一種vi型膠原蛋白抗體、制備方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種VI型膠原蛋白抗體、制備方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。一種VI型膠原蛋白單克隆抗體，包括抗原結(jié)合位點，所述的抗原結(jié)合位點位于序列VI型膠原蛋白a1片段，核苷酸序列為SEQ ID No:1。本發(fā)明選擇VI型膠原a1片段中的抗原作為免疫原，使用大腸桿菌表達系統(tǒng)，得到的單克隆抗體，能夠與人體血清內(nèi)中VI型膠原蛋白進行特異性結(jié)合，用于檢測血清中VI型膠原的含量變化，可大大提高臨床對不明原因性肝病的診斷水平。
【專利說明】
-種VI型膠原蛋白抗體、制備方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種VI型膠原蛋白抗體、制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] VI型膠原蛋白（collagen VI)屬于膠原類蛋白之一，普遍存在于胞外基質(zhì)的功能 蛋白，其顯著特征是分子量大和半脫氨酸含量高，由al，a2，a3 =亞基組成。由于其良好的生 物學(xué)特性，可W促進間質(zhì)細胞和軟骨細胞的生成與遷移而維持組織的完整性，并且機械性 能良好。VI型膠原、IV型膠原和層粘連蛋白是肝細胞外基質(zhì)的主要成份，VI型膠原蛋白在肝 細胞成熟過程中起一定作用。當(dāng)細胞發(fā)生炎癥時，VI型膠原會被酶最先作用釋放一些VI型 膠原蛋白膚，血清中VI型膠原的含量會明顯升高。
[0003] 通過維持細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，VI型膠原能夠維持血管、肺、軟骨、肌肉及皮 膚等組織的完整性，如果編碼VI型膠原蛋白的基因發(fā)生突變，將會形成Bethle肌病和 叫Irich綜合征，導(dǎo)致肌肉無力和消瘦;VI型膠原蛋白的缺失還可W導(dǎo)致線粒體功能的喪失 和細胞調(diào)亡。另一方面，VI型膠原的增加或積累同樣會導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如淺表性纖維瘤、 神經(jīng)纖維瘤、癒痕瘡落、肺纖維化、肝纖維化、糖尿病腎損傷W及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。VI型膠原 還影響了細胞的分化、粘附、遷移、增殖W及生存。將屯、肌纖維細胞置于含有VI型膠原的基 質(zhì)中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)由于VI型膠原的誘導(dǎo)，成肌纖維細胞出現(xiàn)了分化，體內(nèi)實驗同樣證實了運個 結(jié)果。在VI型膠原功能研究中，VI型膠原對各種定向造血干細胞具有較強的粘附性，發(fā)揮運 種粘附性的位置限定在3個膚鏈的螺旋區(qū)。VI膠原還能夠促進各種細胞的增殖，運種促進增 殖作用可W被VI型膠原的單獨的膚鏈所阻斷。而增強纖維細胞的擴散和移動是通過VI型膠 原同細胞表面蛋白聚糖N G、核屯、蛋白聚糖、多配體聚糖、透明質(zhì)酸W及其他類型膠原相結(jié) 合而實現(xiàn)的。
[0004] 膠原蛋白作為肝纖維化增生結(jié)締組織的主要成份，其細胞來源一直是肝纖維化的 研究重點。研究表明，膠原蛋白可由多種細胞產(chǎn)生，如膽脂細胞、肝細胞、內(nèi)皮細胞等，而膽 脂細胞是ECM，尤其是膠原蛋白的主要細胞來源。膽脂細胞在炎癥刺激下，轉(zhuǎn)化為能表達平 滑肌肌動蛋白的肌纖維母細胞，合成許多ECM成份如膠原蛋白、蛋白多糖、纖維連接蛋白、層 粘連蛋白、內(nèi)動蛋白、健蛋白和透明質(zhì)酸。
[0005] 臨床診斷上，VI型膠原蛋白由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使用基因工程的辦法很難在體 外再現(xiàn)出生物活性高的抗原，導(dǎo)致沒有高準(zhǔn)確度的體外診斷試劑原料，影響到臨床案例被 誤診和漏診，影響到相關(guān)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療。
