專利名稱：尿?qū)诱尺B蛋白在制備診斷膀胱癌的醫(yī)療器械中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尿?qū)诱尺B蛋白的應(yīng)用，具體地說(shuō)，是尿?qū)诱尺B蛋白在制備診斷膀胱癌的醫(yī)療器械中的應(yīng)用，以及一種膀胱癌診斷試紙及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
膀胱尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，是男性第6、女性第10高發(fā)腫瘤。首次治療后復(fù)發(fā)率高達(dá)80%。因此，術(shù)后隨訪是治療的重要內(nèi)容。目前膀胱癌的診斷主要依靠尿道膀胱鏡+尿脫落細(xì)胞檢查。但膀胱鏡檢查創(chuàng)傷大、費(fèi)用高，有一定的并發(fā)癥，能堅(jiān)持按照醫(yī)囑檢查的只有患者40%左右；且膀胱鏡檢查不易發(fā)現(xiàn)早期、特殊部位的膀胱癌病灶。尿脫落細(xì)胞檢查雖然是一種無(wú)創(chuàng)性檢查，但其診斷的靈敏度只有30%左右，且受檢查者的影響因素較大，并不是一種理想的診斷方法。臨床上迫切需要一種靈敏度和特異度較高的無(wú)創(chuàng)性診斷方法。腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所處的環(huán)境，主要由細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞組成。腫瘤微環(huán)境提供了腫瘤快速生長(zhǎng)所需要的“土壤”；同時(shí)腫瘤侵襲、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中伴隨著腫瘤微環(huán)境成分及結(jié)構(gòu)的變化?；?basallamina, BM)是由多種纖維蛋白構(gòu)成的復(fù)雜的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，位于上皮細(xì)胞基底面與結(jié)締組織的膜狀結(jié)構(gòu)，是ECM的重要組成部分。BM不僅對(duì)組織細(xì)胞起支持連接作用，同時(shí)具有滲透性屏障的作用，是物質(zhì)通透的半透膜，并調(diào)節(jié)多種分子及細(xì)胞的活動(dòng)。基膜是由不同蛋白纖維組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要成分有層粘連蛋白(laminin，LN)、IV型膠原、巢蛋白、肌腱蛋白、鈣結(jié)合蛋白、硫酸肝素糖蛋白等。LN在基膜的形成中起重要作用，因?yàn)長(zhǎng)N具有許多不同的結(jié)構(gòu)域，其中具有與其他蛋白復(fù)合物結(jié)合的特殊位點(diǎn)。此外，LN能夠同細(xì)胞表面受體結(jié)合，也能夠同其他的LN分子以及同其他的糖蛋白，包括基膜中其他的一些成份結(jié)合。更重要的是，LN同IV型膠原結(jié)合，形成分隔的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成的基膜通過(guò)LN與細(xì)胞表面受體緊密結(jié)合，將基膜與覆蓋的細(xì)胞緊密結(jié)合起來(lái)。因此，LN不僅是基膜的主要成分，也是基膜的組織者，而IV型膠原則是基膜的網(wǎng)狀鋼架。層粘連蛋白(laminin, LN)主要存在于基膜結(jié)構(gòu)中，是基膜所特有的非膠原糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為820kDa，含13-15%的糖，有三個(gè)亞單位，即重鏈(a鏈，400kDa)和^ I (215kDa)、^ 2 (205kDa)兩條輕鏈。結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)不對(duì)稱的十字形，由一條長(zhǎng)臂和三條相似的短臂構(gòu)成。這四個(gè)臂均有棒狀節(jié)段和球狀的末端域。P I和P2短臂上有兩個(gè)球形結(jié)構(gòu)域，a鏈上的短臂有三個(gè)球形結(jié)構(gòu)域，其中有一個(gè)結(jié)構(gòu)域同IV型膠原結(jié)合，第二個(gè)結(jié)構(gòu)域同肝素結(jié)合，還有同細(xì)胞表面受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。正是這些獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)使LN作為一個(gè)橋梁分子，介導(dǎo)細(xì)胞同基膜結(jié)合。
