專利名稱：纖連蛋白與鈣粘附蛋白-11的融合蛋白、制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種纖連蛋白與鈣粘附蛋白-11的融合蛋白制備與應(yīng)用，目的促進(jìn)骨和軟 骨種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合的粘附，屬于組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
種子細(xì)胞在材料表面上的粘附過(guò)程，可分為四個(gè)連續(xù)發(fā)生并相互重疊的變化時(shí)相，即 細(xì)胞附著、細(xì)胞伸展、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的組織以及粘附斑的形成。細(xì)胞粘附涉及多種生 物分子，包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞膜蛋白以及細(xì)胞骨架蛋白的相互聯(lián)系和相互作用。細(xì) 胞和材料的粘附是一個(gè)包括多因素的復(fù)雜過(guò)程，受多種因.素的影響。細(xì)胞、材料及其二者 所處的環(huán)境，都不同程度地影響細(xì)胞與材料的粘附。從材料方面來(lái)說(shuō)，材料表面的理化特 性、幾何形狀及表面能以及材料的降解活性，都對(duì)細(xì)胞粘附起關(guān)鍵性作用。如何有目的的 進(jìn)行組織工程材料的表面修飾以利于種子細(xì)胞粘附、增殖及分化是組織工程骨和軟骨構(gòu)建 中要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。
細(xì)胞表面的粘附受體，主要包括參與同種細(xì)胞間粘著結(jié)合的表面受體轉(zhuǎn)粘蛋白，主 要以同嗜性方式與細(xì)胞一細(xì)胞識(shí)別相關(guān)；整合素以異嗜性方式和細(xì)胞一細(xì)胞及細(xì)胞一細(xì)胞 外基質(zhì)結(jié)合有關(guān)，由a和p亞基以非共價(jià)方式組織成活性二聚體；此外還有選擇素和免疫 球蛋白類。在骨細(xì)胞和培養(yǎng)的成骨細(xì)胞可表達(dá)整合素亞單位a2以及纖維連接蛋白受體ci3 ^、 a5e^t1ave3。軟骨細(xì)胞表面可表達(dá)a 5 ^， a ! e卜"0^， a6
h， ave3等整合素受體，與纖連蛋白(Fibronectin， FN) ， II型、W型膠原，層粘連蛋 白的以及?；Y(jié)合素和骨橋蛋白相結(jié)合。整合素在介導(dǎo)錨定過(guò)程的同時(shí)，還介導(dǎo)跨膜信號(hào) 的傳遞，在粘附斑形成后， 一系列的酶會(huì)被激活，包括粘附斑激酶、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶、有 絲分裂原激活蛋白激酶途徑的某些因子等，啟動(dòng)了胞內(nèi)外信號(hào)的傳遞，觸發(fā)了細(xì)胞的增殖、 遷移、分化、分泌等功能活動(dòng)，使種子細(xì)胞能獲得良好的生物學(xué)特性。而作為asei配體 的FN屬于多糖蛋白，具有粘附細(xì)胞的能力，對(duì)骨和軟骨形成有著重要作用。FN作為ECM 中重要的一種整合素配體，參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘連，維持細(xì)胞正常形態(tài)， 促進(jìn)細(xì)胞分化。FN可與膠原結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附，同時(shí)促進(jìn)成骨細(xì)胞系細(xì)胞增殖分化并使 成熟成骨細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)。FN還可以與羥基灰石結(jié)合調(diào)節(jié)鈣代謝及細(xì)胞粘附，對(duì)礦化 過(guò)程起調(diào)節(jié)作用。FN在成骨細(xì)胞分化時(shí)及以后持續(xù)表達(dá)。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)N對(duì)磷酸鈣陶瓷
4的表面修飾能明顯提高大鼠成骨細(xì)胞的貼附率，有利于成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)及成骨表型。因而 在材料表面接上FN的特異性功能片段，將有助于通過(guò)RGD-ash相互作用，促進(jìn)細(xì)胞的粘附。
FN與a 5 0 i的結(jié)合需要其9號(hào)III型重復(fù)序列(FNin)的PHSRN基序和9號(hào)III型重 復(fù)序列的RGD基序參與，這兩個(gè)基序每一部分對(duì)應(yīng)的連接力較低，但聯(lián)合作用生物學(xué)效 應(yīng)顯著，可以提供穩(wěn)定的粘附。除了增強(qiáng)細(xì)胞-支架的粘附，種子細(xì)胞在材料表面的密度決 定著下步分化及成熟的能力，因此需要把把FN片段與已知三維結(jié)構(gòu)并且具有明確粘附功 能和成骨/軟骨效應(yīng)的分子上，而鈣粘附蛋白-11 (Cadherin-ll，縮寫Cad-11)為一種較佳 的選擇。Cad-11屬II型鈣粘附蛋白，是一種鈣離子依賴性介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間粘附的單鏈跨膜 糖蛋白，與胚胎肢節(jié)形成、骨組織的形成等關(guān)系密切，因其最早在成骨細(xì)胞系中克隆而來(lái)， 所以又稱之為成骨細(xì)胞型鈣粘附蛋白(OB-cadherin)。目前己有學(xué)者進(jìn)行了 Cad-11連接和 粘附特性的精確亞結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的研究。人Cadherin-11是一種由796個(gè)氨基酸殘基組成的蛋 白質(zhì)(Okazaki M.， J. Biol. Chem. 1994， 269:12092-8.)，其分子量約為88.0KD。 Cadherin誦ll 在細(xì)胞中是以一種含22個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和31個(gè)前肽的原肽形式合成的，信號(hào)肽和 前肽在轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌過(guò)程中被切除。在成骨細(xì)胞持續(xù)表達(dá)Cadherin-ll，在胚胎期，Cadherin-ll 限制性的在間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。Cadherin-ll最早從原腸胚期僅在中胚層表達(dá)，至體節(jié)分化后僅 在生骨節(jié)表達(dá)，影響著成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的細(xì)胞排列、聚集及分離，顯示Cadherin-ll 在骨骼形成的凝聚中發(fā)揮重要功能。2005年Matsusaki等在生長(zhǎng)面的軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 Cadherin-ll的表達(dá)；2007年Agarwal等在小鼠的滑膜囊內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 Cadherin-ll的表達(dá)，表 明了 Cadherin-ll在軟骨形成中也起著重要作用。X線衍射晶體分析法確定了 Cad-11胞外 結(jié)構(gòu)域中Ed區(qū)編碼蛋白決定粘附的相互作用，即II型的識(shí)別特異性主要是在Ed區(qū)，Ed 也是鈣粘附蛋白單體的重要界面，介導(dǎo)了細(xì)胞粘附。
