本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)基領(lǐng)域，特別涉及一種用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：皮膚顏色主要由皮膚制造的色素和皮膚表層所含天然色素的組合所決定。皮膚上皮層表面的表皮中含有能制造皮膚色素(即黑色素)的表皮黑素細(xì)胞。色素減退或無色素性皮膚病患者的皮膚黑素細(xì)胞缺失、被破壞或無功能，從而在身體各部位出現(xiàn)白斑。白癜風(fēng)是一種特殊的皮膚色素性疾病，以出現(xiàn)白斑和表皮黑素細(xì)胞缺失為主要特征。當(dāng)前治療包括光敏劑(如補(bǔ)骨脂素)聯(lián)合UVA照射、窄波UVB照射或者局部使用皮質(zhì)類固醇(腎上腺)，但療效低，并伴隨一定副作用。外科移植技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于白癜風(fēng)治療，如負(fù)壓吸皰移植、刃厚皮片移植或微小皮片移植。這些治療在局限性和小面積病損的患者中有效。但對白斑面積大或者白斑數(shù)量多的患者，獲得足夠的移植皮片具有一定困難。要成功地進(jìn)行大面積的自體表皮移植，需有大的移植皮片，內(nèi)含大量細(xì)胞，特別是黑素細(xì)胞。或者，可通過細(xì)胞培養(yǎng)大量擴(kuò)增自體黑素細(xì)胞用于移植。這種方法需要從病人健康皮膚取得黑素細(xì)胞，在體外將其培養(yǎng)在合適環(huán)境中(可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和黑素制造)使之大量擴(kuò)增，再在合適條件下將細(xì)胞移植至病人病變處皮膚，使之恢復(fù)正常顏色。關(guān)于黑素細(xì)胞培養(yǎng)基已有報(bào)道，Olsson等報(bào)告的表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)基配方，包含PC-1，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，丁酰環(huán)腺苷酸(dbcAMP)，青霉素-鏈霉素。該培養(yǎng)基用于在自體黑素細(xì)胞移植中擴(kuò)增分離得到表皮黑素細(xì)胞。此培養(yǎng)基不包含促進(jìn)黑素細(xì)胞生長和分化必需的血清。此外，bFGF的濃度(5ng/ml)太低，不能刺激表皮黑素細(xì)胞作足夠的生長。而dbcAMP不是一種天然物質(zhì)，作用時間也很短。另外，對所培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量和黑素含量均無量化指標(biāo)報(bào)道，因此，很難評價這一培養(yǎng)基的效率。另外的培養(yǎng)基，如HU16(FIC培養(yǎng)基)已被我們用于培養(yǎng)表皮黑素細(xì)胞。HU16培養(yǎng)基包括F12培養(yǎng)基(一種商品化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，補(bǔ)充有效濃度的bFGF、IBMX，霍亂毒素和胎牛血清。該培養(yǎng)基已經(jīng)在中國臺灣成功應(yīng)用于120例白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞移植治療中的黑素細(xì)胞培養(yǎng)。另一種表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)基(HU74)，含有bFGF、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、腎上腺素和α-MSH，已經(jīng)建立并在美國成功申報(bào)專利(美國專利6943024和7132279)。雖然培養(yǎng)表皮黑素細(xì)胞的培養(yǎng)基很多，但都不是最佳的。因此，一些患者因?yàn)榧?xì)胞生長不佳，必須長時間等待；另一小部分患者細(xì)胞生長差，達(dá)不到移植需要。另外，一些移植成功的病人在移植區(qū)域的邊緣缺乏色素形成，這可能與培養(yǎng)基不能有效刺激細(xì)胞的遷移有關(guān)。中國專利CN101735976B公布了一種用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可用于培養(yǎng)增殖能力、遷移能力和黑素合成能力增強(qiáng)的表皮黑素細(xì)胞。但依舊含有5-30％的血清，血清的整個流程極其復(fù)雜，造價高昂，而且血清中可能帶有朊病毒，血清的批次質(zhì)量也缺少穩(wěn)定性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供一種用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基新配方，解決了血清中可能帶有朊病毒，血清的批次缺少穩(wěn)定性等問題。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，1包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基及以下成分和濃度：人轉(zhuǎn)鐵蛋白15-100mg/L、胰島素10-30mg/L、谷氨酰胺1-10mg/L、β-成纖維細(xì)胞生長因子0.1-5ug/L、表皮生長因子5-10ug/L、腎上腺素50-300ug/L，鏈霉素1-30mg/L、氯化鈣10-50mg/L、硝酸鐵0.1-1mg/L、亞硒酸鈉1-10ug/L、硫酸銅1-10ug/L、硫酸鋅0.1-1mg/L、維生素E0.1-30mg/L、乙醇胺0.1-50mg/L磷酸乙醇0.1-10mg/L和雙丁酰環(huán)磷酸腺苷5.3-6.2ug/L。