專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種洋蔥表皮細胞遺傳轉(zhuǎn)化的方法，特別涉及一種利用農(nóng)
桿菌"gra^cfeWwm mme/ac/ms)介導(dǎo)的簡便、高效地4每外源基因轉(zhuǎn)化進 入洋蔥鱗莖葉內(nèi)表皮細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
洋蔥鱗莖葉內(nèi)表皮因具有取材方便，細胞結(jié)構(gòu)明顯，透明，無葉綠體 干擾，便于觀察，可進行活體檢測等優(yōu)點，被作為植物遺傳轉(zhuǎn)化受體，廣 泛應(yīng)用于蛋白的亞細胞定位，啟動子活性檢測，以及細胞動態(tài)生理活動等 方面的研究，近年來，隨著細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，通過洋 蔥表皮細胞作為受體來研究基因、蛋白質(zhì)、啟動子等的功能和特性逐漸成 為分子生物學(xué)研究的一個熱點。
目前，對洋蔥表皮細胞的遺傳轉(zhuǎn)化均采用的是粒子轟擊轉(zhuǎn)化法。但粒 子轟擊轉(zhuǎn)化法需要貴重的基因槍設(shè)備，需要昂貴的金粉作為載體材料，而 且，該轉(zhuǎn)化方法受多種理化和生理因素影響，轉(zhuǎn)化效率低，轉(zhuǎn)基因植物常 出現(xiàn)非正常整合的嵌合體。另外，操作者所使用的組織材料和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不 完全相同也增加了實驗的不確定因素，難度以及成本。這些因素極大地限 制了洋蔥表皮細胞在細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中的實際運用。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有的粒子轟擊法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞的難度大、成本高、儀 器設(shè)備要求高等問題，本發(fā)明的目的在于提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮 細胞轉(zhuǎn)化方法。該方法只需常規(guī)的菌株和培養(yǎng)基，無須昂貴的實驗設(shè)備和 金粉等載體材料，而且操作簡便易行，實驗成本低，轉(zhuǎn)化頻率高，拷貝數(shù) 少，遺傳表達穩(wěn)定性較好，實驗周期短。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn) 一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮 細胞轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟
(1) 在無菌環(huán)境中，除去洋蔥鱗莖外層的3 5層鱗片葉，將洋蔥鱗 莖消毒后用無菌水洗滌干凈，切開洋蔥鱗莖，取中層靠近鱗莖內(nèi)部的鱗莖 葉，撕下洋蔥單層內(nèi)表皮塊。
(2) 含有農(nóng)桿菌的滲透培養(yǎng)基的配制將含待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株
接種至YEB液體培養(yǎng)液中，28'C振蕩培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)物離心收集農(nóng)桿菌 菌體，并重懸于預(yù)冷至4'C的滲透培養(yǎng)基中，使該含有農(nóng)桿菌的滲透培養(yǎng)基 濃度在OD600=0.2 1.5左右；所述滲透培養(yǎng)基為MS+10mM MgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01% (W/V) 2-N嗎啡啉乙磺酸。
(3) 轉(zhuǎn)化將洋蔥單層內(nèi)表皮塊浸浮在上述含有農(nóng)桿菌的滲透培養(yǎng)基 中，使農(nóng)桿菌與洋蔥單層內(nèi)表皮塊充分接觸5 30分鐘進行轉(zhuǎn)化后，夾起 洋蔥單層內(nèi)表皮塊，濾干菌液后平鋪于MS固體培養(yǎng)基，于25t:, 16小時 光照/8小時黑暗的培養(yǎng)條件中，共培養(yǎng)16 24小時。