基于以上考慮，本發(fā)明將含有PHSRN和RGD基序的FNIII卜k)片段與Cadherin-ll的 胞外結(jié)構(gòu)域Ed.2的融合蛋白進(jìn)行生物支架材料的表面修飾，充分考慮粘附的"同嗜性" 和"異嗜性"，并兼顧種子細(xì)胞的粘附和成骨，建立組織工程生物材料的表面仿生微環(huán)境， 為組織工程骨和軟骨的構(gòu)建提供有力的支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種促進(jìn)骨和軟骨種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合的粘附
5分子的設(shè)計(jì)和應(yīng)用方法，它可在組織工程化骨、軟骨的構(gòu)建中使用，為生物支架材料的表 面仿生微環(huán)境的建立提供了一種有效技術(shù)方法。 本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下
本方法以含有PHSRN和RGD基序的纖連蛋白的FNIII7—K)片段與鈣粘附蛋白-ll的胞 外結(jié)構(gòu)域Ed.2的融合蛋白Cad-ll-Ed.2 /FNIII7-1Q，進(jìn)行生物支架材料的表面仿生微環(huán)境 建立，促進(jìn)種子細(xì)胞與組織工程生物支架材料的粘附，步驟如下
(1) 融合蛋白的構(gòu)建將含有PHSRN和RGD基序的FNlIl7-u)片段與成骨細(xì)胞特異性鈣 粘蛋白胞外結(jié)構(gòu)域Ed.2制備融合蛋白Cad-ll-Ed.2 /FNIII7—10，采用的是EC,-2- (GlySer) n -FNIII7—1G， (GlySer)n是中間所加的一段柔性肽，n為l一3的整數(shù)。經(jīng)生物信息學(xué)分析，該
融合蛋白中保留了 FNIII7-K)片段與成骨細(xì)胞特異性鈣粘蛋白表位特征，鈣離子結(jié)合區(qū)保持
穩(wěn)定，各自的空間結(jié)構(gòu)不受影響。融合蛋白具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列和SEQIDNO: 2的核苷酸序列。
(2) 融合蛋白的表達(dá)、純化及活性分析Cad-ll-Ed-2/FNHl7—K)表達(dá)重組體pet22b-fn-cad 轉(zhuǎn)化入改良大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)，通過(guò)氨節(jié)青霉素、卡那霉素、氯霉素和四環(huán)素4 種抗生素篩選。經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3h，取樣行SDS-PAGE電泳分析，分析重組蛋白表達(dá) 率和融合蛋白表達(dá)形式后，用Ni+珠一步法親和層析純化。
(3) 融合蛋白在生物支架材料的表面仿生微環(huán)境建立將具有生物活性的融合蛋白 Cad-ll-Ed.2/FNni7,進(jìn)行支架材料表面的附載，常用方式為涂層。本發(fā)明中所述涂層可 以采用浸涂和噴涂?jī)煞N方式進(jìn)行，對(duì)于多孔性骨和軟骨材料可以采用浸涂方式，以免造成 噴涂的浪費(fèi)，而對(duì)平面材料表面可以采用噴涂，防止因?yàn)榻慷鸬膾炷ぁ?br> (4) 種子細(xì)胞在生物支架材料表面的粘附將種子細(xì)胞種植在前述融合蛋白修飾的支架 材料上，進(jìn)行靜態(tài)或者動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞在生物支架材料表面的粘附。 本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明針對(duì)目前的組織工程骨和軟骨研究中種子細(xì)胞與生物支架材料的粘附問(wèn)題，進(jìn) 行一種促進(jìn)種子細(xì)胞與材料粘附的融合蛋白的制備，建立生物支架材料表面的仿生微環(huán)境。 通過(guò)制備含有PHSRN和RGD基序的纖連蛋白的FNIII7-H)片段與鈣粘附蛋白-11的胞外結(jié) 構(gòu)域Ed.2的融合蛋白Cad-ll-ECw /FNin7-10，經(jīng)過(guò)融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)、純化及活性 分析后，進(jìn)行生物支架材料的表面仿生微環(huán)境建立，將骨髓骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì) 胞進(jìn)行與經(jīng)過(guò)改建的生物材料表面復(fù)合，增強(qiáng)了種子細(xì)胞與材料的粘附率，在特定分化環(huán)
6境下，增強(qiáng)了種子細(xì)胞的成骨和成軟骨定向分化能力。本發(fā)明所提供的融合蛋白對(duì)生物支 架材料進(jìn)行必要的涂層和表面修飾，提高了表面生物活性，解決了生物支架材料親水性差， 細(xì)胞吸附力弱，不利于細(xì)胞在材料上的粘附，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和分化難題。本發(fā)明適 用于組織工程骨和軟骨產(chǎn)品的構(gòu)建及附載細(xì)胞的整形材料制作，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。


圖1示出了單獨(dú)的Cad-ll Ed.2的蛋白結(jié)構(gòu)模式圖； 圖2示出了單獨(dú)的FNlIl7-u)片段的蛋白結(jié)構(gòu)模式圖3示出了 Cad-ll-Ed.2 /FNIII7-k)融合蛋白結(jié)構(gòu)模式圖1為EC1; 2為EC2; 3為 (GlySer)3柔性肽；4為FN7; 5為FN8; 6為FN9; 7為FN1(); 8為PHSRN基序；9為RGD
基序；
圖4示出了 Cad-ll-Ed.2/FNni7-u)融合蛋白載體構(gòu)建模式圖5示出了 Cad-ll-￡(:1.2化]^1117-10融合蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果圖
1道為marker; 2-4道分別為PET22b、 PET22b/Cad-Ed.2、 PET22b/FN7.10、 PET22b/
Cad-ll-ECw /FNIII7—io未加IPTG誘導(dǎo)；6-9道分別為PET22b、 PET22b/Cad-EC"2、
PET22b/FN7.1()、 PET22b/ Cad-ll-EC^ /FNlH7_io加IPTG (終濃度0.4mM)誘導(dǎo)4h后。 圖6示出了 Cad-ll-EC^ /FNIII7—10融合蛋白抗HIS免'疫印跡:l為PET22b/Cad-ECL2上
清；2為PET22b/Cad-EC"2沉淀;3為PET22b/FNwo上清;4為PET22b/FNwo沉淀;5為PET22b/
Cad-ll-EC卜2 /FNIII7-k)上清;6為PET22b/ Cad-ll-ECw /FNIII7—io沉淀.
