一種水稻種胚pod測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水稻領(lǐng)域，確切地說是一種水稻種胚P0D測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 過氧化物酶（P0D)廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用，光 合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系。一般老化組織中，P0D活性較高，幼嫩組織中P0D活性 較弱。胚是種子最重要的發(fā)芽、生長(zhǎng)發(fā)育器官，其P0D可以作為種子老化的一種重要的生理 指標(biāo)。然而，通常情況下，干種子胚因P0D含量較少、活性較低，而脂肪、蛋白質(zhì)含量較高易 造成干擾，因而難以測(cè)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種能較準(zhǔn)確地檢測(cè)干種子P0D活性的水稻種胚P0D測(cè)定 方法。
[0004] 上述目的通過以下方案實(shí)現(xiàn)：
[0005] -種水稻種胚P0D測(cè)定方法，其特征在于：包括以下步驟；
[0006] (1)胚P0D提取液的配制：
[0007] 先配制0. 1MpH 8.5Tris-HCl緩沖液：A液，取3. 0285gTris，溶解，定容至 250ml ;B液，取lml濃鹽酸，稀釋120倍；取250ml A液和73. 5ml B液，混勻，定容至500ml。 用pH試紙校準(zhǔn)。
[0008]再在每 100 毫升 0? 1M pH 8. 5 Tris-HCl 緩沖液中加入 10%甘油，2. 5% Tween20。 [0009](2)種子胚POD檢測(cè)液的配制：
[0010]先配制〇? 2M pH 6. 0磷酸緩沖液：A液，取15. 605g磷酸二氫鈉（含2水），溶解， 定容至500ml ;B液，取7. 164g磷酸氫二鈉（含12水），溶解，定容至100ml。取438ml A液 和62ml B液，混合，定容至500ml。
[0011] 再取配好0. 2M pH 6. 0磷酸緩沖液50ml，過氧化氫0. 028ml，愈創(chuàng)木酚0. 019ml混 合。
[0012] ⑶取樣
[0013] 水稻每個(gè)材料種子100粒左右，去殼，用刀片切或鑷子挖取水稻胚，約70mg左右 胚，置于-8(TC冰箱，待用。
[0014] (4)胚P0D酶液的提取
[0015] 定量稱取20mg胚，置于于研缽中，加上述2ml胚P0D提取液，研磨成勾衆(zhòng)，再加2ml 分兩次洗絳，至研磨總體系4ml，4000rpm離心10min。取上清液1. 5ml即為粗酶提取液。
[0016](5)胚P0D酶活性的測(cè)定
[0017] 向比色皿加入1. 5ml粗酶提取液，再加入反應(yīng)液2. 5ml，每隔lmin讀數(shù)一次，以 0. 2M pH 6. 0磷酸緩沖液為對(duì)照調(diào)零。470nm處測(cè)定5min的0D變化值。做3個(gè)重復(fù)，計(jì)算 平均值。
[0018] (6)結(jié)果計(jì)算后，即可。
[0019] 結(jié)果計(jì)算按照以下方法：
[0020] 以每分鐘0D變化值表示酶活性大小，以每分鐘變化0? 01為1個(gè)活力單位：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種水稻種胚POD測(cè)定方法，其特征在于：包括以下步驟； (1) 胚POD提取液的配制： 先配制 0.1 M pH 8. 5Tris-HCl 緩沖液：A 液，取 3. 0285g Tris，溶解，定容至 250ml ;B 液，取Iml濃鹽酸，稀釋120倍；取250mlA液和73. 5mlB液，混勻，定容至500ml。用pH試 紙校準(zhǔn)。 再在每100毫升0· IM pH 8. 5Tris-HCl緩沖液中加入10%甘油，2. 5% Tween20。 (2) 種子胚POD檢測(cè)液的配制： 先配制0.2M pH 6.0磷酸緩沖液：A液，取15. 605g磷酸二氫鈉（含2水），溶解，定容至 500ml ;B液，取7. 164g磷酸氫二鈉（含12水），溶解，定容至100mL。取438mlA液和62mlB 液，混合，定容至500ml。 再取配好0. 2M pH 6. 0磷酸緩沖液50ml，過氧化氫0. 028ml，愈創(chuàng)木酚0. 019ml混合。 (3) 取樣 水稻每個(gè)材料種子100粒左右，去殼，用刀片切或鑷子挖取水稻胚，約70mg左右胚，置 于-80 °C冰箱，待用。 (4) 胚POD酶液的提取 定量稱取20mg胚，置于于研缽中，加上述2ml胚POD提取液，研磨成勾衆(zhòng)，再加2ml分 兩次洗絳，至研磨總體系4ml，4000rpm離心10min。取上清液I. 5ml即為粗酶提取液。 (5) 胚POD酶活性的測(cè)定 向比色皿加入I. 5ml粗酶提取液，再加入反應(yīng)液2. 5ml，每隔Imin讀數(shù)一次，以0. 2M pH 6. 0磷酸緩沖液為對(duì)照調(diào)零。470nm處測(cè)定5min的OD變化值。做3個(gè)重復(fù)，計(jì)算平均值。 (6) 結(jié)果計(jì)算后，即可。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻種胚POD測(cè)定方法，其特征在于：結(jié)果計(jì)算按照以 下方法： 以每分鐘OD變化值表示酶活性大小，以每分鐘變化0. 01為1個(gè)活力單位：
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻種胚POD測(cè)定方法，包括以下步驟：提取液和檢測(cè)液的配制、取樣、胚POD酶液的提取、胚POD酶活性的測(cè)定、本發(fā)明研制了一種特殊的提取液，利用Tween20的解脂作用和甘油對(duì)POD活性的保護(hù)作用，使POD與脂肪充分分離和酶活得到甘油的充分保護(hù)，從而能較準(zhǔn)確地檢測(cè)干種子POD活性。
【IPC分類】C12Q1-28
【公開號(hào)】CN104762366
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510169715
【發(fā)明人】張瑛, 吳敬德, 滕斌, 宣紅, 周俊峰
【申請(qǐng)人】安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所
【公開日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年4月10日