本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于可見光致體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層收割的硅/石墨烯基復(fù)合表面及其制備方法。

背景技術(shù)：

“細胞片層組織工程技術(shù)”一經(jīng)提出，就在組織工程修復(fù)及重建及細胞治療過程中，作為一種新的可構(gòu)建三維組織及器官中表現(xiàn)出巨大潛力。細胞片層不僅保存組織所必需的細胞表面蛋白、細胞間連接蛋白及細胞外基質(zhì)環(huán)境，還可提供促進細胞和組織再生的生物活性因子。目前，層層堆疊細胞片層組織工程技術(shù)被用于治療許多疾病(心臟、肝臟及泌尿系統(tǒng)等)，并表現(xiàn)出光明的前景。因此，高效獲取完整的高活性及功能性的細胞片層對于細胞片層組織工程來說是關(guān)鍵問題。目前，大多數(shù)的細胞片層獲取都是采用溫敏系統(tǒng)，而其存在的問題在于長時間的低溫會在一定程度上損傷細胞功能，并會促使一些非相關(guān)基因錯誤表達。同時，溫敏基板制備過程復(fù)雜，價格昂貴，也是限制其在組織工程應(yīng)用的另一個重要因素。因此，如何低成本的、高效的、易操縱的實現(xiàn)細胞片層收割對細胞片層技術(shù)的發(fā)展非常關(guān)鍵。

洪逸等采用光敏半導(dǎo)體二氧化鈦通過紫外光照改變材料表面的親疏水性成功獲得細胞片層(yihong,etal.light-inducedcelldetachmentforcellsheettechnology,biomaterials,34(2013)11-18)。但是，紫外光對細胞存在一定的毒性并可能造成基因突變，故這種方法也存在一定缺陷。因此，利用可見光實現(xiàn)細胞脫附受到關(guān)注。

太陽能是人類取之不盡的清潔能源，太陽能電池材料即對可見光敏感，并可將其轉(zhuǎn)化為電。因此，如何將可見光相應(yīng)的材料利用到可調(diào)控蛋白及細胞行為上，是一個值得研究的課題。本課題組之前利用可見光響應(yīng)的si(p/n)結(jié)基板及鈣鈦礦薄膜器件作為細胞培養(yǎng)表面，光照后基板表面積累負電荷實現(xiàn)吸附蛋白的脫附并最終獲取細胞片層(106085948a，106047692a)。因此，表面光生電荷的積累會對蛋白的吸附狀態(tài)進行調(diào)控。生理條件下，蛋白帶負電，并與基板相互總用。有研究表明，當(dāng)表面電性反轉(zhuǎn)(由負轉(zhuǎn)正)，蛋白的穩(wěn)定性下降，與基板的連接可能會受到破壞，蛋白穩(wěn)定的折疊狀態(tài)及疏水鍵被打破，蛋白的多肽鏈可能會發(fā)生重排(cnickpace，etal,charge-chargeinteractionsinfluencethedenaturedstateensembleandcontributetoproteinstability)。因此，制備光生正電荷積累的表面去調(diào)控蛋白的吸附狀態(tài)，從而獲取細胞片層值得研究。

本發(fā)明選取可見光生正電荷的帶有肖特基結(jié)的si/gr復(fù)合薄膜作為細胞培養(yǎng)表面，通過可見光的強弱、光照時間、si的摻雜濃度及細胞的種類等來調(diào)控光敏材料對可見光的響應(yīng)及表面光生正電荷的數(shù)量，研究可見光下帶正電的gr表面與吸附蛋白及細胞或細胞與細胞之間的相互作用，對于細胞片層脫附、組織工程、細胞治療等的發(fā)展都有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于可見光致體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層收割的硅/石墨烯(si/gr)基復(fù)合表面及其構(gòu)建方法，該si/gr基復(fù)合表面是典型的“三明治”結(jié)構(gòu)，可有效吸收可見光，并通過肖特基結(jié)將電子和空穴分離，使gr表面帶正電，此外該復(fù)合表面具有良好的細胞相容性。利用該si/gr基復(fù)合表面作為細胞培養(yǎng)表面，在可見光照射下gr表面帶正電使得表面吸附的蛋白層脫附，最終高效溫和的獲取低損傷的完整細胞片層。

本發(fā)明的一種用于可見光致體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層收割的硅/石墨烯(si/gr)基復(fù)合表面采用典型的“三明治”結(jié)構(gòu)，所述的si/gr基復(fù)合表面自下而上依次包括si基板、單層gr及蛋白層，所述的si/gr具有肖特基結(jié)，所述的si基板為n型摻雜；所述的蛋白層為胎牛血清、牛血清白蛋白、纖連蛋白或膠原蛋白層。

優(yōu)選地，其si基板厚度為100～1000μm，si基板晶面為(100)或(111)，si基板摻雜濃度為5×10¹⁵～1×10¹⁸/cm³；所述gr的厚度為0.3～0.4nm；所述的蛋白層為胎牛血清、牛血清白蛋白、纖連蛋白或膠原蛋白，可通過物理吸附制備得到。