圖7示出了 Cad-ll-Ed.2/FNHl7—u)融合蛋白對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附的影響.
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的構(gòu)建過(guò)程 實(shí)施例1、 FNni7-u)片段和Cad—11的Ed.2片段的克隆
1.人FNIII7-k)片段的克隆
用總RNA提取試劑盒，從人成纖維細(xì)胞HFL-I(上海細(xì)胞所)中提取總RNA，按照
RT-PCR試劑盒的方法，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版進(jìn)行PCR獲得FN
ni7-lcCDNA，所用引物Pl和P2用寡核苷酸合成儀合成。
Pl(5，-3，) acgcgtcgacccattgtctccacca(25bp ，下劃線的堿基序列為Sail酶切位點(diǎn))P2(5，-3，):aaggaaaaaag￡gg￡￡g￡taatgttcggtaattaatgga (39bp，下戈'J線的堿基序歹iJ為Notl酶切 位點(diǎn))
PCR的方法為
① 50pl反應(yīng)體系包括10XPCR反應(yīng)緩沖液5pl，dNTP5Ml，Pl引物、P2引物各2pl， 模板cDNAlnl， pfu酶1.0^1，無(wú)DNA酶水34.5)xl。
② 擴(kuò)增條件為94度5分鐘一94度1分鐘，59度1分鐘，72度1.5分鐘，35循環(huán)一 72度IO分鐘。
通過(guò)凝膠電泳顯示一大小為1.4kb的條帶，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，克隆至 pGEM-T載體的多克隆位點(diǎn)后，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌，藍(lán)白斑篩選到陽(yáng)性克隆后，常規(guī) 方法抽提質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)獲得了與天然FNIIl7-u)片段cDNA序列一致的克隆。 2.人Cadherin-ll的胞外結(jié)構(gòu)域信號(hào)肽和Ed.2區(qū)的克隆
從正常骨折病人骨組織中分離正常人成骨細(xì)胞，經(jīng)純化和培養(yǎng)后，用總RNA提取試
劑盒從成骨細(xì)胞中提取總RNA，按照RT-PCR試劑盒的方法，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以獲得的
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版進(jìn)行PCR獲得Cadherin-ll胞外結(jié)構(gòu)域信號(hào)肽和Ed.2區(qū)片段的cDNA，
所用引物P3和P4用寡核苷酸合成儀合成。
P3(5，-3，) acgcgtcgacatgaaggagaactactgt(28bp，下劃線的堿基序列為Sail酶切位點(diǎn)) P4(5，-3，) aaggaaaaaagcggccgcctttggtgggttgtc (33bp，下劃線的堿基序列為Notl酶切位
點(diǎn))
PCR的方法為
① 50pl反應(yīng)體系包括10XPCR反應(yīng)緩沖液5pI，dNTP5^il，P3引物、P4引物各2^1， 模板cDNAlpl， pfo酶1.0^1，無(wú)DNA酶水34.5^1。
② 擴(kuò)增條件為94度5分鐘一94度1分鐘，61度1分鐘，72度1分鐘，35循環(huán)一72
度10分鐘。
通過(guò)凝膠電泳顯示一大小為0.8kb的條帶，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收?？寺≈?pGEM-T載體的多克隆位點(diǎn)后，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌，藍(lán)白斑篩選到陽(yáng)性克隆后，常規(guī) 方法抽提質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)獲得了與天然Cadherin-ll的胞外結(jié)構(gòu)域信號(hào)肽和ECw區(qū) 片段cDNA序列一致的克隆。
實(shí)施例2、本發(fā)明融合蛋白的表達(dá)
為了將FNlIl7,片段和Cad—11的Ed.2片段以融合蛋白形式從大腸桿菌分泌表達(dá)，如附 圖4所示，選擇利用分泌型載體pET-22b (+)作為載體(NovagenCorp. USA)。在該載體 的多克隆位點(diǎn)區(qū)域中，含有SalI酶切位點(diǎn)(179)和NotI酶切位點(diǎn)(166)，便于融合蛋白
8的克隆。為了使表達(dá)的兩個(gè)片段的空間構(gòu)象盡量與天然產(chǎn)物相近，以保持其最大的生物學(xué) 活性，在引物中設(shè)計(jì)引入親水性和低電荷效應(yīng)的氨基酸序列作為接頭(GlySer) n，因?yàn)楦?氨酸結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，對(duì)融合蛋白的立體構(gòu)象影響較小。利用重疊PCR方法，進(jìn)行帶有編碼含 (GlySer)n柔性接頭肽的Cad-ll-Ed.2/FNffl7—k)融合蛋白克隆，n可以是l-10的整數(shù)。當(dāng)n-3
時(shí)，可合成如下寡聚核苷酸引物，所用引物P5、 P6、 P7和P8用寡核苷酸合成儀合成。
P5(5，-3，) acgcgjeg^j^aaggagaactactgt(28bp)(黑色下劃線部分顯示的是上游引物中引 入SalI酶切位點(diǎn)，黑體斜字顯示是起始密碼子)
P6(5，-3，):tggtggagacaatggagaaccagaaccagaacc ctttggtgggttgtc(48bp)(黑色下戈'J線部分顯 示的是柔性接頭肽段(GlySer)3序列) 一
P7f5，-3，):gacaacccaccaaagggttctggttctggttct ccattgtctccacca(48bp)(黑色下劃線部分顯示 的是柔性接頭肽段(GlySer)3序列) 一
P8f5，-3，):aaggaaaaaagcggccgc似fltgttcggtaattaatgga (39bp)(黑色下劃線部分顯示的是下游 引物中引入NotI酶切位點(diǎn)，黑體斜字顯示是終止密碼子)
重疊延伸PCR.-
混合此4個(gè)長(zhǎng)片段寡核苷酸后，將實(shí)施例1構(gòu)建的FNIIIwo PCR產(chǎn)物和Cad-ll PCR 產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第一次PCR，把第一次PCR產(chǎn)物作為模板，使用兩末端引物繼續(xù)進(jìn)行 第二次PCR.擴(kuò)增條件為第一次PCR:①94度5分鐘；②94度1分鐘，68度1分鐘， 72度2分鐘，IO循環(huán)；第二次PCR:①94度5分鐘；②94度1分鐘，55度1分鐘，72 度2分鐘，25循環(huán)；③72度10分鐘。用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的結(jié)果。
