本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系
背景技術(shù)：
：間充質(zhì)干細(xì)胞是普遍存在于不同組織的多潛能成體干細(xì)胞，目前已經(jīng)從骨髓、脂肪、牙髓、羊膜、絨毛膜、蛻膜、臍帶、臍血等組織中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞。已有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化能力強(qiáng)，倍增時(shí)間短，具有免疫調(diào)節(jié)作用和低下的免疫原性，易于轉(zhuǎn)染的特性，是再生醫(yī)學(xué)的一種理想種子細(xì)胞和基因治療載體，已成為干細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究的熱點(diǎn)。目前，使用的間充質(zhì)干細(xì)胞主要為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，其來(lái)源方便快捷，可是該來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞具有如下缺陷：1.在骨髓中含量低（約0.1～0.01‰），而且隨著年齡增加，其擴(kuò)增、分化能力和細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)；2.存在倫理問(wèn)題，來(lái)源受到限制；3.供者有不適感，不易接受；4.病毒感染機(jī)會(huì)大；5.異體移植的免疫排斥強(qiáng)。人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞是一種能替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并可彌補(bǔ)其缺陷的間充質(zhì)干細(xì)胞。人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞有如下優(yōu)勢(shì)：1.取材幾乎不受限制。胎盤為“廢棄”物，只要在正常分娩的健康產(chǎn)婦知情同意的基礎(chǔ)上，都能夠提供胎盤。供者無(wú)痛苦，污染機(jī)會(huì)少；2.胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞更加原始，免疫原性更低，獲得的原代間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量大；3.不涉及社會(huì)、倫理及法律方向的更多爭(zhēng)論。因此人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞受到再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞是繼造血干細(xì)胞之后，第二種用于臨床治療的干細(xì)胞，國(guó)外已經(jīng)有7種間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品用于臨床。我國(guó)在間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究方面起步早，有些基礎(chǔ)研究還處于國(guó)際領(lǐng)先水平，但是我國(guó)的臨床轉(zhuǎn)化水平不足，沒(méi)有相關(guān)臨床細(xì)胞產(chǎn)品。因此，必定激發(fā)我國(guó)科研人員和臨床醫(yī)師需要大量的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究；另一方面，間充質(zhì)干細(xì)胞傳代過(guò)程影響細(xì)胞質(zhì)量，目前公認(rèn)的最有效的細(xì)胞代數(shù)為p3～p8代間充質(zhì)干細(xì)胞。如何體外簡(jiǎn)便地培養(yǎng)出大量原代間充質(zhì)干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化應(yīng)用的關(guān)鍵之一，也是間充質(zhì)干細(xì)胞研究領(lǐng)域中的重要研究方向。本發(fā)明通過(guò)三次培養(yǎng)，提高了p0代細(xì)胞數(shù)量，為將來(lái)的研究提供材料保障，同時(shí)減少了同一研究中，使用不同批次細(xì)胞產(chǎn)生的差異。因此建立一種簡(jiǎn)便的能獲得大量p0代細(xì)胞的人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系是亟需解決的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，能夠提高p0代細(xì)胞產(chǎn)量。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，包括以下步驟：（1）人胎盤絨毛膜組織處理后，進(jìn)行初次培養(yǎng)，7天后倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)情況，更換培養(yǎng)基；（2）初次培養(yǎng)瓶中的組織塊、培養(yǎng)液和沖洗液離心后重新接種，進(jìn)行再次培養(yǎng)，7天后倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)情況，更換培養(yǎng)基；（3）再次培養(yǎng)瓶中的組織塊、培養(yǎng)液和沖洗液離心后重新接種，進(jìn)行第三次培養(yǎng)，7天后倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)情況，更換培養(yǎng)基；（4）待三次培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時(shí)，用胰酶消化傳代，即得人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟（1）所述7天是指培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中處于完全靜止?fàn)顟B(tài)，不移動(dòng)、不用顯微鏡觀察和不進(jìn)行培養(yǎng)液更換。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟（1）所述更換培養(yǎng)基是指全量換液。