專利名稱：一種細(xì)胞外基質(zhì)冷凍干燥保護(hù)液及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用生物材料保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于細(xì)胞外基質(zhì)冷凍干燥(簡(jiǎn)稱凍干)的保護(hù)液及其使用方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞外基質(zhì)是由細(xì)胞分泌，可以通過特異的表面受體啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、遷移、粘附等功能，其來源于天然組織，相比高分子合成材料具有良好的生物相容性。細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白等成分組成；是通過物理、化學(xué)等手段將生物材料中的細(xì)胞成分去除獲得，該類生物材料在臨床修復(fù)和組織工程的組織構(gòu)建中具有明顯的療效和優(yōu)勢(shì)；目前以細(xì)胞外基質(zhì)為基礎(chǔ)的上市產(chǎn)品有幾十種，如小腸粘膜下層、真皮、血管、心臟瓣膜等。
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雖然細(xì)胞外基質(zhì)已廣泛應(yīng)用于臨床，但是其保存方式一直存在問題，通常采用晾干或凍干兩種方式。晾干的細(xì)胞外基質(zhì)保留了基質(zhì)蛋白的氫鍵及一些分子作用力，保護(hù)并維持了膠原的三級(jí)結(jié)構(gòu)，但晾干的細(xì)胞外基質(zhì)的保質(zhì)期較短，僅是凍干保存方式的三分之一，因此給產(chǎn)品的銷售帶來困難。而凍干的細(xì)胞外基質(zhì)雖然更利于運(yùn)輸和保存，但水分的丟失導(dǎo)致氫鍵被破壞，造成基質(zhì)結(jié)構(gòu)坍塌和功能破壞、喪失活性；而且結(jié)構(gòu)的破壞是不可逆轉(zhuǎn)的，即使復(fù)水后，也難以恢復(fù)到以前狀態(tài)。冷凍干燥技術(shù)(簡(jiǎn)稱凍干)是將含水物質(zhì)在低溫下凍結(jié)，再于真空條件下使冰升華，從而除去物料中的吸附水，得到凍干制品。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、蛋白制品的凍干保護(hù)。細(xì)胞外基質(zhì)是一種大分子量、由一種或多種蛋白類分子組成的生物材料。在預(yù)冷、一次干燥、二次干燥和儲(chǔ)存過程中，基質(zhì)結(jié)構(gòu)容易改變，導(dǎo)致基質(zhì)變性。通常采用添加生物活性保護(hù)劑，如糖類、大分子聚合物、表面活性劑等，這些物質(zhì)通過替代水分子與蛋白質(zhì)形成羥基來平衡PH，降低蛋白質(zhì)的表面張力，促進(jìn)低溫條件下玻璃態(tài)(玻璃態(tài)是保持液體結(jié)構(gòu)的固體狀態(tài)，液體在低溫條件下形成玻璃態(tài)可避免冰晶的形成)的形成，保護(hù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并且這些物質(zhì)組成的保護(hù)劑對(duì)大部分的小分子活性蛋白能起到保護(hù)作用。由于細(xì)胞外基質(zhì)是以膠原為主的大分子蛋白，其結(jié)構(gòu)致密，不易被糖類等凍干保護(hù)劑滲入，致使凍干效果不均一(指不同批次產(chǎn)品)，故對(duì)保護(hù)液的滲透壓要求高。而且細(xì)胞外基質(zhì)不溶于水，不能與凍干保護(hù)劑形成共熔點(diǎn)，因而在冷凍過程中保護(hù)劑與細(xì)胞外基質(zhì)不能形成穩(wěn)定的共態(tài)，因此針對(duì)可溶性小分子蛋白的凍干保護(hù)劑在用于細(xì)胞外基質(zhì)時(shí)，所產(chǎn)生冰晶會(huì)損傷基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致基質(zhì)的物化性能改變。