優(yōu)選地，所述用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基及以下成分和濃度組成：人轉(zhuǎn)鐵蛋白25mg/L、胰島素18mg/L、β-成纖維細(xì)胞生長因子1ug/L、表皮生長因子6.5ug/L、腎上腺素75ug/L，鏈霉素8mg/L、氯化鈣15mg/L、硝酸鐵0.8mg/L、亞硒酸鈉4ug/L、硫酸銅1.5ug/L、硫酸鋅0.6mg/L、維生素E9mg/L、乙醇胺3mg/L、磷酸乙醇10mg/L和雙丁酰環(huán)磷酸腺苷為5.4ug/L。優(yōu)選地，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Ham’sF12與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明培養(yǎng)基具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.本發(fā)明培養(yǎng)基，是一種用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，解決了血清中可能帶有朊病毒，血清的批次缺少穩(wěn)定性等問題。2.本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)黑素細(xì)胞能力與現(xiàn)有黑素細(xì)胞培養(yǎng)基功能相當(dāng)，且本發(fā)明培養(yǎng)基對黑素細(xì)胞分泌黑素有意外的促進(jìn)作用。具體實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。實(shí)施例1一種用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基一種用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基由以下成分及其濃度組成：人轉(zhuǎn)鐵蛋白15mg/L、胰島素10mg/L、谷氨酰胺1mg/L、β-成纖維細(xì)胞生長因子0.1ug/L、表皮生長因子5ug/L、腎上腺素50ug/L，鏈霉素1mg/L、氯化鈣10mg/L、硝酸鐵0.1mg/L、亞硒酸鈉1ug/L、硫酸銅1ug/L、硫酸鋅0.1mg/L、維生素E0.1mg/L、乙醇胺0.1mg/L、磷酸乙醇0.1mg/L和雙丁酰環(huán)磷酸腺苷6.2ug/L，溶劑為Ham’sF12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。實(shí)施例2一種用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基一種用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基由以下成分及其濃度組成：人轉(zhuǎn)鐵蛋白100mg/L、胰島素30mg/L、谷氨酰胺10mg/L、β-成纖維細(xì)胞生長因子5ug/L、表皮生長因子10ug/L、腎上腺素300ug/L，鏈霉素30mg/L、氯化鈣50mg/L、硝酸鐵1mg/L、亞硒酸鈉10ug/L、硫酸銅10ug/L、硫酸鋅1mg/L、維生素E30mg/L、乙醇胺50mg/L、磷酸乙醇0.1mg/L和雙丁酰環(huán)磷酸腺苷5.3ug/L，溶劑為Ham’sF12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。實(shí)施例3一種用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基一種用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基由以下成分及其濃度組成：人轉(zhuǎn)鐵蛋白25mg/L、胰島素18mg/L、β-成纖維細(xì)胞生長因子1ug/L、表皮生長因子6.5ug/L、腎上腺素75ug/L，鏈霉素8mg/L、氯化鈣15mg/L、硝酸鐵0.8mg/L、亞硒酸鈉4ug/L、硫酸銅1.5ug/L、硫酸鋅0.6mg/L、維生素E9mg/L、乙醇胺3mg/L、磷酸乙醇0.1mg/L和雙丁酰環(huán)磷酸腺苷5.4ug/L，溶劑為Ham’sF12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。對比例1一種用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基一種用于表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基由以下成分及其濃度組成：人轉(zhuǎn)鐵蛋白25mg/L、胰島素18mg/L、β-成纖維細(xì)胞生長因子1ug/L、表皮生長因子6.5ug/L、腎上腺素75ug/L，鏈霉素8mg/L、氯化鈣15mg/L、硝酸鐵0.8mg/L、亞硒酸鈉4ug/L、硫酸銅1.5ug/L、硫酸鋅0.6mg/L、維生素E9mg/L、乙醇胺3mg/L、磷酸乙醇0.1mg/L和雙丁酰環(huán)磷酸腺苷6.5ug/L，溶劑為Ham’sF12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。