本發(fā)明的一種用于可見光致體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層收割的硅/石墨烯(si/gr)基復(fù)合表面的構(gòu)建方法如下：利用機械轉(zhuǎn)移的方法將一層gr轉(zhuǎn)移到潔凈的si基板的拋光面，干燥后在氬氣環(huán)境下500攝氏度保溫60min，燒掉gr層的有機物，將所得si/gr用水和乙醇清洗干凈，將樣品放入蛋白溶液中浸泡0.5～24h，在gr層上物理吸附獲得蛋白層，所述的蛋白溶液為胎牛血清、牛血清白蛋白溶液、纖連蛋白溶液、膠原蛋白溶液。所述的蛋白溶液濃度通常為0.1～10mg/ml。

利用上述的硅/石墨烯(si/gr)基復(fù)合表面進行可見光致細胞收割的方法，是以si/gr基復(fù)合表面作為細胞培養(yǎng)表面接種細胞并進行細胞體外培養(yǎng)，再采用可見光照射該培養(yǎng)表面，gr表面帶正電使吸附蛋白脫附，最終細胞及細胞片層從上述器件表面脫附。

所述細胞為在體外模擬生理環(huán)境下培養(yǎng)的貼壁細胞，包括成骨細胞、成纖維細胞、成肌細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞或骨髓間充質(zhì)干細胞。

上述方法具體包括以下步驟：

a.在進行體外細胞培養(yǎng)前，將所述的si/gr基復(fù)合表面以紫外光照或蒸氣消毒方式消毒；

b.將上述復(fù)合表面作為體外細胞培養(yǎng)表面，在其表面以2×10⁴～2×10⁶個/cm²的密度種植細胞，加入細胞培養(yǎng)基，并放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～10天；

c.將經(jīng)上述培養(yǎng)后的培養(yǎng)表面移入pbs中，以波長為400～800nm、強度30～300mw/cm²的可見光照射上述si/gr復(fù)合薄膜1～20min，即可使培養(yǎng)后的細胞或細胞薄層脫附。

本發(fā)明的方法選擇在可見光照射下存在光生正電的si/gr基復(fù)合表面，其可以高效的吸收可見光并實現(xiàn)電子空穴高效分離，使gr表面帶正電，在細胞培養(yǎng)過程中將該器件作為細胞培養(yǎng)表面，所培養(yǎng)的細胞在經(jīng)可見光照射后，帶正電的gr表面誘發(fā)吸附蛋白脫附，使得細胞自發(fā)從培養(yǎng)器具表面脫離，實現(xiàn)細胞脫附。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明所用的si/gr基復(fù)合表面利用gr表面光生正電實現(xiàn)細胞/細胞片層的脫附，避免了傳統(tǒng)酶解法細胞脫附時對細胞功能造成的損傷，具有高效的、低損傷、操作簡便并且適用細胞范圍廣等特點，具有很強的實用性。對于散在的細胞，可使85％以上的細胞脫附；對于細胞薄層，則可使細胞薄層完整脫附。本發(fā)明細胞培養(yǎng)表面所需的si/gr基復(fù)合材料成本低，易于實現(xiàn)，便于推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為實施例2中細胞脫附流程圖；

圖2為實施例2中光致脫附細胞片層的活染色熒光圖。

圖3為實施例2中光致脫附細胞片層的死染色熒光圖；

圖4為光學(xué)顯微鏡獲得的細胞片層再遷移熒光圖片。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖來詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。

購買n型的單晶si片，單層gr經(jīng)過機械轉(zhuǎn)移的方法制備于si基板表面，獲得含有肖特基結(jié)的si/gr基復(fù)合表面，將制備好的si/gr基復(fù)合表面放入蛋白溶液中浸泡，得到物理吸附的蛋白層。并以此復(fù)合表面膜作為細胞培養(yǎng)表面，進行下列培養(yǎng)。si基板的厚度為100～1000μm，晶面為(100)及(111)，摻雜濃度為5×10¹⁵～1×10¹⁸/cm³，單層gr的厚度為0.3～0.4nm，復(fù)合薄膜表面為單層gr。

實施例1

在潔凈的si基板的拋光面采用機械轉(zhuǎn)移的方法制備一層gr，干燥后在氬氣環(huán)境下500攝氏度保溫60min，將所得si/gr用水和乙醇清洗干凈，將樣品放入0.1mg/ml的胎牛血清蛋白溶液中浸泡0.5h，在gr層上物理吸附獲得蛋白層，得到si/gr基復(fù)合薄膜。在上述si/gr基復(fù)合薄膜表面，進行成骨細胞體外培養(yǎng)，接種密度為2×10⁴個/cm²，放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，以波長為400～800nm、強度30mw/cm²的可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射20min，即可使95％細胞從表面脫離。