此外膠原分子表面帶有大量正電荷，而糖類的電負(fù)性較弱，因此與膠原的粘附性弱，與水分子競(jìng)爭(zhēng)性替代氫鍵的能力也較弱，對(duì)膠原分子的保護(hù)不充分，容易使膠原結(jié)構(gòu)坍塌、活性下降。因此有必要針對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的特性，開發(fā)出更合適的凍干保護(hù)液。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞外基質(zhì)冷凍干燥保護(hù)液及其使用方法，用其在凍干過程中能夠維持細(xì)胞外基質(zhì)的生物活性和三維結(jié)構(gòu)不被破壞，并使凍干程度均勻。本發(fā)明所提出的細(xì)胞外基質(zhì)凍干保護(hù)液是以生理鹽水為溶劑，其組成包括硫酸軟骨素50 150mg/ml、維生素C I 5mg/ml、聚乙二醇65 380mg/ml、海藻糖10 IOOmg/ml、葡聚糖10 30mg/ml、絲氨酸I 16 y g/ml和蘇氨酸I 16 y g/ml。該保護(hù)液的配制對(duì)溫度和組分順序無特殊要求。
所述的細(xì)胞外基質(zhì)凍干保護(hù)液組成的優(yōu)化選擇為硫酸軟骨素50 100mg/ml、維生素C I 5mg/ml、聚乙二醇65 250mg/ml、海藻糖10 50mg/ml、葡聚糖10 30mg/ml、絲氨酸I 10 ii g/ml和蘇氨酸I 10 ii g/ml o本發(fā)明所述的凍干保護(hù)液，是根據(jù)細(xì)胞外基質(zhì)的理化特性及其分子結(jié)構(gòu)(氫鍵和極性基團(tuán))在冷凍、干燥過程中與功能變化機(jī)理專門設(shè)計(jì)，采用本發(fā)明保護(hù)液具有細(xì)胞外基質(zhì)干燥均勻、含水率低、結(jié)構(gòu)與功能損傷小的優(yōu)點(diǎn)。I)硫酸軟骨素是細(xì)胞外基質(zhì)組成的重要成分，起著維持細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，而且其富含陰離子，能與膠原類蛋白有很好的粘附性；細(xì)胞外基質(zhì)在低溫干燥過程中，硫酸軟骨素能在膠原蛋白表面形成膜結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并替代水分子與膠原形成氫鍵穩(wěn)定分子的空間結(jié)構(gòu)；電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，采用硫酸軟骨素保護(hù)的細(xì)胞外基質(zhì)在凍干后更接近天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。2)維生素C :細(xì)胞外基質(zhì)在低溫冷凍過程中產(chǎn)生大量的氧化自由基，對(duì)膠原蛋白的二級(jí)分子鏈有顯著破壞作用，使分子鏈斷裂。維生素C的抗氧化作用，可以通過脫氫反應(yīng)清除液體中的單線態(tài)，降低對(duì)膠原蛋白結(jié)構(gòu)的破壞；經(jīng)電泳檢測(cè)，在大分子膠原蛋白凍干后，不添加維生素C的小分子片段明顯增多，證明在降溫過程中其具有保護(hù)膠原蛋白斷裂的作用。3)聚乙二醇在低溫冷凍過程中，冰晶的形成會(huì)破壞蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，故抑制冰晶形成對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的保護(hù)至關(guān)重要。聚乙二醇水溶性好、熔點(diǎn)低，可有效脫除細(xì)胞外基質(zhì)中的流動(dòng)水分，其低熔點(diǎn)也保證了細(xì)胞外基質(zhì)在降溫過程中不形成冰晶；經(jīng)組織學(xué)檢測(cè)凍干后的膠原膜片，發(fā)現(xiàn)添加聚乙二醇的膠原纖維排列緊密，而未添加的膠原纖維結(jié)構(gòu)散亂。