PCR擴(kuò)增后，在cDNA的5' —端(Cad-ll片段)引入.一個(gè)Sall，同時(shí)在3'端(FNm7.10 片段)引入NotI位點(diǎn)。二者之間為柔性接頭肽段(GlySer)3序列。通過(guò)凝膠電泳分析反應(yīng) 物顯出一預(yù)期大小(2.24kb)的條帶，PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收。用Sail 和NotI酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，與用SalI和Notl酶切酶切后的pET-22b (+)載體連 接(實(shí)驗(yàn)中的pfu酶、內(nèi)切酶、連接酶、試劑盒等購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公 司和北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)，形成pET-22b (+) /Cad-ll-Ed.2/FNIIl7-H)。 DNA測(cè)序結(jié)果表明序列正確。將質(zhì)粒pET-22b (+) / Cad-ll-Ed-2/FNlIl7-u)轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌 株Rosetta-gami(DE3)(德國(guó)Merck公司)，獲得pET-22b ( + ) / Cad-ll-EQ-2 /FNlIIno/ Rosetta-gami(DE3)表達(dá)菌種。融合蛋白Cad-ll-Ed.2/FNin7-10的核苷酸序列如SEQIDNO: 2 所示，其具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列。SEQIDNO: 1中，129-131氨基酸(Gin-Ala-Vol) 是Cad-ll-Ed.2片段特異性結(jié)合區(qū)，決定著粘附特性；508-512氨基酸(PHSRN基序)和 625-627氨基酸(RGD基序)是FNm7-1()的重要的特異性結(jié)合區(qū)。實(shí)施例3、本發(fā)明融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 將鑒定正確的陽(yáng)性克隆菌株pET-22b ( + ) / Cad-11-EC1-2 /FNIII7 — 10/ Rosetta-gami (DE3)，接種到含有35 u g/mL氯霉素、四環(huán)素12. 5 y g/raL和卡那霉素100 u g/mL的5 mL LB培養(yǎng)基中，在37 。C以180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，.次日以l : 1 OOO轉(zhuǎn)接，振蕩培養(yǎng) 至A600值達(dá)0. 6時(shí)加入IPTG至終濃度0. 5 mmol/L， 30度。C， 400rpm/min誘導(dǎo)表達(dá)3h。取適 量菌液在4t:條件下，5000 r/rain條件下離心5 min，菌體沉淀用l mL細(xì)菌裂解液(50 mmol/L Tris2HCl， pH=7.2， 50 mmol/L NaCl)重懸。重懸液用超聲法破碎細(xì)胞，裂解菌體再在13 000 r/min條件下離心5min。分別取菌體裂解上清液(可溶蛋白部分)和沉淀重懸液(不可溶蛋白 部分)各10uL， SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。用灰度掃描分析，表達(dá)的融合蛋白約占 菌體總蛋白的43.7%。
包涵體的純化如下(1)超聲破碎獲得包涵體:用裂解緩沖液(50mmol/LTris HC1, 1 mmol/LEDTA， 100 mmol/L NaCl)重懸收集的細(xì)菌沉淀，溶菌酶冰上作用2 h，冰浴超聲 裂菌15min。將超聲破碎后的菌體懸液以5 000r/min離心5min。重復(fù)上述步驟3、 4次， 至離心后的上清液清亮不粘稠為止。收集上清液，同時(shí)準(zhǔn)備不同濃度的尿素洗漆沉淀。(2) 洗滌包涵體。將沉淀用4 mol/L尿素洗滌，4°C ， 12 000 r/min離心20min，沉淀用8 mol/L 尿素溶液重懸，4'C下靜置溶解。用Ni2+-NTA柱親和層析純化所溶解的沉淀，分別使用 濃度為25和300mmol/L的咪唑進(jìn)行洗脫。將純化后的蛋白進(jìn)行梯度復(fù)性，最后以pH7.0 的水透析，凍干后以10ml生理鹽水復(fù)溶，用SDS-PAGE分析。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析， 融合蛋白主要以不溶性包涵體的形式存在，細(xì)菌的裂解上清中(可溶性表達(dá)部分)僅存在 微量目的蛋白?；叶葤呙璺治龅鞍准兌?5%。
融合蛋白的Western blot分析蛋白純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，將融合蛋白 轉(zhuǎn)移至NC膜上，5g/L脫脂奶粉室溫封閉lh，加入抗His單抗，4'C孵育過(guò)夜。PBST洗 膜4次，每次10 min，再加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG， 37'C溫育1 h， PBST和PBS先 后洗膜4次后，ECL化學(xué)發(fā)光顯色。如圖6所示在分子量75000Da處有一條帶，與融合蛋 白預(yù)期分子量相符，目的蛋白與抗His標(biāo)簽抗體有良好的反應(yīng)性。
實(shí)施例4、本發(fā)明融合蛋白的活性鑒定
將純化的融合蛋白稀釋成不同的濃度，以0， 100, 200, 400， 800jag/ml的濃度，分別
10鋪襯在96孔培養(yǎng)板中，4度過(guò)夜，1%BSA封閉2h，并以單純的FNIII7-1()、單純的Cad-l 1-Ed.2 蛋白及未處理作對(duì)照。按常規(guī)方法，分別進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，用含10MFBS的 培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)1.0X104個(gè)/孔接種在前述的96孔培養(yǎng)板。置于37°C、 5%(302培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)3h。用PBS緩沖液進(jìn)行輕沖培養(yǎng)板，然后于高倍鏡下計(jì)數(shù)培養(yǎng)板中的細(xì)胞數(shù)量。也 可通過(guò)MTT法，對(duì)支架種植細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)調(diào)整細(xì)胞密度至5.0Xl(^個(gè)/cm2 ，滴加至涂 層后培養(yǎng)板，分別在37'C、 5%C02培養(yǎng)箱孵育4h后作MTT檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比， 如圖7所示，融合蛋白鋪襯可以明顯提高前述細(xì)胞的粘附，其中100-200pg/ml作用最佳 (P<0.01))。當(dāng)種子細(xì)胞為成骨細(xì)胞或者軟骨細(xì)胞時(shí)，也獲得相類似的結(jié)果。這表明大腸 桿菌表達(dá)的融合蛋白具有一定的活性。