為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明，所述洋蔥鱗莖消毒是采用75%乙醇消毒。而 且，在常規(guī)的滲透培養(yǎng)基成分(MS培養(yǎng)基+100mMol/L乙酰丁香酮)的基 礎(chǔ)上添加了 10mM MgCl2和2-N嗎啡啉乙磺酸進行優(yōu)化，能進一步保存從 鱗莖剝離下來的鱗莖葉表皮細胞的生理活力，提高其轉(zhuǎn)化效率。
所述農(nóng)桿菌菌株為LBA4404菌株、EHA105菌株或GV3101菌株，通過 上述這些農(nóng)桿菌作為攜帶載體，在農(nóng)桿菌感染帶有傷口的洋蔥單層內(nèi)表皮 塊時，將與GFP、 YFP或GUS等報告基因融合的外源基因或啟動子序列導(dǎo)入 洋蔥表皮細胞。
為了使洋蔥表皮細胞的轉(zhuǎn)化效果最為穩(wěn)定和高效，特別優(yōu)選步驟(2) 使該含有農(nóng)桿菌的滲透培養(yǎng)基濃度為OD幼()-l.O，優(yōu)選步驟(3)使農(nóng)桿菌 與洋蔥單層內(nèi)表皮塊充分接觸20分鐘進行轉(zhuǎn)化。
所述YEB液體培養(yǎng)液包括YEB+125ug/ ml鏈霉素+50ug/ ml卡那霉素 +100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+50ug/ ml卡那霉素+10 ug/ ml利福平 霉素+100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+ 50 ug/ml慶大霉素+50 ug/ml卡 那霉素+100mMol/L乙酰丁香酮。
本發(fā)明原理是農(nóng)桿菌是普通存在于土壤中的一種革蘭式陰性菌，在 自然條件下可以感染植物的受傷部位，產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根，這是一種天 然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。農(nóng)桿菌有兩種含有Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌與含有 Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌。Ti質(zhì)粒是存在于根癌農(nóng)桿菌細胞核處的一種雙鏈環(huán)
狀DNA分子，在低于3(TC情況下，可穩(wěn)定地存在于根癌農(nóng)桿菌中。農(nóng)桿 菌Ti質(zhì)粒是一個常用的工程質(zhì)粒載體，介導(dǎo)轉(zhuǎn)化率很高。改造后的無害Ti 質(zhì)粒，可以攜帶任何DNA序列進入被根癌農(nóng)桿菌感染的植株，不會形成腫 瘤。T-DNA區(qū)和致瘤區(qū)是Ti質(zhì)粒最重要的兩個區(qū)域，T-DNA是Ti質(zhì)粒中 唯一能與植物染色體整合的序列，而致瘤區(qū)中的一系列基因則起輔助整合 的作用。Ti質(zhì)粒自身帶有合成冠癭堿的相關(guān)基因，能合成正常植物內(nèi)沒有 的冠癭堿。根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入植物細胞的一部分Ti質(zhì)粒與植物基因組整合， 致使植物形式腫瘤。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入植物的DNA片段稱為轉(zhuǎn)移DNA。只需將 目的基因插入改造的轉(zhuǎn)移DNA區(qū)，通過農(nóng)桿菌感染，即可以實現(xiàn)外源基因 向植物細胞的轉(zhuǎn)移與整合，經(jīng)過細胞的組織培養(yǎng)，即可觀測到外源基因在 受體植物細胞中的表達。農(nóng)桿菌介導(dǎo)才先在雙子葉植物中應(yīng)用，在單子葉 植物中運用較晚。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果
本發(fā)明所提供的方法不依賴于基因槍等貴重儀器，不需要金粉等昂貴 的實驗載體材料，僅需一個超淨(jìng)工作臺以及相關(guān)農(nóng)桿菌菌株就能在最簡單 地實驗環(huán)境下實現(xiàn)洋蔥表皮細胞的高效轉(zhuǎn)化，全過程4天，{氐成本，洋蔥表 皮細胞的轉(zhuǎn)化效率達80%。


圖1為本發(fā)明的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化方法用于檢測pasr啟 動子活性圖。