LN的主要功能就是作為基膜的主要結(jié)構(gòu)成分對(duì)基膜的組裝起關(guān)鍵作用，在細(xì)胞表面形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并將細(xì)胞固定在基膜上。LN還有許多其他的作用，如在細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中刺激細(xì)胞粘著、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。LN還能夠刺激胚胎中神經(jīng)軸的生長(zhǎng)，并促進(jìn)成年動(dòng)物的神經(jīng)損傷后重生長(zhǎng)和再生。如同纖粘連蛋白，細(xì)胞外的LN能夠影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和分化。LN在原生殖細(xì)胞的遷移中起關(guān)鍵作用?；づc腫瘤的關(guān)系比較復(fù)雜?；ご嬖谟谏掀せ撞考澳[瘤細(xì)胞間，支持和營(yíng)養(yǎng)腫瘤組織，同時(shí)參與腫瘤細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附增殖，與腫瘤的生長(zhǎng)及惡化密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)LN的表達(dá)明顯上調(diào)，但LN也能促進(jìn)間質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)， MMP能降解基膜成分，從而有利于腫瘤細(xì)胞向周圍組織的浸潤(rùn)及血管芽的新生。有研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌進(jìn)展過(guò)程中伴隨基膜的破壞，膀胱癌組織中基膜的破壞與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，基膜中LN和IV型膠原的表達(dá)可作為腫瘤生物學(xué)特性的預(yù)后指標(biāo)。因?yàn)榘螂装┘?xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中LN表達(dá)上調(diào)，同時(shí)伴隨腫瘤進(jìn)展、基膜破壞，LN降解增多，我們認(rèn)為，膀胱癌病人尿液中LN水平可能增高，尿LN有可能成為膀胱癌腫瘤標(biāo)記物。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN101634655A公開(kāi)了一種快速診斷膀胱癌的FN試紙及其應(yīng)用，包括底板、樣品墊、金膠墊、硝酸纖維膜層和吸水紙層，所述的金膠墊中含有膠體金與抗尿纖維連接蛋白抗體結(jié)合的金標(biāo)抗體復(fù)合物，用于快速診斷膀胱癌。孫方滸等采用免疫組化方法觀察膀胱移行細(xì)胞癌中組織蛋白酶D和層粘連蛋白(LN)的表達(dá)，提出LN表達(dá)可作為腫瘤生物學(xué)特性的預(yù)后指標(biāo)(詳見(jiàn)孫方滸等.組織蛋白酶D和層粘連蛋白在膀胱癌中的表達(dá)及意義.中華泌尿外科雜志，2002，23(4): 237-237.)。但是關(guān)于尿?qū)诱尺B蛋白在制備診斷膀胱癌的醫(yī)療器械中的應(yīng)用目前還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種尿?qū)诱尺B蛋白LNl的應(yīng)用。本發(fā)明的第二個(gè)目的是，提供一種診斷膀胱癌的LNl試紙。本發(fā)明的第三個(gè)目的是，提供一種診斷膀胱癌的LNl試紙的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是尿?qū)诱尺B蛋白LNl在制備診斷膀胱癌的醫(yī)療器械中的應(yīng)用。所述的膀胱癌是膀胱尿路上皮癌，所述的醫(yī)療器械是診斷試紙或試劑盒，所述的醫(yī)療器械的診斷樣品是尿液。所述的醫(yī)療器械的診斷闕值是尿LNl濃度10-100ng/ml。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種診斷膀胱癌的LNl試紙，包括底板、樣品墊、金膠墊、硝酸纖維膜層和吸水紙層，所述的底板上依次覆蓋樣品墊、金膠墊、硝酸纖維膜層和吸水紙層，所述的硝酸纖維膜上含有牛血清白蛋白-尿LNl偶聯(lián)物的測(cè)試線和抗鼠二抗的質(zhì)控線，所述的金膠墊上含有膠體金與抗尿LNl抗體結(jié)合形成的金標(biāo)抗尿LNl抗體復(fù)合物。