實(shí)施例5、融合蛋白在生物支架材料的表面仿生微環(huán)境建立
將具有生物活性的純化的融合蛋白Cad-ll-Ed.2/FNlIl7-H)進(jìn)行支架材料表面的附載， 常用方式為涂層。本發(fā)明中所述涂層可以采用浸涂和噴涂?jī)煞N方式進(jìn)行，對(duì)于多孔性骨和 軟骨材料可以采用浸涂方式，以免造成噴涂的浪費(fèi)，而對(duì)平面材料表面可以采用噴涂，防 止因?yàn)榻慷鸬膾炷?。如在多孔雙相鈣磷陶瓷(BCP)材料采用浸涂方式先將支架 材料與10mg/ml的交聯(lián)劑硫磺基-6 (3' -2-吡啶二硫-丙酰胺)-己酸酉旨(Sulfo-LC-SPDP)溶液 室溫反應(yīng)36h，再與200pg/ml的融合蛋白溶液反應(yīng)36h，三蒸水漂洗5次，4。C保存。SEM 觀察BCP表面形態(tài)，融合蛋白Cad-ll-Ed.2/FNlIl7-u)進(jìn)行支架材料表面的附載，與單純的 FNniwo、單純的Cad-l卜Ed.2蛋白附載的材料及未處理的材料相比，支架材料的表面形態(tài) 均無(wú)明顯不同，表明本發(fā)明的融合蛋白在支架材料的改性，不會(huì)改變材料的物理形態(tài)。這 對(duì)于經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)和制備的具有確定的分化誘導(dǎo)性的支架材料而言，是十分重要的。不會(huì)對(duì)生 物支架材料的孔隙率、孔隙大小、泡孔均勻性及泡孔間連續(xù)性產(chǎn)生影響。同時(shí)由于在支架 表面植入特殊位點(diǎn)與細(xì)胞起特異性反應(yīng)，對(duì)不同類型細(xì)胞起選擇粘附的作用。其中，F(xiàn)NIII 7.Kj的PHSRN和RGD基序可以提供對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞或者軟骨細(xì)胞的特異性 粘附；Cadherin-ll的Ed.2既可以提供細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-材料間的粘附，也可提供使種子細(xì) 胞分別向成骨或者成軟骨定向分化的分子機(jī)制。用本發(fā)明所提供的融合蛋白進(jìn)行涂層的材 料，能使細(xì)胞有效地粘附和進(jìn)行生命活動(dòng)。通過(guò)在材料表面引入能促進(jìn)細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)和 誘導(dǎo)分化作用的蛋白質(zhì)，在材料表面構(gòu)建仿生微環(huán)境。實(shí)施例6、種子細(xì)胞在生物支架材料表面的粘附
以BCP為例，將種子細(xì)胞種植在實(shí)施例5中提及的融合蛋白修飾的支架材料上，進(jìn)行靜 態(tài)或者動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞在生物支架材料表面的粘附。將分別經(jīng)融合蛋白、單純的FNIII 7-10、單純的Cad-ll-EQ.2蛋白及未處理的BCP材料作對(duì)照。在直徑0.5cm、厚度0.3cm的圓 柱形BCP材料中，調(diào)整種子細(xì)胞密度至5.0Xl()S個(gè)/cm2，每個(gè)樣品滴加細(xì)胞懸液0.1ml，在 37°C+5%C02培養(yǎng)箱孵育24h，加培養(yǎng)基0.5 ml輕輕沖洗材料，使未粘附細(xì)胞落在培養(yǎng)板 底部。取出材料，0.25%胰酶充分消化所粘附細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過(guò)融 合蛋白涂層的材料表面粘附的細(xì)胞量顯著性高于其它對(duì)照(PO.Ol)。
種植7d后，通過(guò)DNA含量分析樣品中細(xì)胞量通過(guò)反復(fù)凍融法使細(xì)胞裂解，以去離 子水沖洗使細(xì)胞脫離材料，離心收集細(xì)胞成分，加入lmlTRIZOL試劑充分研磨，收集液體 至1.5mlEP管，室溫靜置5分鐘，4°C 12 OOOXg離心lO分鐘移除不溶性物質(zhì)；加入氯仿O. 2ml，搖晃混勻，室溫靜置3分鐘，4'C12 000Xg離心15分鐘；上層水相物作總RNA提取， 余下中間相和有機(jī)相加無(wú)水乙醇0.3m成分混勻，室溫靜置3分鐘，4°C 2 000Xg離心5分鐘; 棄上清，沉淀用0.1mol/L檸檬酸鈉溶液反復(fù)洗滌，4°C 2 000Xg離心5分鐘;棄上清，加入 75。/。乙醇1.5ml， 4'C 2 000Xg離心5分鐘，風(fēng)干后加入8mmol/L氫氧化鈉溶液(pH =8. 0) 500 yl溶解，4°C 12 000Xg離心10分鐘，取上清液，紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm吸光度，計(jì) 算DNA含量。結(jié)果顯示，在經(jīng)過(guò)融合蛋白涂層的材料表面粘附的細(xì)胞量顯著性高于其它對(duì) 照(PO.Ol)。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，表征支架材料的細(xì)胞相容性。可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能 進(jìn)入支架材料的孔隙中生長(zhǎng)，且分泌出大量的細(xì)胞外基質(zhì)，說(shuō)明經(jīng)本發(fā)明提供的融合蛋白 涂層的材料生物相容性較好，能為細(xì)胞提供一個(gè)模擬生物體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境以供其貼附、生 長(zhǎng)、增殖和分化。
取融合蛋白修飾的BCP材料，以及前述的單純的FNlIIwo、單純的Cad-ll-Ed.2蛋白 及未處理的BCP材料作對(duì)照，置12孔培養(yǎng)板中。取第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密 度為5.0X105個(gè)/cm2，接種在材料上，用含成骨補(bǔ)充成分(含10'SM地塞米松、10'31^卜甘 油磷酸、50mg/L抗壞血酸)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)詹第7d、第14d、第21d各取出3個(gè) 各組材料，PBS沖洗3次，胰酶消化細(xì)胞，收集在Ep管中，加入lml裂解液(含25mMTris、 015%TritonX2100)，反復(fù)吹打，并置37'C過(guò)夜，鏡下觀察已無(wú)完整細(xì)胞，按ALP試劑盒