4)葡聚糖在降溫過程中，水分形態(tài)的變化會(huì)引起滲透壓的快速改變，從而導(dǎo)致基質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使功能活性受到影響。葡聚糖為大分子化合物，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、粘稠度高，能平衡液體滲透壓、減弱降溫過程中滲透壓的變化速率，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)的目的；采用蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)顯示，不添加葡聚糖保護(hù)的基質(zhì)在凍干后降解速率明顯加快。5)絲氨酸和蘇氨酸細(xì)胞外基質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)需要?dú)滏I維持，通常氫鍵的羥基是由水分子提供，但在凍干的脫水過程中氫鍵被破壞，致使基質(zhì)結(jié)構(gòu)也受到破壞。而絲氨酸和蘇氨酸富含羥基，在水分流失的情況下可以替代水分子提供羥基，維持蛋白的空間結(jié)構(gòu)；同時(shí)其具有分子量小、穿透性強(qiáng)的特點(diǎn)，適宜于對(duì)結(jié)構(gòu)致密的細(xì)胞外基質(zhì)材料進(jìn)行凍干保護(hù)；此外還能防止鹽離子在冷凍干燥過程中的結(jié)晶，保護(hù)蛋白不受損傷；采用熱力差掃描檢測(cè)結(jié)果顯示，未添加氨基酸保護(hù)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度顯著低于添加保護(hù)的，可見未添加保護(hù)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性較差。6)海藻糖富含羥基，是良好的玻璃化試劑。其在凍干過程中可以替代水分子與蛋白質(zhì)形成氫鍵，同時(shí)促進(jìn)液體的玻璃化在降溫過程中減少冰晶形成，保護(hù)蛋白結(jié)構(gòu)；采用熱力差掃描檢測(cè)結(jié)果顯示，未添加海藻糖保護(hù)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度顯著低于添加保護(hù)的，可見未添加保護(hù)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性更差。本發(fā)明適用于細(xì)胞外基質(zhì)類生物材料的凍干保護(hù)。具體的使用方法為，在室溫條件下，將細(xì)胞外基質(zhì)浸泡于不低于2 倍體積的凍干保護(hù)液中，振蕩5 30分鐘，連同保護(hù)液一起轉(zhuǎn)入4°C水浴中，使細(xì)胞外基質(zhì)與凍干保護(hù)液都達(dá)到4°C，再置入凍干設(shè)備以0. 5 2V /分鐘的速度降溫至-45 _80°C后，維持I 6小時(shí)；開始抽真空，在30分鐘內(nèi)使絕對(duì)真空壓力達(dá)到10 20Pa，再以3 5°C /分鐘的速度升溫至_15 _45°C，維持12 30小時(shí)；然后解析升溫，以5 15°C /分鐘的速度升溫至15 30°C，維持4 15小時(shí)后，結(jié)束凍干取出，產(chǎn)品的含水率控制在2% 8%之間。其中，細(xì)胞外基質(zhì)浸泡于凍干保護(hù)液的形式允許是固態(tài)(包括片狀、粉狀)或是液態(tài)(包括溶液)。本發(fā)明的細(xì)胞外基質(zhì)凍干保護(hù)液具有滲透性強(qiáng)、低溫條件下可玻璃化、富含負(fù)極性基團(tuán)和羥基、能與膠原分子高效粘附的優(yōu)點(diǎn)，保證了結(jié)構(gòu)致密的細(xì)胞外基質(zhì)被更好的滲入使凍干效果穩(wěn)定均勻，低溫下保護(hù)液形成玻璃態(tài)能避免冰晶損傷蛋白結(jié)構(gòu)，并能高效替代水分子在基質(zhì)外層形成保護(hù)膜取代水分子與膠原形成氫鍵，保護(hù)膠原功能和三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。