圖2為本發(fā)明的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化方法用于檢測 MpASR-GFP蛋白的亞細胞定位圖。
圖3為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化與GUS報告基因聯(lián)合使用研究 啟動子活性。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式 不限于此。
實施例一農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化方法用于啟動子活性鑒定 (1)選取新鮮而且生長狀況良好的洋蔥鱗莖，在超淨(jìng)工作臺的無菌環(huán)
境中，除去洋蔥鱗莖外層的3 5層鱗片葉，將鱗莖于75%乙醇中浸泡處理 IO分鐘，用無菌水洗漆3次。用無菌解剖刀十字形切開洋蔥鱗莖，取中層 靠近鱗莖內(nèi)部的鱗莖葉，在內(nèi)表皮(凹面)用刀片輕輕劃出面積約為lcm2的 小方塊，然后用鑷子輕輕將洋蔥單層內(nèi)表皮塊撕下。
(2) 以啟動子pasr為研究對象，檢測啟動子序列的啟動子活性。將啟 動子序列和GFP報告基因的ORF序列連入pCAMBIA1391Z載體，構(gòu)建包 含啟動子序列和GFP報告基因的啟動子植物表達載體 pCAMBIA1391Z-pasr-g^。將該載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101菌株，將經(jīng)鑒定為 陽性的克隆按照1 : 100的體積比接種至200ml YEB液體培養(yǎng)液中(含有 50ug/ml慶大霉素，50ug/ml卡那霉素，100mMol/L乙酰丁香酮)中，28°C 振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物于2800轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘收集菌體，分成三 分重懸于4。C預(yù)冷的滲透培養(yǎng)基中(含MS， 10mM MgCl2， 100mMol/L乙 酰丁香酮，0.01% (W/V) 2-N嗎啡啉乙磺酸)，使OD柳值分別為0.2、 1.0、 1.5。
(3) 將撕下的洋蔥單層內(nèi)表皮塊分別浸浮在OD6。o二0.2、 1.0、 1.5的 上述滲透培養(yǎng)基重懸的菌液(含MS， 10mMMgCl2， 100mMol/L乙酰丁香 酮，0.01% (W/V) 2-N嗎啡啉乙磺酸)中，使農(nóng)桿菌與洋蔥單層內(nèi)表皮塊 充分接觸進行轉(zhuǎn)化后，間或輕輕搖動，接觸(轉(zhuǎn)化)時間^^別對應(yīng)為30分 鐘、20分鐘和5分鐘，然后用鑷子輕輕夾起洋蔥內(nèi)表皮塊一角，稍濾干菌 液，以貼近鱗片葉肉的一面朝下，平鋪于MS固體培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)化后并平 鋪于MS固體培養(yǎng)基的洋蔥單層內(nèi)表皮塊于25°C， 16小時光照/8小時黑暗 的培養(yǎng)條件中進行共培養(yǎng)。
(4) 共培養(yǎng)20小時后用鑷子輕輕取出洋蔥單層內(nèi)表皮塊，用無菌液 體MS培養(yǎng)基洗滌以去除可能附著的培養(yǎng)基碎塊及菌液，壓片法制片，采 用共聚焦熒光顯微鏡，在激發(fā)波長為488 nm左右，發(fā)射波長為500 570 nm 左右觀察洋蔥表皮細胞中GFP的表達水平，以檢測啟動子pasr的活性，結(jié) 果顯示，啟動子pasr具有啟動子活性，能驅(qū)動報告基因GFP在洋蔥表皮細 胞中表達，且轉(zhuǎn)化效率在80%以上。檢測結(jié)果如圖l所示。其中，A,、 A2、 A3分別為OD6()()=0.2轉(zhuǎn)化時間為30分鐘；OD6(K)=1.0轉(zhuǎn)化時間為20分鐘； OD6Q。=1.5轉(zhuǎn)化時間為5分鐘條件下的轉(zhuǎn)化結(jié)果。
實施例二農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化方法用于石開究蛋白質(zhì)的亞 細胞定位
(1) 選取新鮮而且生長狀況良好的洋蔥鱗莖，在超淨(jìng)工作臺的無菌環(huán)
境中，除去洋蔥鱗莖外層的3 5層鱗片葉，將鱗莖于75%乙醇中浸泡處理 IO分鐘，用無菌水洗滌3次。用無菌解剖刀十字形切開洋蔥鱗莖，取中層 靠近鱗莖內(nèi)部的鱗莖葉，在內(nèi)表皮(凹面)用刀片輕輕劃出面積約為lcm2的 小方塊，然后用鑷子輕輕將洋蔥單層內(nèi)表皮塊撕下。