(南京建成公司)說(shuō)明操作，520nm處測(cè)吸光度，計(jì)算各管中ALP活性。結(jié)果顯示在經(jīng)過(guò) 本發(fā)明所提供融合蛋白涂層的材料表面粘附的細(xì)胞，其ALP顯著性高于其它對(duì)照(PO.Ol)。
12這提示種子細(xì)胞在本發(fā)明所提供融合蛋白涂層的材料表面，具有明確的成骨分化效應(yīng)。
取融合蛋白修飾的BCP材料，以及前述的幾種材料作為對(duì)照，置12孔培養(yǎng)板中。取第 三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0Xl()S個(gè)/cm2，接種在材料上，添加無(wú)血清軟骨 誘導(dǎo)液進(jìn)行單層細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)(含10ng/mlTGF-(51， O.lpM地塞米松，50pg/ml抗壞血酸， lxITS+l)。分別在培養(yǎng)后第7d、第14d、第21d各取出3個(gè)各組材料，PBS沖洗3次，胰酶消 化細(xì)胞，收集在Ep管中，提取細(xì)胞總RNA。采用一步法RT-PCR法檢測(cè)可聚蛋白多糖
(aggrecan) mRNA表達(dá)，引物由北京賽百盛公司合成，序列為引物l:5，-cgc ttg cca ggg gga gtt gta ttc曙3 ，；弓I物2 : 5 ， -ggaggc cag ggt agc att ttg agc-3 ， ； 405bp) ， GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng) 條件為:50。C， 30min; 15°C， 15min; 94°C, lmin;退火(aggrecan為55。C)， 45s; 72°C， lmim30 循環(huán)；72°C， 10min。產(chǎn)物用2.0 %瓊脂糖凝膠電泳，圖象分析軟件進(jìn)行條帶灰度分析。結(jié) 果顯示在經(jīng)過(guò)本發(fā)明所提供融合蛋白涂層的材料表面粘附的細(xì)胞，其aggrecan表達(dá)量顯著 性高于其它對(duì)照(PO.Ol)。這說(shuō)明種子細(xì)胞在本發(fā)明所提供融合蛋白涂層的材料表面，呈 現(xiàn)明確的成軟骨分化效應(yīng)。序列表
〈110〉中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
<120〉纖連蛋白與鈣粘附蛋白-11的融合蛋白、制備方法及應(yīng)用
<160>2
<210>1
<211〉641
<212>PRT <213〉人屬人
〈400>1
Met Lys Glu
1
Leu Cys His
Pro Ser Phe 35
Gin Arg Ser 50
Glu Tyr Thr 65
lie Asp Ser
Ala Gly Thr
Thr Lys Thr 115
Gin Ala Val
130 Phe lie Val 145
His Glu Thr
Ser Val lie
Asn Ser Ala 195
Ser Val Glu
210 Asp Arg Glu
(Homo sapiens)
Asn Tyr Cys Leu 5
Ser His Ala Phe 20
His Gly His His
Lys Arg Gly Trp 55
Gly Pro Asp Pro 70
Gly Asp Gly Asn 85
lie Phe Val lie 100
Leu Asp Arg Glu
Asp Arg Asp Thr 135
Lys Val Gin Asp 150
Tyr His Ala Asn 165
Gin Val Thr Ala 180
Lys Leu Val Tyr
Ala Gin Thr Gly 215
Ala Lys Glu Glu
Gin Ala Ala Leu Val Cys Leu Gly Met
10 15 Ala Pro Glu Arg Arg Gly His Leu Arg
25 30 Glu Lys Gly Lys Glu Gly Gin Val Leu 40 45 Val Trp Asn Gin Phe Phe Val lie Glu 60
Val Leu Val Gly Arg Le'u His Ser Asp
75 80 lie Lys Tyr lie Leu Ser Gly Glu Gly
90 95 Asp Asp Lys Ser Gly Asn lie His Ala
105 110 Glu Arg Ala Gin Tyr Thr Leu Met Ala 120 125 Asn Arg Pro Leu Glu Pro Pro Ser Glu 140
lie Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe Leu 155 160 Val Pro Glu Arg Ser Asn Val Gly Thr
170 175 Ser Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly
185 190 Ser lie Leu Glu Gly Gin Pro Tyr Phe 200 205 lie lie Arg Thr Ala Leu Pro Asn Met 220
Tyr His Val Val lie Gin Ala Lys Asp225 230 235
Met Gly Gly His Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr
245 250 Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Lys
260 265 Ser Pro Leu Ser Pro Pro Thr Asn Leu His Leu
275 280 Thr Gly Val Leu Thr Val Ser Trp Glu Arg Ser
290 295 Thr Gly Tyr Arg lie Thr Thr Thr Pro Thr Asn 305 310 315
Ser Leu Glu Glu Val Val His Ala Asp Gin Ser
325 330 Asn Leu Ser Pro Gly Leu Glu Tyr Asn Val Ser
340 345 Asp Asp Lys Glu Ser Val Pro lie Ser Asp Thr
355 360 Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie
370 375 Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp 385 390 395
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp
405 410 lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr
420 425 Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr
435 440 Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu
450 455 lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 465 470 475
Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg lie
485 490 His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val
500 505 Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr
515 520 lie Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro
530 535 Gin Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu 545 550 555
Thr Pro Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Asp Ala
565 570 Arg Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly
240
Thr Lys Val Thr lie 255
Gly Ser Gly Ser Gly 270
Glu Ala Asn Pro Asp 285
Thr Thr Pro Asp lie 300
Gly Gin Gin Gly Asn 320
Ser Cys Thr Phe Asp 335
Val Tyr Thr Val Lys 350
lie lie Pro Ala Val 365
Gly Pro Asp Thr Met 380
Leu Thr Asn Phe Leu 400
Val Ala Glu Leu Ser 415
Asn Leu Leu Pro Gly 430
Glu Gin His Glu Ser 445
Asp Ser Pro Thr Gly 460
Thr Val His Trp lie 480
Arg Hfs His Pro Glu 495
Pro His Ser Arg Asn 510
Glu Tyr VaJ Val Ser 525
Leu Leu lie Gly Gin 540
Glu Val Val Ala Ala 560
Pro Ala Val Thr Val 575
Gly Asn Ser Pro Val
15580 585 590
Gin Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly
595 600 605
Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly
610 615 620
Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 625 630 635 640
Thr 641
<210>2
<211>1954
<212>DNAT
<213>人屬人(Homo sapiens) <400>2
ACGCGTCGAC ATGAAGGAGA ACTACTGTTT ATACCACAGC CAGGCGTTTG CTCTGGAGCG ACACCATGAG AAGGGCAAGG AGGGGCAGGT GAACCAATTC TTTGTGATAG AAGAGTACAC TCATTCTGAC ATTGACTCCG GTGATGGGAA GGGAACCATT TTTGTGATTG ATGACAAATC CCGAGAGGAG AGAGCCCAGT ACACACTGAT ACCACTGGAG CCACCTTCAG AATTCATTGT AGAGTTTCTG CATGAAATCT ATCATGCCAA AGTTATCCAA GTGACAGCCT CTGATGCAGA AGTGTATAGC ATCCTTGAAG GACAACCCTA CAGGACAGCC CTTCCCAATA TGGACAGAGA GGCCAAGGAC ATGGGTGGAC ACATGGGTGG TCTGACTGAT GTCAACGACA ACCCACCAAA ACCAACAAAC TTGCATCTGG AGGCAAACCC GAGGAGCACC ACCCCAGACA TTACTGGTTA GCAGGGAAAT TCTTTGGAAG AAGTGGTCCA CCTGAGTCCC GGCCTGGAGT ACAATGTCAG TGTCCCTATC TCTGATACCA TCATCCCAGC CAACATTGGT CCAGACACCA TGCGTGTCAC CAACTTCCTG GTGCGTTACT CACCTGTGAA TTCTCCTTCA GACAATGCAG TGGTCTTAAC GAGTGTCTCC AGTGTCTACG AACAACATGA AGGTCTTGAT TCCCCAACTG GCATTGACTT GCACTGGATT GCTCCTCGAG CCACCATCAC CTTCAGTGGG AGACCTCGAG AAGATCGGGT
ACAAGCTGCCCTGGTGTGCCTGAGCATGCT60
ACGAAGCCACCTGCATCCCTCTTTCCATGG120
GCTGCAACGCTCCAAGAGAGGCTGGGTCTG180
CGGGCCTGACCCTGTGCTGGTGGGCAGGCT240
CATTAAATACATTCTCTCAGGTGAAGGAGC300
AGGGAACATTCATGCCACCAAGACATTGGA360
GGCTCAGGCGGTGGACAGGGACACCAACAG420
taaggtccaggacatt:aatgacaaccctcc■
TGTGCCTGAGAGGTCCAATGTGGGAACATC540
TGATCCCACCTATGGAAATAGTGCCAAGTT600
TTTCTCGGTGGAGGCCCAAACAGGTATCAT660
AGCCAAGGAGGAGTACCACGTGGTGATCCA720
ACTCTCAGGGACAACCAAAGTGACGATCAC780
GGGTTCTGGTTCTGGTTCTCCATTGTCTCC840
TGACACTGGAGTGCTCACAGTCTCCTGGGA900
TAGAATTACCACAACCCCTACAAACGGCCA960
TGCTGATCAGAGCTCCTGCACTTTTGATAA1020
TGTTTACACTGTCAAGGATGACAAGGMAG1080
TGTTCCTCCTCCCACTGACCTGCGATTCAC1140
CTGGGCTCCACCCCCATCCATTGATTTAAC1200
AAATGAGGAAGATGTTGCAGAGTTGTCAAT1260
AAATCTCCTGCCTGGT-ACAGAATATGTAGT1320
GAGCACACCTCTTAGAGGAAGACAGAAAAC1380
TTCTGATATTACTGCCAACTCTTTTACTGT1440
TGGCTACAGGATCCGCCATCATCCCGAGCA1500
GCCCCACTCTCGGAATTCCATCACCCTCAC1560
16CAACCTCACT CCAGGCACAG AGTATGTGGT CAGCATCGTT GCTCTTAATG GCAGAGAGGA 1620