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟（2）所述初次培養(yǎng)瓶中的組織塊、培養(yǎng)液和沖洗液是指初次培養(yǎng)7天后，第一次換液時(shí)，培養(yǎng)瓶中的組織塊和培養(yǎng)液，以及用生理鹽水沖洗培養(yǎng)瓶底的沖洗液。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟（2）所述離心為1500r/min，5min。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟（2）所述再次培養(yǎng)接種的培養(yǎng)瓶為初次培養(yǎng)接種培養(yǎng)瓶數(shù)量的一半。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟（2）所述7天是指培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中處于完全靜止?fàn)顟B(tài)，不移動(dòng)、不用顯微鏡觀察和不進(jìn)行培養(yǎng)液更換。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟（2）所述更換培養(yǎng)基是指全量換液。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟（3）所述再次培養(yǎng)瓶中的組織塊、培養(yǎng)液和沖洗液是指再次培養(yǎng)7天后，第一次換液時(shí)，培養(yǎng)瓶中的組織塊和培養(yǎng)液，以及用生理鹽水沖洗培養(yǎng)瓶底的沖洗液。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟（3）所述離心為1500r/min，5min。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟（3）所述7天是指培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中處于完全靜止?fàn)顟B(tài)，不移動(dòng)、不用顯微鏡觀察和不進(jìn)行培養(yǎng)液更換。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟（3）所述第三次培養(yǎng)接種的培養(yǎng)瓶為再次培養(yǎng)接種培養(yǎng)瓶數(shù)量的一半。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟（3）所述更換培養(yǎng)基是指全量換液。根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（4）所述胰蛋白酶消化前，先用生理鹽水清洗細(xì)胞以除去培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)過(guò)程中，除了接種培養(yǎng)的七天，每天應(yīng)該用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不夠應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充或更換，細(xì)胞達(dá)到80-90%融合狀態(tài)時(shí)，及時(shí)傳代。本發(fā)明適用無(wú)血清培養(yǎng)基，不含血清，未引入外源動(dòng)物蛋白，使培養(yǎng)的細(xì)胞更利于臨床應(yīng)用。本發(fā)明沒(méi)有適用抗生素，使培養(yǎng)的細(xì)胞更利于后繼研究和臨床應(yīng)用。本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：1.簡(jiǎn)便：初次培養(yǎng)和再次培養(yǎng)的第一次換液時(shí)，原本廢棄的組織塊、培養(yǎng)液和沖洗液離心后重新接種培養(yǎng)，只要注意無(wú)菌操作即可，無(wú)需特別的處理程序。2.提高了p0代細(xì)胞的產(chǎn)量：經(jīng)過(guò)三次培養(yǎng)，共獲得的p0代細(xì)胞數(shù)量比僅僅進(jìn)行過(guò)初次培養(yǎng)獲得的細(xì)胞數(shù)量翻倍。有利于人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞的后繼研究和應(yīng)用，以及人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)的建立奠定基礎(chǔ)。3.充分利用了標(biāo)本：一次標(biāo)本處理，三次接種培養(yǎng)，三次細(xì)胞收獲，提高了標(biāo)本的利用率；由于目前絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)前的分離處理操作比較繁瑣，阻礙了人絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化應(yīng)用。本發(fā)明使得一次分離處理能夠進(jìn)行三次細(xì)胞培養(yǎng)，獲得比初次培養(yǎng)翻倍的細(xì)胞數(shù)，有利于絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用研究。附圖說(shuō)明圖1為倒置顯微鏡下p3代人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)圖。符合國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)推薦的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)。圖2是三次培養(yǎng)p3代人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的比較。三次培養(yǎng)獲得細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。圖3是三次培養(yǎng)p3代人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化脂肪細(xì)胞，紅油o染色陽(yáng)性；成骨細(xì)胞，茜素紅染色陽(yáng)性。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。有用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。