與實(shí)施例3相比，雙丁酰環(huán)磷酸腺苷濃度增加。試驗(yàn)一、培養(yǎng)的表皮黑素細(xì)胞的細(xì)胞生長檢測1.試驗(yàn)對象：實(shí)施例1-3得到的表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基2.試驗(yàn)方法：(1)表皮黑素細(xì)胞的分離和培養(yǎng)細(xì)胞樣本在0.25％(w/v)胰酶(GIBCO，Carlsbad，Calif.)中在37℃溫度下孵育15分鐘，0.2％(w/v)EDTA(Sigma，St.Louis，Mo.)中繼續(xù)孵育10分鐘。用鑷子小心的將皮片上的表皮細(xì)胞分離下來，形成表皮細(xì)胞懸液。表皮細(xì)胞離心后，種植在25cm2的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶放置在37℃溫度下的CO2培養(yǎng)箱中(95％空氣，5％CO2)。3天后，加入100μg/ml基因素以去除角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。每3天換液一次。黑素細(xì)胞一般在2周后基本融合。細(xì)胞融合后，用胰酶-EDTA溶液脫下，離心，稀釋，傳代培養(yǎng)。在移植時，黑素細(xì)胞用胰酶-EDTA溶液脫下，離心后用F12培養(yǎng)基重懸。(2)表皮黑素細(xì)胞的細(xì)胞生長檢測表皮黑素細(xì)胞以2×104/孔的密度接種于24孔板，24h后，分別采用實(shí)施例1、2、3及對比例1中的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每3天換液一次。6天后，用胰酶-EDTA脫下細(xì)胞，以含10％血清的培養(yǎng)基終止消化。細(xì)胞懸液離心后，用200μlF12培養(yǎng)基重懸沉淀，用Pasteur移液管轉(zhuǎn)移20μL的細(xì)胞懸液至血球計(jì)數(shù)器，在光學(xué)顯微鏡下觀察。計(jì)數(shù)4個1mm3區(qū)域中的細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)量用下面的公式1計(jì)算，四次計(jì)數(shù)，取平均值。所有實(shí)驗(yàn)樣本都重復(fù)3次。公式1：c＝0.2×n×104c＝細(xì)胞量(cells/mL)；n＝細(xì)胞計(jì)數(shù)。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不同培養(yǎng)基中表皮黑素細(xì)胞量檢測結(jié)果，如表1所示：表1不同培養(yǎng)基中表皮黑素細(xì)胞量所用培養(yǎng)基細(xì)胞量(104cells/mL)實(shí)施例1540實(shí)施例2530實(shí)施例3550對比例1408由表1可知，在培養(yǎng)6天后，本發(fā)明配制得到的細(xì)胞基中細(xì)胞量均高于對比例培養(yǎng)基中黑素細(xì)胞量，并且實(shí)施例3配制得到的培養(yǎng)基培養(yǎng)黑素細(xì)胞量最多。試驗(yàn)二、培養(yǎng)的表皮黑素細(xì)胞的黑色素含量檢測1.試驗(yàn)對象：實(shí)施例1-3及對比例1得到的表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基2.試驗(yàn)方法：表皮黑素細(xì)胞以2×104/孔的密度接種于24孔板。24h后，分為四組，組1、組2、組3、組4，分別采用實(shí)施例1、2、3及對比例1配制得到的培養(yǎng)基。每3天換液一次。6天后將黑素細(xì)胞用胰酶-EDTA脫下并用血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。再將細(xì)胞懸液離心，沉淀用1N的NaOH溶液溶解。通過分光光度計(jì)在475nm處檢測溶液的光密度值，對照用合成的黑素(Sigma，St.Louis，Mo.)所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出黑素含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如表2所示。表2不同培養(yǎng)基中表皮黑素細(xì)胞的黑色素含量由表2可知，采用本發(fā)明配制得到的培養(yǎng)基中黑素細(xì)胞分泌黑色素的量均高于對比例1，實(shí)施例3中培養(yǎng)基所得黑色素含量最高，與對比例1中培養(yǎng)基所得黑色素含量相比提高了1.69倍。由此可知，本發(fā)明配制得到的培養(yǎng)基對黑素細(xì)胞分泌黑色素有意外的促進(jìn)作用。以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例，顯然本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可有許多改動。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有改動，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3