所述的試紙的診斷樣品是尿液，所述的試紙的檢測(cè)闕值為尿LNl濃度IO-IOOng/ml o所述的硝酸纖維膜上有兩條測(cè)試線，所述的測(cè)試線一靠近金膠墊，測(cè)試線一的檢測(cè)閾值為尿LNl濃度10-40ng/ml，測(cè)試線二的檢測(cè)閾值為尿LNl濃度40_100ng/ml。所述的試紙上具有至少一條質(zhì)控線，其顯色表示試紙有效。所述的金膠墊由玻璃纖維和固定其上的金標(biāo)抗體組成，所述的樣品墊為吸水性玻璃纖維層。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是所述的試紙?jiān)谥苽湓\斷膀胱癌的醫(yī)療器械中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
1、本發(fā)明提供了尿?qū)诱尺B蛋白的新用途，為膀胱癌的大規(guī)模人群篩查、膀胱癌術(shù)后病人的自我檢測(cè)提供方便、可靠、無(wú)創(chuàng)、價(jià)廉的方法，減少膀胱癌術(shù)后病人有創(chuàng)性檢查方法一膀胱鏡檢查的次數(shù)，有助于浸潤(rùn)性膀胱癌的診斷，有助于判斷和預(yù)測(cè)淺表非浸潤(rùn)性膀胱癌向浸潤(rùn)性膀胱癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)膀胱癌的治療；
2、本發(fā)明的試紙檢測(cè)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需任何儀器設(shè)備，而且結(jié)果判斷直觀可靠、易于掌握，同時(shí)也方 便病人對(duì)病情自我監(jiān)測(cè)；
3、通過(guò)采用兩條測(cè)試線，增加了試紙的靈敏度，也提高了其特異度，既可以用于在高危人群中的篩查，又可以用于在膀胱癌術(shù)后病人的隨訪，應(yīng)用范圍比較廣泛。


附圖I是膀胱癌尿?qū)诱尺B蛋白LNl診斷試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。附圖2是膀胱癌尿?qū)诱尺B蛋白LNl診斷試紙的檢測(cè)結(jié)果示意圖。附圖3是膀胱癌尿?qū)诱尺B蛋白LNl診斷試紙的檢測(cè)過(guò)程示意圖。附圖4是膀胱癌尿?qū)诱尺B蛋白LNl半定量診斷試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。附圖5是膀胱癌尿?qū)诱尺B蛋白LNl半定量診斷試紙的檢測(cè)結(jié)果示意圖。附圖6是膀胱癌尿?qū)诱尺B蛋白LNl半定量診斷試紙的檢測(cè)過(guò)程示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。附圖中涉及的附圖標(biāo)記和組成部分如下所示
I.底板2.樣品墊
3.金膠墊4.硝酸纖維膜層
5.吸水紙層6.尿樣
7.層析方向 實(shí)施例I
目前已知共有15種不同的LN亞型，LN1-15。(詳見(jiàn)Julia Tzu, MD and M. PeterMarinkovich, MD. BRIDGING STRUCTURE WITH FUNCTION: STRUCTURAL, RE⑶LATORY, ANDDEVELOPMENTAL ROLE OF LAMININS. 7/ ^ J Biochem Cell Biol. 2008 ; 40(2): 199 -214.)本發(fā)明檢測(cè)了其中LNl和LN5兩種臨床上常用的亞型。總體共182例，其中膀胱尿路上皮癌病例組92例；泌尿系其他疾病組72例；健康對(duì)照人群18例。采用人層粘連蛋白定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)其中LNl和LN5兩種亞型，檢測(cè)步驟參照人層粘連蛋白定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)。一、LN5亞型的ELISA檢測(cè)結(jié)果
I 膀胱癌組24.24±21.872.膀胱癌術(shù)后組13. 48 ±7. 79
3.泌尿系其他疾病組:25.15±8. 10
4.健康對(duì)照組17. 40 ±6. 57
膀胱癌組高于膀胱癌術(shù)后組(P〈0. 001)和健康對(duì)照組(p=0. 022)，但膀胱癌與泌尿系其他疾病組無(wú)差異(P=O. 999)。ROC面積LN5=0. 482 (0. 409-0. 555)〈O. 50，說(shuō)明LN5對(duì)膀胱癌沒(méi)有診斷價(jià)值。二、LNl亞型的ELISA檢測(cè)結(jié)果