本發(fā)明所述的無(wú)血清培養(yǎng)基購(gòu)自gibco公司，貨號(hào)為a10334-01。本發(fā)明所述的胰蛋白酶購(gòu)自gibco公司，貨號(hào)為25200056。本發(fā)明所述的膠原酶ⅱ購(gòu)自ibco公司，貨號(hào)為17101-015。本發(fā)明所述的細(xì)胞凍存混合液，購(gòu)自wak-chemiemedicalgmbh，貨號(hào)為wak-dex40-50-5。實(shí)施例1：人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)人胎盤絨毛膜組織處理后，進(jìn)行初次培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)7天后，全量更換培養(yǎng)基，初次培養(yǎng)瓶中的組織塊、培養(yǎng)液和沖洗液離心后重新接種，進(jìn)行再次培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)7天后全量更換培養(yǎng)基；再次培養(yǎng)瓶中的組織塊、培養(yǎng)液和沖洗液離心后重新接種，進(jìn)行第三次培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)7天后全量更換培養(yǎng)基；待三次培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時(shí)，用胰酶消化傳代，即得人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞。初次培養(yǎng)、再次培養(yǎng)和第三次培養(yǎng)獲得的細(xì)胞數(shù)、收獲時(shí)間見(jiàn)表1。培養(yǎng)批次獲得時(shí)間（d）單瓶細(xì)胞數(shù)（×106）總細(xì)胞數(shù)（×106）初次培養(yǎng)12.00±0.641.12±0.1511.73±2.09再次培養(yǎng)8.87±0.632.10±0.1611.12±1.42第三次培養(yǎng)12.33±0.801.04±0.162.69±0.71表1比較實(shí)施例2：人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)人胎盤絨毛膜組織處理后，進(jìn)行初次培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)7天后，全量更換培養(yǎng)基，待培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時(shí)，用胰酶消化傳代，即得人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞。比較實(shí)施例3：人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)人胎盤絨毛膜組織處理后，進(jìn)行初次培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)7天后，全量更換培養(yǎng)基，初次培養(yǎng)瓶中的組織塊、培養(yǎng)液和沖洗液離心后重新接種，進(jìn)行再次培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)7天后全量更換培養(yǎng)基；再次培養(yǎng)瓶中的組織塊、培養(yǎng)液和沖洗液離心后重新接種，進(jìn)行第三次培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)7天后全量更換培養(yǎng)基；將第三次培養(yǎng)的培養(yǎng)基和沖洗的生理鹽水，離心（1500r/min，5min）后的沉淀用于第四次接種，培養(yǎng)瓶的數(shù)量為初次培養(yǎng)的八分之一，7天后，置于倒置顯微鏡下觀察，基本看不到有部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，微小組織塊基本懸浮于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)至第20天，細(xì)胞未到80%融合度，生長(zhǎng)曲線分析，明顯同其他批次培養(yǎng)不同。共進(jìn)行過(guò)5例第四次培養(yǎng)，到20天時(shí)，均未達(dá)到80%融合度，生長(zhǎng)緩慢。故本專利申請(qǐng)的方法只進(jìn)行三次接種培養(yǎng)。實(shí)施例4：人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代、凍存和復(fù)蘇當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞達(dá)到80-90%融合狀態(tài)時(shí)，移除培養(yǎng)基，用生理鹽水沖洗培養(yǎng)瓶?jī)纱?，加?ml胰蛋白酶，置于37℃培養(yǎng)箱中消化約3-5分鐘，加入培養(yǎng)基15ml，終止胰酶消化作用，取100ul用于計(jì)細(xì)胞活率和細(xì)胞數(shù)。離心（1500r/min，5min）后按1:2傳代接種，置于飽和濕度、37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%co2的培養(yǎng)箱中，一般2-3天即可達(dá)到80-90%融合狀態(tài)，需要再次傳代。達(dá)到需要凍存的代數(shù)時(shí)，按照傳代消化后，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，加入培養(yǎng)基和細(xì)胞凍存液，使得細(xì)胞濃度為1×106/ml，細(xì)胞凍存液為10%?；靹蚝螅盅b于2ml的凍存管中，轉(zhuǎn)移至程序降溫儀中，按照第一步降溫速度為5℃/min，降到4℃，第二步降溫速度為1℃/min，降到-45℃，第三步降溫速度為5℃/min，降到-100℃。當(dāng)溫度到達(dá)-100℃，取出凍存盒，轉(zhuǎn)移至-196℃液氮中。