本發(fā)明保護(hù)液的細(xì)胞毒性低，用前經(jīng)生理鹽水或無菌水涮洗后即可使用；凍干后的細(xì)胞外基質(zhì)經(jīng)真空包裝在常溫下可保存三年以上。本發(fā)明更適用于純化的細(xì)胞外基質(zhì)保存，如膠原、彈性蛋白、糖蛋白等，也適用于由細(xì)胞外基質(zhì)材料構(gòu)建的各類生物材料。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)例詳細(xì)說明本發(fā)明技術(shù)方案的具體實(shí)施方式
和使用效果。實(shí)例I、膠原蛋白的凍干保護(hù)(所用膠原購自美國Sigma公司)。以生理鹽水為溶劑配制凍干保護(hù)液，內(nèi)含硫酸軟骨素60mg/ml，維生素C 2mg/ml,聚乙二醇130mg/ml,海藻糖20mg/ml,葡聚糖20mg/ml,絲氨酸3 y g/ml,蘇氨酸3 y g/ml。使用實(shí)例由于膠原蛋白能夠溶解弱酸，而不發(fā)生變性。因此將膠原蛋白先溶解于體積濃度為3%的乙酸溶液，再調(diào)pH至7. 2，形成終濃度為20mg/ml的膠原溶液；然后把該膠原溶液與3倍體積的凍干保護(hù)液混合，在室溫下振蕩5分鐘后轉(zhuǎn)入4°C水??；再以1°C /分鐘的速度降溫至-65 °C，維持4小時(shí)后開始抽真空，在30分鐘內(nèi)使絕對(duì)壓力達(dá)到20Pa，然后以3°C /分鐘的速度升溫至_35°C后維持24小時(shí)；最后進(jìn)行解析升溫，以7V /分鐘的速度升溫至15°C后維持12小時(shí)，結(jié)束凍干，產(chǎn)品呈白色棉絮狀。凍干膠原在室溫、無菌、密閉、干燥、避光的狀態(tài)下能保存3年。由于膠原蛋白通常溶解在液體中，因此低濃度的保護(hù)液就可以充分均勻的混合在膠原溶液中，達(dá)到保護(hù)膠原蛋白的目的；并且避免高濃度液體在低溫凍干過程中產(chǎn)生的高滲透壓差，對(duì)膠原蛋白造成的損害。實(shí)例2、脫細(xì)胞小腸粘膜的凍干保護(hù)(所用脫細(xì)胞小腸粘膜是按中國專利申請(qǐng)200810150792. 5 中方法制備)。以生理鹽水為溶劑配制凍干保護(hù)液，內(nèi)含硫酸軟骨素120mg/ml，維生素C 4mg/ml,聚乙二醇250mg/ml,海藻糖40mg/ml,葡聚糖30mg/ml,絲氨酸8 ii g/ml,蘇氨酸8 ii g/ml。使用實(shí)例將脫細(xì)胞小腸粘膜浸泡于8倍體積的凍干保護(hù)液中，在室溫下振蕩20分鐘后轉(zhuǎn)入4°C水浴；再以2°C /分鐘的速度降溫至-65°C，維持5小時(shí)后開始抽真空，在30分鐘內(nèi)使絕對(duì)真空壓力達(dá)到10Pa，然后以3°C /分鐘的速度升溫至_35°C后維持15小時(shí)；最后進(jìn)行解析升溫，以10°C /分鐘的速度升溫至25°C后維持6小時(shí)，結(jié)束凍干，產(chǎn)品為白色半透明膜狀。 脫細(xì)胞小腸粘膜主要由I型和III型膠原組成，含有豐富的糖胺蛋白；其結(jié)構(gòu)致密、不溶于水，較高濃度的保護(hù)液能提高保護(hù)液中各組分對(duì)蛋白的滲透，起到保護(hù)作用。此夕卜，高濃度的保護(hù)液能夠形成更徹底的玻璃態(tài)，避免冰晶對(duì)小腸粘膜下層結(jié)構(gòu)的損傷，及其基質(zhì)對(duì)細(xì)胞遷移和粘附的影響。實(shí)例3、脫細(xì)胞牛皮基質(zhì)的凍干保護(hù)(所用脫細(xì)胞牛皮基質(zhì)購自煙臺(tái)正海公司)。以生理鹽水為溶劑配制凍干保護(hù)液，內(nèi)含硫酸軟骨素80mg/ml，維生素C 4mg/ml,聚乙二醇350mg/ml,海藻糖40mg/ml,葡聚糖15mg/ml,絲氨酸8 u g/ml,蘇氨酸8 u g/ml。