(2) 將經(jīng)鑒定為陽性攜帶pCAMBIA1301-MpASR-GFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌 LBA4404按照1 : 100的體積比接種至50ml液體YEB液體培養(yǎng)液中(含 125ug/ml鏈霉素，50ug/ml卡那霉素，100mMol/L乙酰丁香酮)中，28°C 振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物于2800轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘收集菌體，并重懸 于滲透培養(yǎng)基(MS+10mM MgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01% (W/V) 2-N嗎啡啉乙磺酸)中，使OD60(p1,0。
(3 )將撕下的洋蔥單層內(nèi)表皮塊浸浮在上述含有菌體的滲透培養(yǎng)基的 菌液(MS+10mM MgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01% (W/V) 2-N嗎啡 啉乙磺酸)中，間或輕輕搖動。使農(nóng)桿菌與洋蔥單層內(nèi)表皮塊充分接觸20 分鐘進行轉(zhuǎn)化后，用鑷子輕輕夾起洋蔥單層內(nèi)表皮塊一角，稍濾干菌液， 以貼近鱗片葉肉的一面朝下，平鋪于MS固體培養(yǎng)基并于25"C， 16小時光 照/8小時黑暗的培養(yǎng)條件中進行共培養(yǎng)。
(4)共培養(yǎng)16小時后用鑷子輕輕取出洋蔥單層內(nèi)表皮塊，用無菌液 體MS培養(yǎng)基洗滌以去除可能附著的培養(yǎng)基碎塊及菌液，壓片法制片，采 用共聚焦熒光顯微鏡，在激發(fā)波長為488 nm左右，發(fā)射波長為500 570 nm 左右進行觀察，發(fā)現(xiàn)MpASR-GFP定位于細胞核內(nèi)且轉(zhuǎn)化效率達80%以上， 檢測結(jié)果如圖2所示。其中，Bl、 B2、 B3分別為用于檢測MpASR-GFP蛋 白的亞細胞定位的熒光、白光下電鏡圖及其疊加圖。
實施例三農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化與GUS報告基因的聯(lián)合使
用
(1)選取新鮮而且生長狀況良好的洋蔥鱗莖，在超淨(jìng)工作臺的無菌環(huán) 境中，除去洋蔥鱗莖外層的3 5層鱗片葉，將鱗莖于75%乙醇中浸泡處理 IO分鐘，用無菌水洗滌2次。用無菌解剖刀十字形切開洋蔥鱗莖，取中層
靠近鱗莖內(nèi)部的鱗莖葉，在內(nèi)表皮(凹面)用刀片輕輕劃出面積約為lcm2的 小方塊，然后用鑷子輕輕將洋蔥單層內(nèi)表皮塊撕下。
(2) 將gw報告基因與啟動子pfl^相連接構(gòu)建植物表達載體 pCAMBIA1391Z-pasr-gus,并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105菌株。在YEB液體培養(yǎng) 基(含有50mg/L卡那霉素，125mg/L鏈霉素和100mMol/L乙酰丁香酮) 中，28i:振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物于2800轉(zhuǎn)/分鐘，離心IO分鐘收集菌體， 并重懸于滲透培養(yǎng)基中(MS+10mMMgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01%
(W/V) 2-N嗎啡啉乙磺酸)，使00600=1.0。
(3) 將撕下的洋蔥單層內(nèi)表皮塊浸浮在上述含有菌體的滲透培養(yǎng)基的 菌液中，使農(nóng)桿菌與洋蔥單層內(nèi)表皮塊充分接觸20分鐘進行轉(zhuǎn)化后，用鑷 子輕輕夾起洋蔥單層內(nèi)表皮塊一角，稍濾干菌液，平鋪于MS固體培養(yǎng)基， 25°C， 16小時光照/8小時黑暗的培養(yǎng)條件中進行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)24小時后， 采用熒光顯微鏡進行觀察，轉(zhuǎn)化效率達80%以上，檢測結(jié)果如圖3所示。