需要復(fù)溫時(shí)，從液氮中取出凍存管，立即置于37-42℃水浴箱中并不斷搖晃凍存管，吸取溶化后的細(xì)胞懸液于離心管中，加入5-10ml培養(yǎng)基，然后離心（1500r/min，5min），去除上清液，沉淀加入培養(yǎng)基后置于飽和濕度、37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%co2的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，第二天即可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞達(dá)到80-90%融合狀態(tài)時(shí)，進(jìn)行傳代。實(shí)施例5：人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性鑒定以及三次培養(yǎng)細(xì)胞的比較獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞需要進(jìn)行病原學(xué)檢查，排除包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、hiv、梅毒等感染，并排除細(xì)菌、真菌和支原體等污染，另外，按照國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)推薦間充質(zhì)干細(xì)胞認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)，獲得的人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞的cd45、cd34、、cd14、cd19和hla-dr的表達(dá)率≤2%，而cd90、cd105、cd73的表達(dá)率≥95%，成骨和成脂誘導(dǎo)分化檢測(cè)陽(yáng)性，同時(shí)比較三次培養(yǎng)是否存在差異，故進(jìn)行如下檢測(cè)：（1）人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測(cè)分別取三次培養(yǎng)至第三代人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞，抗體標(biāo)記后進(jìn)行檢測(cè)。所有標(biāo)本達(dá)到cd90、cd105和cd73的表達(dá)率大于95%，cd45、cd34、、cd14、cd19和hla-dr的表達(dá)率小于2%，符合國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)推薦的間充質(zhì)干細(xì)胞認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)，對(duì)三次培養(yǎng)細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行比較，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05），見(jiàn)表2。培養(yǎng)批次cd34cd45cd14cd19hla-drcd73cd90cd105初次培養(yǎng)0.81±0.121.24±0.101.21±0.150.11±0.091.15±0.2410099.17±0.1499.71±0.09再次培養(yǎng)0.78±0.211.21±0.271.23±0.130.11±0.121.12±0.3110099.21±0.1899.82±0.03第三次培養(yǎng)0.82±0.151.10±0.141.14±0.130.10±0.111.21±0.1110098.67±0.1399.52±0.08表2（2）人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化檢測(cè)分別取三次培養(yǎng)至第三代人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到80%融合度時(shí)，換成成骨或成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)四周后，分別用茜素紅染色試劑盒或紅油o染色試劑盒染色。誘導(dǎo)后的細(xì)胞經(jīng)茜素紅染色，可見(jiàn)紅色礦化沉著物，而油紅o染色可見(jiàn)胞漿內(nèi)脂滴染成紅色。說(shuō)明人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞在體外特定環(huán)境下具有向成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞分化的潛能。三次培養(yǎng)的細(xì)胞均分化陽(yáng)性。（3）人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線檢測(cè)分別取三次培養(yǎng)至第三代人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞接種于96孔板上，設(shè)置7組，每組7孔，置于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h，任意選擇一組，加入10ulcck-8溶液，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度值（激發(fā)波長(zhǎng)450nm），用無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基做空白對(duì)照，連續(xù)7天，每天取7孔的吸光度均值繪制生長(zhǎng)曲線。三次培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線比較沒(méi)有差異（p＞0.05）。（4）人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞病原學(xué)檢查分別取三次培養(yǎng)至第三代人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞，用培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液進(jìn)行病原學(xué)檢查，排除包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、hiv、梅毒等感染，并排除細(xì)菌、真菌和支原體等污染。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改造，這些變化和改造都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。當(dāng)前第1頁(yè)12