使用實(shí)例將脫細(xì)胞牛皮基質(zhì)浸泡于20倍體積的凍干保護(hù)液中，在室溫下振蕩20分鐘后轉(zhuǎn)入4°C水??；再以2°C /分鐘的速度降溫至-65°C，維持5小時(shí)后開始抽真空，在30分鐘內(nèi)使絕對(duì)真空壓力達(dá)到lOPa，然后以3°C /分鐘的速度升溫至_35°C后，維持15小時(shí)；最后進(jìn)行解析升溫，以10°C /分鐘速度升溫至25°C后維持6小時(shí)，結(jié)束凍干，產(chǎn)品為白色膜狀。雖然脫細(xì)胞牛皮基質(zhì)主要成分也是膠原，但是不同于脫細(xì)胞小腸粘膜，脫細(xì)胞牛皮基質(zhì)材料本身結(jié)構(gòu)較為疏松且糖胺蛋白含量較高，因此保護(hù)液中的硫酸軟骨素組分濃度較低。脫細(xì)胞牛皮基質(zhì)相對(duì)于脫細(xì)胞小腸下粘膜來說材料厚度更大，因此提高保護(hù)液中聚乙二醇的濃度可以促進(jìn)熱傳導(dǎo)，使材料的凍干效果更為均勻。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞外基質(zhì)冷凍干燥保護(hù)液，其特征在于，是以生理鹽水為溶劑，組分包括硫酸軟骨素50 150mg/ml、維生素C I 5mg/ml、聚乙二醇65 380mg/ml、海藻糖10 100mg/ml、葡聚糖10 30mg/ml、絲氨酸I 16 y g/ml和蘇氨酸I 16 y g/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的冷凍干燥保護(hù)液，其特征在于，所述的組分包括硫酸軟骨素50 100mg/ml、維生素C I 5mg/ml、聚乙二醇65 250mg/ml、海藻糖10 50mg/ml、葡聚糖10 30mg/ml、絲氨酸I 10 y g/ml和蘇氨酸I 10 y g/ml。
3.使用權(quán)利要求I所述的細(xì)胞外基質(zhì)冷凍干燥保護(hù)液的方法，其特征在于，在室溫條件下，將細(xì)胞外基質(zhì)浸泡于不低于2倍體積的凍干保護(hù)液中，振蕩5 30分鐘，連同保護(hù)液一起轉(zhuǎn)入4°C水浴中，在達(dá)到4°C后，再以0. 5 2°C /分鐘的速度降溫至-45 _80°C維持I 6小時(shí)；在30分鐘內(nèi)使絕對(duì)真空壓力達(dá)到10 20Pa，再以3 5°C /分鐘的速度升溫至-15 -45°C，維持12 30小時(shí)；然后以5 15°C /分鐘的速度升溫至15 30°C，維持4 15小時(shí)后，結(jié)束凍干；使產(chǎn)品的含水率控制在2% 8%之間。
全文摘要
一種細(xì)胞外基質(zhì)冷凍干燥保護(hù)液，本發(fā)明是以生理鹽水為溶劑，組分包括硫酸軟骨素、維生素C、聚乙二醇、海藻糖、葡聚糖、絲氨酸和蘇氨酸。本發(fā)明保護(hù)液具有滲透性強(qiáng)、低溫條件下可玻璃化、富含負(fù)極性基團(tuán)和羥基、能與膠原分子高效粘附的優(yōu)點(diǎn)，保證了細(xì)胞外基質(zhì)凍干效果的穩(wěn)定均勻，低溫下保護(hù)液形成玻璃態(tài)能避免冰晶損傷蛋白結(jié)構(gòu)，并在基質(zhì)外層形成保護(hù)膜取代水分子與膠原形成氫鍵，保護(hù)膠原功能和三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。本發(fā)明的細(xì)胞毒性低，使用時(shí)經(jīng)生理鹽水或無菌水涮洗后即可使用；凍干后的細(xì)胞外基質(zhì)經(jīng)真空包裝在常溫下可保存三年以上；適于純化的細(xì)胞外基質(zhì)保存，如膠原、彈性蛋白、糖蛋白等，也適于由細(xì)胞外基質(zhì)材料構(gòu)建的各類生物材料。
文檔編號(hào)C07K1/00GK102746372SQ20121025113
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月19日
發(fā)明者羅海浪 申請(qǐng)人:陜西佰傲再生醫(yī)學(xué)有限公司