研究熱點(diǎn)為足細(xì)胞損害。足細(xì)胞位于腎小球?yàn)V過屏障的最外側(cè)，作為分子結(jié)構(gòu)性和電荷選擇性屏障，在防止血清蛋白漏出方面發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)足細(xì)胞遭到損害時(shí)，首先出現(xiàn)足突裂孔膜消失、足突融合導(dǎo)致蛋白尿產(chǎn)生，蛋白尿又進(jìn)一步加重足細(xì)胞損傷，導(dǎo)致足細(xì)胞從基底膜上剝脫。以往基于遺傳性芬蘭型腎病綜合征及獲得性足細(xì)胞病如微小病變性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化、膜性腎病、糖尿病腎病等的研究表明足細(xì)胞相關(guān)蛋白及細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)及分布變化與足細(xì)胞損害密切相關(guān)。N印hrin、Podocin,⑶2AP位于足細(xì)胞裂孔膜，作為跨膜蛋白復(fù)合體維持裂孔膜結(jié)構(gòu)和功能完整，并參與足細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，影響細(xì)胞骨架的形態(tài)及功能。足細(xì)胞間“間隙連接通訊(gap junct1n intercellular communicat1n, CJIC)的結(jié)構(gòu)蛋白 CX43 是與裂孔膜蛋白復(fù)合體相對(duì)立的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在嘌呤霉素大鼠模型中，CX43表達(dá)增加，足細(xì)胞融合。Podocalyxin (PCX)是一種帶有豐富負(fù)電荷的跨膜蛋白，主要分布于足細(xì)胞頂部及側(cè)部，其通過NHERF2、Ezrin與細(xì)胞骨架蛋白相互作用，維持足細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。a-actinin-4、Synaptopodin 及 F-actin 是細(xì)胞骨架的重要組成蛋白，a-actinin-4 及Synaptopodin表達(dá)異常引起細(xì)胞骨架重塑,最終導(dǎo)致足突融合、消失。
[0004]信號(hào)傳導(dǎo)通路在足細(xì)胞損傷機(jī)制中具有重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)P13K/AKT通路、MAPK通路、TRPC6通路的激活與足細(xì)胞損害密切相關(guān)。體外足細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，不同刺激因素通過影響足細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，引起N印hrin、N印h1、Podocin及CD2AP表達(dá)變化，并且四者直接或間接聯(lián)系，引起a -actinin-4及Synaptopodin表達(dá)改變,使細(xì)胞骨架發(fā)生重塑，導(dǎo)致足突融合或足細(xì)胞凋亡。足細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路蛋白分子與足細(xì)胞相關(guān)蛋白形成復(fù)雜的“分子網(wǎng)絡(luò)”，影響足細(xì)胞的形態(tài)及功能。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT通路、MAPK通路激活，TGF-β及炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子等均可導(dǎo)致GSK-3 0的磷酸化。GSK-3 0在足細(xì)胞胞漿內(nèi)與β -catenin、APC蛋白及Axin形成降解復(fù)合體，是GSK-3 β / β -catenin信號(hào)通路的核心環(huán)節(jié)。在阿霉素、嘌呤霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞病模型中發(fā)現(xiàn)β-catenin核聚集現(xiàn)象,其下游轉(zhuǎn)錄因子LEF-1在核內(nèi)共表達(dá)。Wnt/ β -catenin通路的激活引起β -catenin在胞衆(zhòng)內(nèi)聚集，打破了細(xì)胞池的動(dòng)態(tài)平衡，使其與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF等結(jié)合后向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF等共同作用激活下游Snail等靶基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷產(chǎn)生蛋白尿。GSK-3 β / β -catenin信號(hào)通路控制著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖與凋亡等諸多方面，在氧化應(yīng)激、機(jī)械牽拉應(yīng)力等作用下激活，導(dǎo)致足細(xì)胞損害。