I.膀胱癌組高于其它兩組(71. 91±78. 02 vs. 31.72±11.12 vs. 33. 44±6. 95 ng/ml, P<0. 001, 0. 001)，而其他疾病組與健康人群組無(wú)差異(P=0. 802)。2.病理分期肌層浸潤(rùn)組(T2_4，46例)高于非肌層浸潤(rùn)組(Ta，Tl,46例)，其差異接近有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(87. 57±90. 44 vs. 56. 24±60. 25 ng/ml, P=O. 054)；
3.病理分級(jí)高級(jí)別組(32例)高于低級(jí)別組(60例)，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(110. 94±112. 28 vs. 51.08±38. 70 ng/ml ;P=0. 006)。表I尿LNl診斷膀胱尿路上皮癌的診斷價(jià)值
權(quán)利要求
1.尿?qū)诱尺B蛋白LNl在制備診斷膀胱癌的醫(yī)療器械中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的膀胱癌是膀胱尿路上皮癌，所述的醫(yī)療器械是診斷試紙或試劑盒，所述的醫(yī)療器械的診斷樣品是尿液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的醫(yī)療器械的診斷闕值是尿LNl濃度10-100ng/ml。
4.一種診斷膀胱癌的LNl試紙，包括底板、樣品墊、金膠墊、硝酸纖維膜層和吸水紙層，所述的底板上依次覆蓋樣品墊、金膠墊、硝酸纖維膜層和吸水紙層，其特征在于，所述的硝酸纖維膜上含有牛血清白蛋白-尿LNl偶聯(lián)物的測(cè)試線和抗鼠二抗的質(zhì)控線，所述的金膠墊上含有膠體金與抗尿LNl抗體結(jié)合形成的金標(biāo)抗尿LNl抗體復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試紙，其特征在于，所述的試紙的診斷樣品是尿液，所述的試紙的檢測(cè)闕值為尿LNl濃度10-100ng/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試紙，其特征在于，所述的硝酸纖維膜上有兩條測(cè)試線，所述的測(cè)試線一靠近金膠墊，測(cè)試線一的檢測(cè)閾值為尿LNl濃度10-40ng/ml，測(cè)試線二的檢測(cè)閾值為尿LNl濃度40-100ng/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試紙，其特征在于，所述的試紙上具有至少一條質(zhì)控線，其顯色表示試紙有效。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試紙，其特征在于，所述的金膠墊由玻璃纖維和固定其上的金標(biāo)抗體組成，所述的樣品墊為吸水性玻璃纖維層。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8任一所述的試紙?jiān)谥苽湓\斷膀胱癌的醫(yī)療器械中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及尿?qū)诱尺B蛋白LN1在制備診斷膀胱癌的醫(yī)療器械中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種診斷膀胱癌的LN1試紙及其應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于提供了尿?qū)诱尺B蛋白的新用途，為膀胱癌的大規(guī)模人群篩查、膀胱癌術(shù)后病人的自我檢測(cè)提供方便、可靠、無(wú)創(chuàng)、價(jià)廉的方法；試紙檢測(cè)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需任何儀器設(shè)備，而且結(jié)果判斷直觀可靠、易于掌握，同時(shí)也方便病人對(duì)病情自我監(jiān)測(cè)；增加了試紙的靈敏度，也提高了其特異度，既可以用于在高危人群中的篩查，又可以用于在膀胱癌術(shù)后病人的隨訪，應(yīng)用范圍比較廣泛。
文檔編號(hào)G01N33/574GK102621307SQ20121006325
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者周春洪, 張敏光, 沈周俊 申請(qǐng)人:周春洪, 張敏光, 沈周俊