AAGTCCCTTA TTGATTGGCC AACAATCAAC AGTTTCTGAT GTTCCGAGGG ACCTGGAAGT 1680
TGTTGCTGCG ACCCCCACCA GCCTACTGAT CAGCTGGGAT GCTCCTGCTG TCACAGTGAG 1720
ATATTACAGG ATCACTTACG GAGAAACAGG AGGAAATAGC CCTGTCCAGG AGTTCACTGT 1800
GCCTGGGAGC AAGTCTACAG CTACCATCAG CGGCCTTAAA CCTGGAGTTG ATTATACCAT 1860
CACTGTGTAT GCTGTCACTG GCCGTGGAGA CAGCCCCGCA AGCAGCAAGC CAATTTCCAT 1920
TAATTACCGA ACATAAGCGG CCGCAAGGAA AAAA 195權(quán)利要求
1、一種纖連蛋白與鈣粘附蛋白-11融合蛋白，所述融合蛋白采用含有PHSRN和RGD基序的FNIII7-10片段與鈣粘附蛋白-11制備融合蛋白，進(jìn)行生物支架材料的表面修飾，建立骨和軟骨組織工程生物材料的表面仿生微環(huán)境；所述融合蛋白命名為Cad-11-EC1-2/FNIII7-10，其具有SEQ ID NO1的氨基酸序列和SEQ ID NO2的核苷酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的Cad-ll-Ed.2/FN1117—u)采用將 含有PHSRN和RGD基序的FNIII7—1()片段與成骨細(xì)胞特異性鈣粘蛋白胞外結(jié)構(gòu)域Ed.2制 備融合蛋白，采用的是Ed.2-(GlySer)n-FNIIl7-K)， (GlySer)n是中間所加的一段柔性肽， n為l一10的整數(shù);SEQIDNO: 1中，129-131氨基酸(Gln-Ala-Val)是Cad-ll-Ed.2片段 特異性結(jié)合區(qū)；508-512氨基酸(PHSRN基序)和625-627氨基酸(RGD基序)是FNIII7-U)的特異性結(jié)合區(qū)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述n為3。
4、 權(quán)利要求1或2所述纖連蛋白與鈣粘附蛋白-11融合蛋白的制備方法，步驟如下-(1)融合蛋白的構(gòu)建以含有PHSRN和RGD基序的FNHl7—u)片段與成骨細(xì)胞特異性鈣粘蛋白胞外結(jié)構(gòu)域EQ.2制備融合蛋白Cad-ll-Ed.2/FNni7—K)，采用的是Ed.2-(GlySer)n-FNniwo，(GlySer)n是中間所加的一段柔性肽,n為1—10的整數(shù)，融合蛋白具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列和SEQID NO: 2的核苷酸序列；(2)融合蛋白的表達(dá)、純化及活性分析將Cad-ll-Ed.2 /FNIII7-K)表達(dá)重組體pet22b-fn-cad轉(zhuǎn)化入改良大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)，通過(guò)氨節(jié)青霉素、卡那霉素、氯霉素和四環(huán)素4種抗生素篩選，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3h，取樣行SDS-PAGE電泳分析，分析重組蛋白表達(dá)率和融合蛋白表達(dá)形式后，用Ni+珠一步法親和層析純化。
5、 權(quán)利要求1或2所述融合蛋白的應(yīng)用，其特征在于，將所述融合蛋白Cad-ll-ECw/FN 1117-1()進(jìn)行生物支架材料的表面仿生微環(huán)境建立，方法是以涂層的方式進(jìn)行支架材料表面 的附載；將種子細(xì)胞種植在前述融合蛋白修飾的生物支架材料上，進(jìn)行靜態(tài)或者動(dòng)態(tài)培養(yǎng)， 促進(jìn)細(xì)胞在生物支架材料表面的粘附。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述融合蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述的生物支架材料為人工合 成可降解聚合物聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯、聚酯尿垸、聚酸酐亞胺共聚物、聚羥丁酯 及其共聚物或聚羥基丁酸已酯，或?yàn)樘烊桓叻肿泳酆衔锬z原、纖維蛋白、殼聚糖、藻酸鹽 或天然珊瑚，或?yàn)橛缮鲜龆喾N材料構(gòu)成的復(fù)合材料。
7、根據(jù)權(quán)利要求5所述融合蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述種子細(xì)胞，對(duì)于組織工程骨是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或成骨細(xì)胞；對(duì)于組織工程軟骨是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述融合蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述涂層采用浸涂或噴涂?jī)煞N方式進(jìn)行，對(duì)于多孔性骨和軟骨材料采用浸涂方式，對(duì)平面材料表面可以采用噴涂。
9、 根據(jù)權(quán)利要求5所述融合蛋白的應(yīng)用，其特征在于生物支架材料的表面修飾，是指粘附蛋白在材料表面的種植或交聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種纖連蛋白與鈣粘附蛋白-11的融合蛋白、制備方法及應(yīng)用，目的是提供一種可以促進(jìn)骨和軟骨種子細(xì)胞與支架材料的粘附的融合蛋白，屬于組織工程領(lǐng)域。所述融合蛋白采用將含有PHSRN和RGD基序的FNIII_7-10片段與鈣粘附蛋白-11胞外結(jié)構(gòu)域EC_1-2制備融合蛋白，進(jìn)行生物支架材料的表面修飾，充分考慮種子細(xì)胞的粘附的“同嗜性”和“異嗜性”，并兼顧種子細(xì)胞的粘附和成骨或成軟骨分化，建立骨和軟骨組織工程生物材料的表面仿生微環(huán)境。本發(fā)明適用于組織工程骨和軟骨產(chǎn)品的構(gòu)建及附載細(xì)胞的整形材料制作。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101463090SQ200910103100
公開(kāi)日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2009年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月20日
發(fā)明者強(qiáng) 向, 躍 周, 應(yīng)大君, 瑗 張, 波 楊, 董世武 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)