實施例2

在實例1所述的si/gr基復(fù)合薄膜表面，進行成骨細胞體外培養(yǎng)，接種密度為1×10⁵個/cm²，放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)7天后，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度50mw/cm²可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射10min，即可使細胞片層從表面脫離。圖1為采用nikon相機所觀察到的實施例2中培養(yǎng)細胞片層脫附的過程?？梢钥闯鼋?jīng)可見光照射后整個細胞片層實現(xiàn)完整脫附。圖2、3分別為實施例2中光致脫附后的細胞片層的活/死細胞染色，可以發(fā)現(xiàn)脫附后的細胞片層保持了高的活性。

實施例3

在潔凈的si基板的拋光面采用機械轉(zhuǎn)移的方法制備一層gr，干燥后在氬氣環(huán)境下500攝氏度保溫60min，將所得si/gr用水和乙醇清洗干凈，將樣品放入1mg/ml的牛血清白蛋白溶液中浸泡6h，在gr層上物理吸附獲得蛋白層。在上述si/gr基復(fù)合薄膜表面，進行成骨細胞體外培養(yǎng)，接種密度為5×10⁵個/cm²，放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度100mw/cm²可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射8min，即可使細胞片層從表面脫離。圖4為采用光學(xué)顯微鏡所觀察到的實施例3中培養(yǎng)細胞片層在可見光照后脫附再培養(yǎng)1天和3天后的遷移圖片?？梢钥闯鼋?jīng)可見光脫附后的細胞片層重新再培養(yǎng)后，能夠很好的爬出新的細胞，并保持良好的細胞形態(tài)及活力，說明可見光脫附的細胞片層保持了良好的再遷移性能，這在組織工程中細胞片層的再應(yīng)用是很關(guān)鍵的。

實施例4

在潔凈的si基板的拋光面采用機械轉(zhuǎn)移的方法制備一層gr，干燥后在氬氣環(huán)境下500攝氏度保溫60min，將所得si/gr用水和乙醇清洗干凈，將樣品放入10mg/ml的纖連蛋白溶液中浸泡24h，在gr層上物理吸附獲得蛋白層。在上述si/gr基復(fù)合薄膜表面，進行成纖維細胞體外培養(yǎng)，接種密度為1×10⁶個/cm²，放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度40mw/cm²可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射15min，即可使細胞片層從表面完整脫離。

實施例5

在潔凈的si基板的拋光面采用機械轉(zhuǎn)移的方法制備一層gr，干燥后在氬氣環(huán)境下500攝氏度保溫60min，將所得si/gr用水和乙醇清洗干凈，將樣品放入5mg/ml的膠原蛋白溶液中浸泡6h，在gr層上物理吸附獲得蛋白層。在上述si/gr基復(fù)合薄膜表面，進行成肌細胞體外培養(yǎng)，接種密度為2×10⁴個/cm²，放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天后，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度200mw/cm²可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射5min，即可使細胞片層從表面完整脫離。

實施例6

在實例5所述的si/gr基復(fù)合薄膜表面，進行上皮細胞體外培養(yǎng)，接種密度為8×10⁴個/cm²，放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度300mw/cm²可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射1min，即可使細胞片層從表面完整脫離。

實施例7

在實例5所述的si/gr基復(fù)合薄膜表面，進行骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)，接種密度為1×10⁵個/cm²，放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度50mw/cm²可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射6min，即可使細胞片層從表面完整脫離。

實施例8

在實例5所述的si/gr基復(fù)合薄膜表面，進行內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)，接種密度為1.5×10⁶個/cm²，放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天后，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度150mw/cm²可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射3min，即可使細胞片層從表面完整脫離。

實施例9

在實例5所述的si/gr基復(fù)合薄膜表面，進行成纖維細胞體外培養(yǎng)，接種密度為5×10⁴個/cm²，放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，以波長為400～800nm、強度30mw/cm²可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射5min，85％細胞從基板表面脫離。

實施例10

在實例5所述的si/gr基復(fù)合薄膜表面，進行成肌細胞體外培養(yǎng)，接種密度為4×10⁴個/cm²，放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，以波長為400～800nm、強度50mw/cm²可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射20min，91％的細胞從基板表面脫離。

實施例11

在實例5所述的si/gr基復(fù)合薄膜表面，進行上皮細胞體外培養(yǎng)，接種密度為6×10⁴個/cm²，放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，以波長為400～800nm、強度100mw/cm²可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射10min，97％的細胞從基板表面脫離。

實施例12

在實例5所述的si/gr基復(fù)合薄膜表面，進行骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)，接種密度為5×10⁴個/cm²，放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，以波長為400～800nm、強度300mw/cm²可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射8min，95％的細胞從基板表面脫離。

實施例13

在實例5所述的si/gr基復(fù)合薄膜表面，進行內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)，接種密度為2×10⁴個/cm²，放入37攝氏度恒溫及5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，以波長為400～800nm、強度200mw/cm²可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射1min，85％的細胞從基板表面脫離。