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上 述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改 變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明 的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化方法，其特征在于包括如下步驟(1)在無菌環(huán)境中，除去洋蔥鱗莖外層的3～5層鱗片葉，將洋蔥鱗莖消毒后用無菌水洗滌干凈，切開洋蔥鱗莖，取中層靠近鱗莖內(nèi)部的鱗莖葉，撕下洋蔥單層內(nèi)表皮塊；(2)含有農(nóng)桿菌的滲透培養(yǎng)基的配制將含待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株接種至YEB液體培養(yǎng)液中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)物離心收集農(nóng)桿菌菌體，并重懸于預(yù)冷至4℃的滲透培養(yǎng)基中，使該含有農(nóng)桿菌的滲透培養(yǎng)基濃度在OD600＝0.2～1.5；所述滲透培養(yǎng)基為MS+10mM MgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01％2-N嗎啡啉乙磺酸；(3)轉(zhuǎn)化將洋蔥單層內(nèi)表皮塊浸浮在上述含有農(nóng)桿菌的滲透培養(yǎng)基中，使農(nóng)桿菌與洋蔥單層內(nèi)表皮塊充分接觸5～30分鐘進行轉(zhuǎn)化后，夾起洋蔥單層內(nèi)表皮塊，濾干菌液后平鋪于MS固體培養(yǎng)基，于25℃，16小時光照/8小時黑暗的培養(yǎng)條件中，共培養(yǎng)16～24小時。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化方法，其特 征在于所述洋蔥鱗莖消毒是采用75%乙醇消毒。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化方法，其特 征在于所述農(nóng)桿菌菌株為LBA4404菌株、EHA105菌株或GV3101菌株。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟(2)使該含有農(nóng)桿菌的滲透培養(yǎng)基濃度為OD6oo-1.0。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化方法，其特 征在于步驟(3)使農(nóng)桿菌與洋蔥單層內(nèi)表皮塊充分接觸20分鐘進行轉(zhuǎn)化。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化方法，其特 征在于所述YEB液體培養(yǎng)液包括YEB+125ug/ ml鏈霉素+50ug/ ml卡那霉素 +100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+50ug/ ml卡那霉素+10 ug/ ml利福平霉素 +100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+ 50 ug/ml慶大霉素+50 ug/ml卡那霉素 +100mMol/L乙酰丁香酮。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞轉(zhuǎn)化方法，該方法將洋蔥單層內(nèi)表皮塊浸浮在含有農(nóng)桿菌的滲透培養(yǎng)基中，使農(nóng)桿菌與洋蔥內(nèi)表皮塊充分接觸5～30分鐘進行轉(zhuǎn)化后，夾起洋蔥表皮塊，濾干菌液后平鋪于MS固體培養(yǎng)基，于25℃，16小時光照/8小時黑暗的培養(yǎng)條件中，共培養(yǎng)16～24小時。本發(fā)明不依賴于基因槍等貴重儀器，不需要金粉等昂貴的實驗載體材料，僅需一個超淨(jìng)工作臺以及相關(guān)農(nóng)桿菌菌株就能在最簡單地實驗環(huán)境下實現(xiàn)洋蔥表皮細胞的高效轉(zhuǎn)化，全過程4天，低成本，洋蔥表皮細胞的轉(zhuǎn)化效率達80％。
文檔編號C12N15/82GK101113458SQ20071002887
公開日2008年1月30日 申請日期2007年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日
發(fā)明者劉海燕, 梁炫強 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所