[0005]高血壓、血液動(dòng)力學(xué)異常和各種代謝因素是足細(xì)胞損傷和丟失的重要因素。在大鼠的微小病變腎病模型和膜性腎病模型中，檢測(cè)到有活性氧系統(tǒng)的激活。氧化應(yīng)激可通過激活P38/MAPK通路等多條途徑，進(jìn)而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。Endlich等對(duì)種植在硅脂膜(silicone menbranes)上的體外培養(yǎng)的足細(xì)胞施加機(jī)械應(yīng)力，發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白發(fā)生重構(gòu)。對(duì)糖尿病腎病研究發(fā)現(xiàn)，腎小球?yàn)V過壓增加，可增加AngII產(chǎn)生，這是由腎小球?yàn)V過壓升高時(shí)的機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的。在這一過程中，AngII的形成是單獨(dú)由機(jī)械應(yīng)力改變導(dǎo)致的，與ACE無關(guān)。急性高血壓或急進(jìn)腎缺血時(shí)足細(xì)胞發(fā)生變形和凋亡，出現(xiàn)蛋白尿。因此，氧化應(yīng)激、機(jī)械應(yīng)力等原因是足細(xì)胞損傷的始動(dòng)因素，可以產(chǎn)生或加重蛋白尿。
[0006]然而，本發(fā)明人尚未檢索到通過GSK-3 β/β -catenin信號(hào)途徑，探討急性高血壓腎損傷時(shí)足細(xì)胞骨架蛋白及其標(biāo)志蛋白的變化規(guī)律的公開報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，提供一種新的確定急性高血壓腎損傷時(shí)足細(xì)胞骨架蛋白及其標(biāo)志蛋白變化的方法，本發(fā)明旨在根據(jù)我國(guó)高血壓腎損害高發(fā)的國(guó)情，進(jìn)行試驗(yàn)研究GSK3 β/β -catenin信號(hào)通路在急性高血壓條件下足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制:應(yīng)用“活體冷凍技術(shù)”結(jié)合冷凍置換方法研究小鼠急性高血壓時(shí)GSK3 3 /β-catenin信號(hào)通路活化與足細(xì)胞相關(guān)蛋白及細(xì)胞骨架蛋白分布與表達(dá)變化的關(guān)系；體外培養(yǎng)足細(xì)胞，研究GSK3 β/β -catenin信號(hào)通路對(duì)足細(xì)胞相關(guān)蛋白及細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)的調(diào)控；研究GSK3 0、β -catenin阻斷劑與基因敲除小鼠對(duì)足細(xì)胞相關(guān)蛋白及細(xì)胞骨架蛋白分布和表達(dá)的影響，旨在闡明足細(xì)胞始動(dòng)環(huán)節(jié)GSK3 β /β -catenin信號(hào)通路在蛋白尿產(chǎn)生中的機(jī)制，為探索防止和減輕足細(xì)胞損傷，減少蛋白尿提供新的治療靶點(diǎn)，延緩CKD進(jìn)展。
[0008]本發(fā)明應(yīng)用“活體冷凍技術(shù)”結(jié)合冷凍置換方法進(jìn)行了血液動(dòng)力學(xué)改變時(shí)足細(xì)胞損傷的研究?！盎铙w冷凍技術(shù)”結(jié)合冷凍置換方法的優(yōu)勢(shì)在于能夠最大程度的原位保持腎組織超微結(jié)構(gòu)與成分，捕獲活體組織細(xì)胞成分生物信息的瞬間變化。本發(fā)明人觀察到在急性高血壓發(fā)生瞬間足細(xì)胞內(nèi)β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。足細(xì)胞相關(guān)蛋白分布改變,表達(dá)減少，足細(xì)胞形態(tài)重塑及密度下降，白蛋白通過足細(xì)胞頂端進(jìn)入Bowman’ s囊。因此，本發(fā)明人假設(shè):GSK3 β / β -catenin信號(hào)通路活化,引起足細(xì)胞相關(guān)蛋白Nephrin、Podocalyxin表達(dá)下降和CX43表達(dá)增加,細(xì)胞骨架蛋白a -actin-4、Synapyopodin表達(dá)下降,導(dǎo)致足突融合、足細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生蛋白尿。
[0009]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的。
[0010]本發(fā)明給出的這種確定急性高血壓腎損傷時(shí)足細(xì)胞骨架蛋白及其標(biāo)志蛋白變化的方法，其特點(diǎn)是采用如下步驟:
[0011]1、建立小鼠急性高血壓模型，以活體麻醉狀態(tài)下，結(jié)扎小鼠左側(cè)腎動(dòng)脈下的腹主動(dòng)脈建立小鼠急性高血壓模型，應(yīng)用“活體冷凍技術(shù)”結(jié)合冷凍置換方法取材固定左腎組織；
[0012]2、確定GSK3 0 / β -catenin信號(hào)通路參與急性高血壓導(dǎo)致足細(xì)胞損害:應(yīng)用免疫組化方法及共聚焦顯微鏡，觀察β-catenin由細(xì)胞漿向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，足細(xì)胞相關(guān)蛋白Nephrin、Cx43、Podocalyxin 及細(xì)胞骨架蛋白 a -actin-4> Synaptopoin 分布關(guān)系；免疫電鏡觀察足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；應(yīng)用Western blot、RQ-PCR測(cè)定上述蛋白及mRNA的表達(dá)；