[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明公開了 VI型膠原蛋白抗原診斷試劑抗 體產(chǎn)品，有效解決了臨床診斷試劑原料質(zhì)量低下的問題，大大提高了對臨床不明原因性肝 病的診斷水平，推動我國肝病診斷試劑的整體水平的提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種VI型膠原蛋白抗體、制備方法及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0009] -種VI型膠原蛋白單克隆抗體，包括抗原結(jié)合位點，所述的抗原結(jié)合位點位于序 列VI型膠原蛋白al片段，核巧酸序列為SEQ ID No: 1。
[0010] 進一步地，上述VI型膠原蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟為:選擇 VI型膠原蛋白al片段作為抗原，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行抗原蛋白表達，分4次將篩選的抗原免疫 SPF級小鼠，將小鼠產(chǎn)生的效應(yīng)B細胞與骨髓瘤細胞進行融合，得到單克隆細胞株，由單克隆 細胞株分泌獲得。
[0011] 更進一步地，上述VI型膠原蛋白單克隆抗體可W用于制備VI型膠原蛋白檢測試劑 盒，檢測血清中VI型膠原蛋白含量的試劑盒，用于臨床上對肝病的輔助診斷。
[0012] 本發(fā)明選擇VI型膠原al片段中的抗原作為免疫原，彌補W為抗原的缺陷，使用大 腸桿菌表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用植物細胞啟動因子表達量高，成本低廉，得到的單克隆抗體， 能夠與人體血清內(nèi)中VI型膠原蛋白進行特異性結(jié)合，用于檢測血清中VI型膠原的含量變 化，可大大提高臨床對不明原因性肝病的診斷水平，推動我國肝病診斷試劑的整體水平的 提局。
【附圖說明】
[OOU] 圖1為VI型膠原蛋白標(biāo)記用抗體SDS-PAGE圖
[0014] 圖中：1-10 . Oug硫錠純化標(biāo)記用抗體、2-1 . Oug硫錠純化標(biāo)記用抗體、3- 10.0 u曲EAE純化標(biāo)記用抗體、4-1. OugDEAE純化標(biāo)記用抗體。
【具體實施方式】
[0015] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，W下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0016] 實施例1 VI型膠原蛋白單克隆抗體的制備
[0017] (1)小鼠免疫及脾細胞與雜交瘤的融合
[0018] 取6~8周齡雌性Ba化/c小鼠，初次免疫每只小鼠肌肉注射用福氏完全佐劑乳化的 Siig重組抗原（總體積50山）；15天后進行二次基礎(chǔ)免疫，方法為取相同量的抗原用福氏不完 全佐劑乳化，肌肉注射;30天后，尾靜脈加強注射扣g不加佐劑的抗原，并于加強免疫后72小 時，殺死小鼠，收集血液，取脾制備脾細胞懸液(懸于RPMI 1640培養(yǎng)基中），細胞計數(shù)板細胞 計數(shù)。
[0019] 按1/6于脾細胞的數(shù)量取培養(yǎng)的SP2/0小鼠骨髓瘤細胞，混合后離屯、，利用聚乙二 醇(PEG 1500)使脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合;將細胞懸液與等體積的飼養(yǎng)細胞混 合后，分置于96孔細胞培養(yǎng)板中（200山/孔)于5%二氧化碳培養(yǎng)箱化SPEC BNA-311)37°C培 養(yǎng);3天后，用肌培養(yǎng)基(黃嚷嶺1.361111旨+胸腺喀晚核巧0.388111旨，加1?^11640(618〇)公司）培 養(yǎng)基至IOOmL,45~50°C條件下溶解后，過濾除菌；半保留換液;7天后，用重組抗原包被板， 利用如下述酶聯(lián)免疫吸附法化LISA)檢測96孔細胞培養(yǎng)板中所得雜交瘤細胞上清培養(yǎng)液； 對于化ISA檢測為陽性的細胞克隆，利用有限稀釋法進行克隆化。
[0020] (2化LISA檢測法
[0021] 如上WVI型膠原蛋白作為抗原包被的化ISA板，檢測時，于每孔中加入10化I細胞 培養(yǎng)液上清;每塊96孔微量滴定板設(shè)一陽性對照，加入10化1小鼠抗肥V-Ag多抗血清（1:100 稀釋使用）；另設(shè)一陰性對照，加入10化1 HT細胞培養(yǎng)液。
[0022] 37°C溫浴30分鐘，用PBST洗涂液洗5遍，拍干后加入過氧化物酶結(jié)合的羊抗鼠免疫 球蛋白化RP-GAM Ig，DAKO公司），37°C溫浴30分鐘，取出后用PBST洗涂液洗5遍，拍干后先后 加入底物液A、B各50山（底物液A成分為：13.42g Na2HP04 ? 12肥0、4.2g巧樣酸? H20和0.3g 過氧化氨，用去離子水中調(diào)節(jié)體積為700ml;顯色液B成分為:0.?四甲基聯(lián)苯胺、20ml二甲 基甲酯胺用去離子水中調(diào)節(jié)體積為700ml)，37°C顯色10分鐘，加入SOiil終止液(2M H2S04) 終止反應(yīng)，并于酶標(biāo)儀上檢測各孔的0D450值，W0D450值高于陰性對照2倍W上者視為陽 性。
[0023] (3)單克隆抗體腹水的獲得及純化
[0024] 取10周齡的健康Balb/c小鼠，腹腔注射福氏不完全佐劑，每只0.5ml ;7天后，收集 克隆化的雜交瘤細胞，離屯、去上清，加入不含血清的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細胞密度至2 X 105~2 X 106個/ml，每只小鼠注射0.5ml;7天后小鼠腹部增大，開始收集腹水;300化pm離屯、30分鐘， 吸取上清部分的液體，0.45WI1的微孔濾膜過濾除菌，分裝后-70°C保存。
[0025] 將腹水進行辛酸一飽和硫酸錠處理后，用PBS復(fù)溶;裝入透析帶中，放入化0.02M pH7.2憐酸鹽緩沖液中，4°C攬拌下脫鹽12小時左右，期間更換3次W上透析液；DEAE (Pharmacia公司）柱層析純化，上樣緩沖液為0.02M PB，洗脫緩沖液為0.2M PBS，并收集 0.2M PBS洗脫組份;取出后分裝-20°C保存。
[00%] (4)抗體純化方法
[0027] 將腹水或血清用0.02mol/L、pH7.4的PBSlO倍稀釋，攬拌下逐滴緩慢加入硫酸錠 (濃度達到50%飽和度），4°C過夜。4°C，12000巧m離屯、15分鐘，棄上清，將沉淀溶于適量的 PBS 中，-20 °C 保存。
[0028] 實施例2 VI型膠原蛋白單克隆抗體的檢定 [00巧](1)單抗純度：
[0030] 用SDS-PAGE蛋白電泳法，泳道1、巧日樣量為lOiig，泳道2、巧日樣量為1.化g，同時用 已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)系列作為參照，經(jīng)考馬斯亮藍染色，純度大于90%，結(jié)果如圖1所示。
[0031] (2)蛋白含量：
[0032] 采用紫外吸收法對蛋白含量進行檢測，蛋白含量不低于0.5mg/ml。
[0033] (3)免疫活性：
[0034] 用雙抗原夾屯、法檢測抗體滴度，滴度:100
[0035] 實施例3VI型膠原蛋白單克隆抗體的初步鑒定
[0036] (1)單抗親和力及表位分組抗原和抗體進行包被
[0037] 使用96孔聚苯乙締板進行包被，使用0.05M化HC03緩沖液(P朋.6)將抗體稀釋至 合適濃度，抗原稀釋為2.5ug/ml，每孔加入IOOul，37°C 2小時，用pH7.4的含0.1 %Tween PBS(PBST)洗涂3遍后，每孔加入含20%牛血清的包被緩沖液200ul，37°C封閉2小時，PBST洗 涂3遍，保存于4°C備用。
[0038] (2)采用不同檢測方法
[0039] a.間接ELISA
[0040]間接化ISA中，使用含5%牛血清的PBS門尋待檢抗體稀釋至合適濃度，加入包被有 抗原的微孔板中，IOOul/孔，37°C解育1小時，PBST洗涂5遍;然后每孔加入IOOul使用含5% 牛血清PBST 1:5000稀釋的皿P標(biāo)記羊抗鼠 IgG抗體，37 °C解育30分鐘后，PBST洗涂五遍，加 入TMB底物，37 °C顯色15分鐘;在波長450nm處讀取各孔A值。
[0041 ] b.競爭化 ISA