[0013]3、體外培養(yǎng)足細(xì)胞研究GSK3 β/β -catenin信號(hào)通路對(duì)足細(xì)胞相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)控機(jī)制:體外培養(yǎng)足細(xì)胞，分別給予GSK3 0、β -catenin阻斷劑及激動(dòng)劑、PI3K、MAPK阻斷劑及激動(dòng)劑、AngII及ARB等以及模擬缺氧條件，應(yīng)用放射免疫法、直接酶學(xué)方法或Western blot測(cè)定GSK3 β、β -catenin的活性；應(yīng)用突光染色共定位及Westernblot觀察β -catenin、核轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF及靶基因Snail的分布及表達(dá)；應(yīng)用免疫組化染色及Western blot研究足細(xì)胞相關(guān)蛋白及骨架蛋白的分布及表達(dá)；應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定足細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡；
[0014]4、活體內(nèi)進(jìn)一步闡明GSK3i3/i3-catenin信號(hào)通路在急性高血壓足細(xì)胞損害中的啟動(dòng)作用和核心作用:分別預(yù)先給予外源性的GSK30阻斷劑、β-catenin阻斷劑的急性高血壓小鼠及GSK3 0基因敲除、β-catenin基因敲除小鼠，觀察足細(xì)胞GSK3 3和β-catenin的活性，及信號(hào)通路下游關(guān)鍵蛋白的活性，測(cè)定足細(xì)胞相關(guān)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白mRNA和蛋白表達(dá)；觀察足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:通過GSK-3i3/i3-catenin信號(hào)途徑，探討急性高血壓腎損傷時(shí)足細(xì)胞骨架蛋白及其標(biāo)志蛋白的變化規(guī)律。應(yīng)用“活體冷凍技術(shù)”結(jié)合冷凍置換方法，原位、瞬間捕獲急性高血壓時(shí)活體足細(xì)胞GSK-3 β/β -catenin信號(hào)通路中的蛋白與因子的變化，可視化足細(xì)胞標(biāo)志蛋白的分布及表達(dá)，檢測(cè)足細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)；體外模擬缺血缺氧條件下，干預(yù)足細(xì)胞內(nèi)GSK-3 β/β -catenin信號(hào)通路及其分子變化，探討足細(xì)胞相關(guān)蛋白及細(xì)胞骨架的調(diào)控機(jī)制，為尋求減少蛋白尿的靶向治療提供依據(jù)。
【附圖說明】
[0016]圖1A-圖1D為人工IVCT制取的標(biāo)本及常規(guī)浸潤(rùn)固定標(biāo)本在光鏡下的DAB染色。
[0017]圖2A-圖2H為不同血流動(dòng)力學(xué)條件下，足細(xì)胞相關(guān)蛋白在腎小球的表達(dá)。
[0018]圖3A-圖31為激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果顯示IVCT取材的腎組織足細(xì)胞相關(guān)蛋白podocin, nestin在不同血流動(dòng)力學(xué)條件下的表達(dá)關(guān)系。
[0019]圖4A-圖4F為急性高血壓條件下podocin和nestin的免疫電鏡分析。
[0020]圖5為本發(fā)明給出實(shí)施例的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)詳細(xì)技術(shù)路線示意圖。
[0021]圖6為本發(fā)明給出實(shí)施例的應(yīng)用“活體冷凍技術(shù)”觀察不同條件下小鼠GSK3 β /β -catenin信號(hào)通路的變化技術(shù)路線示意圖。
[0022]圖7為本發(fā)明給出實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)詳細(xì)技術(shù)路線示意圖。
[0023]英文縮略語:
[0024]FP:足細(xì)胞足突
[0025]RBC:紅細(xì)胞
[0026]GCL:腎小球毛細(xì)血管襻
[0027]GBM:腎小球基底膜
[0028]Acute hypertens1n:急性高血壓
[0029]LM:免疫組化
[0030]CLSM:激光共聚焦掃描顯微鏡
[0031]Replica:免疫蝕刻
[0032]TEM:免疫電鏡
[0033]Western blot:免疫印跡
[0034]Real time PCR:實(shí)時(shí)定量 PCR
[0035]Flow Cytometer:流式細(xì)胞儀。
【具體實(shí)施方式】
[0036]本發(fā)明給