[0042] 根據(jù)標(biāo)記抗體的滴定結(jié)果，將標(biāo)記抗體濃度稀釋至A值約為2.00左右，同時將競爭 抗體濃度稀釋為標(biāo)記抗體現(xiàn)濃度的20倍;競爭抗體和標(biāo)記抗體各50ul加入微孔板中，平行 雙孔測定。與競爭抗體濃度相同的無關(guān)單抗作為陰性對照，與競爭抗體濃度相同與標(biāo)記抗 體同株的未標(biāo)記抗體作為陽性對照。37 °C解育1小時后，洗板，TMB顯色，450皿處讀取A值，計 算競爭抗體對標(biāo)記抗體的抑制率。
[0043] 抑制率=A競爭-A陽性/A陰性-A陽性
[0044] 如抑制率>75%為兩株單抗所識別位點完全不相關(guān)；>50%<75%為不完全相關(guān)； > 25 %巧0 %為相關(guān);<25 %為完全相關(guān)。
[0045] C.雙抗體夾屯、ELISA，間接雙抗體夾屯、ELISA，LAB間接雙抗體夾屯、ELISA
[0046] 包被有捕獲抗體的酶標(biāo)板條中加入使用含5 %牛血清PBST 10倍稀釋的待測血清， 37 °C解育2小時，PBST洗涂3遍。
[0047] (1)經(jīng)典雙抗體夾屯、法:加入皿P標(biāo)記的一抗，37°C解育1小時，PBST洗涂5遍后，加 入底物顯色；
[004引（2)間接雙抗體夾屯、：加入羊抗肥V多抗，37 °C解育1小時后，PBST洗涂5遍，然后加 入HRP標(biāo)記兔抗羊IgG抗體，37 °C解育30分鐘后，PBST洗涂5遍，加入底物顯色；
[00例 （3) LAB間接雙抗體夾屯、:加入羊抗肥V多抗，37 °C解育1小時后，PBST洗涂5遍，然后 加入生物素標(biāo)記兔抗羊IgG抗體，37°C解育30分鐘后，PBST洗涂5遍，再加入HRP標(biāo)記親和素， 37 °C解育30分鐘后，PBST洗涂5遍，加入底物顯色。
[0050] W上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明掲露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換， 都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該W權(quán)利要求的保護范圍 為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種VI型膠原蛋白單克隆抗體，其特征在于，包括抗原結(jié)合位點，所述的抗原結(jié)合位 點位于序列VI型膠原蛋白al片段。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VI型膠原蛋白單克隆抗體，其特征在于，所述的抗原結(jié)合位點 的核苷酸序列為SEQ ID No: 1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VI型膠原蛋白單克隆抗體，其特征在于，以VI型膠原蛋白al片 段作為抗原，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行抗原蛋白表達，以SPF級小鼠作為免疫對象，將小鼠產(chǎn)生的 效應(yīng)B細胞與骨髓瘤細胞進行融合，由獲得單克隆細胞株分泌產(chǎn)生。4. 權(quán)利要求1所述的VI型膠原蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟為:選擇 VI型膠原蛋白al片段作為抗原，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行抗原蛋白表達，分4次將篩選的抗原免疫 SPF級小鼠，將小鼠產(chǎn)生的效應(yīng)B細胞與骨髓瘤細胞進行融合，得到單克隆細胞株，由單克隆 細胞株分泌獲得。5. 權(quán)利要求1所述的VI型膠原蛋白單克隆抗體在制備VI型膠原蛋白檢測試劑盒中的應(yīng) 用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的試劑盒是檢測血清中VI型膠原蛋白 含量的試劑盒。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的試劑盒用于臨床上對肝病的輔助診 斷。
【文檔編號】G01N33/577GK105924522SQ201610257955
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】李玉璞
【申請人】四川耀康生物科技有限公司