專利名稱：檢測21號染色體和性染色體數(shù)目異常的試劑盒的制作方法
檢測21號染色體和性染色體數(shù)目異常的試劑盒所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及檢測臨床樣品中21號染色體和性染色體數(shù)目異常的試劑盒，特別是涉及以定 量熒光多重聚合酶鏈反應技術(shù)早期篩查21 —三體和性染色體數(shù)目異常的的試劑盒。發(fā)明背景21-三體綜合征又稱為唐氏綜合征(DS)。新生兒唐氏綜合征的發(fā)生率約為1/800。據(jù)估計， 我國目甜大約有60萬以上的DS患兒出生，即平均每20分鐘就有一個DS患兒出生。DS發(fā) 生率隨母親生育年齡的增高而增高，尤其當母親年齡大于35歲時，發(fā)生率明顯增高。臨床匕 生育期的高齡婦女(年齡在35歲以上的婦女)，卵巢受到各種有害物質(zhì)和射線的影響，導致 遺傳物質(zhì)發(fā)生突變的機會增多。遺傳物質(zhì)的載體——染色體在細胞分裂過程中發(fā)生不分離現(xiàn) 象，致使其所生,的子女癡呆和畸形的發(fā)生率明顯增高。這樣的胎兒體內(nèi)21號染色體不分離， 結(jié)果造成3條21染色體和單條21號染色體胚胎。幾乎所有的單體胚胎和大部分三體胚胎在 妊娠發(fā)生早期發(fā)生流產(chǎn)，其中僅有小部分21三體胎兒可以順利度過妊娠生產(chǎn)，并產(chǎn)出先天性 愚型兒。性染色體多倍體遺傳病包括Klinefelter綜合征，XYY綜合征，多X綜合征等。Klinefelter 等人首先報道并命名了 Klinefelter綜合征。Jacob等人證實，Klinefelter綜合征病人的核型為 47， XXY，發(fā)病原因是多了一條X染色體，因此也將該本病稱為XXY綜合征。該病發(fā)生率 相當高，其中在男性新生兒中約占l膽0 2/誦，在身高180CM以上的男性中占1/260， 在精神病或刑事收容所中占1/100，在不育的男性中占1/10，在精神病男性患者中可高達2% -3%。為了提高人口質(zhì)量，優(yōu)生優(yōu)育，必須對高齡孕婦(特別是大于35歲的孕婦)的胎兒進 行產(chǎn)甜篩查，以防止染色體異?；純旱某錾?。染色體核型分析技術(shù)是檢測染色體異常的"金標準"，但核型分析在很大程度上要依賴于 細胞樣品的質(zhì)量。如果樣本細胞量小或被污染，則很難或不能得出結(jié)果。目前，國內(nèi)外廣泛采 用孕婦血清標記物來大面積篩査DS胎兒。由于DS胎兒的孕婦血清甲胎蛋白(AFP)和雌三醇 (uE3)低于平均水平，而絨毛膜促性腺激素(HCG)高于平均水平，因此，利用"三聯(lián)篩查" 方法對妊娠期(孕15 21周)孕婦進行這三項指標的檢測。該方法檢出率為48%~83%，假陽性率約為5%。而針對性染色體異常目前還沒有有效的產(chǎn)甜篩查方法。定量熒光多重PCR技術(shù)(quantitative fluorescence multiplex polymerase chain reaction, QF-multiplex PCR)是應用一對以上的熒光標記引物同時擴增模板的不同區(qū)域，然后對擴增產(chǎn) 物進行電泳，分析并計算出每一個等位基因所代表的擴增量。Mansfield等人應用STR位點 (short tandem repeat,短串聯(lián)重復序列)進行QF-PCR，成功地檢測了 21、 18和X三體綜合 征。隨后，科學家們應用擴增STR的QF-PCR技術(shù)對各種不同來源的樣本如羊水、絨毛活檢 和胎兒血等進行了 21-三體綜合征的分析。1995年后，人們丌始聯(lián)合多個染色體上的特異性STR位點同時對21-三體、18-三體、13-三體X Y染色體異常進行分析。與現(xiàn)有的核型分析技術(shù)相比，該方法縮短了分析時IW、高通 量、所需要的細胞數(shù)少、可以同時分析父親DNA及母親DNA，而且還可用于胚胎種植甜診 斷。本發(fā)明人應用定量熒光多重PCR技術(shù)，選擇21號染色體和性染色體特異性STR位點進行 多重擴增，結(jié)合毛細管電泳進行精確定量，建立一種可以快速準確篩査的21—三體和性染色 體數(shù)目異常的試劑盒。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種試劑盒，以多重定量熒光PCR (QF-PCR)擴增染色體特異性的STR 位點，并根據(jù)擴增產(chǎn)物劑量的差異分析染色體數(shù)目異常，該試劑盒包括(1) 一個七重復合 擴增體系，以擴增染色體特異性的STR位點；(2)針對一組特異性染色體的的STR位點進行 檢測和分析；(3)以電泳法確定擴增片段的大小和基因劑量，特征在于其中所使用的熒光染 料標記的上游和下游寡核苷酸引物分別是針對D21S1435位點的是5'陽AGAGCCCCATTCCCCTCTC-3， (SEQIDNO:l)禾口 5'-TCAgTgCCATCAAGAAAAATGA-3， (SEQ ID NO:2);針對D21S11位點的是，5，-GTCTGTTATGGGACTTTTCT-3， (SEQIDNO:3)禾口 5，-TTGTATTAGTCAATGTGAGA-3， ( SEQ ID NO:4 );針對D21S1411位點的是5'-CCAGCCTTCTAAATATTCAT-3， (SEQIDNO:5)禾n 5，-AGATAGAACGGATAGAAAAT-3， ( SEQ ID NO:6);針對AMXYF位點的是5'-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3， (SEQIDNO:7)禾口 5，-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3' (SEQ ID NO:8);針對DXS981位點的是5'-TCTTCTCTCCACTTTTCAGAGT-3， (SEQIDNO:9)禾口 5'-GCTAAAAACTTGGAATGATATA-3， (SEQ ID NO:10);針對DXS6809位點的是5，-GCTTTAGGCTGATGTGAGGA-3， (SEQIDNO:ll)和 5，-GGGCATGACTAGATTATGTAG-3， (SEQ ID NO:12);針對X22位點位點的是ACATAGTGATTCTGCCAGGA-3， (SEQIDNO:13)禾口 5'層GGGCTCTTTCAATCTGAACA-3， (SEQ IDNO:14)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的多重擴增體系是七重復合擴增體系，分別 針對D21S1435位點、D21S11位點、D21S1411位點、AMXYF位點、DXS981位點、DXS6809位點和X22位點位點。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的生物樣品是可疑染色體數(shù)目異常的臨床樣 品。本試劑盒旨在檢測所說可疑臨床樣本的染色體數(shù)目異常是指21號染色體和性染色體數(shù)目 異常，包括但不只限于21號染色體和性染色體數(shù)目異常等疾病。細胞樣本可以來源于人體各 種組織和體液。用來檢測染色體數(shù)目異常的染色體DNA來自人體血細胞或體細胞的DNA。例 如，DNA樣本可以來自外周血，臍血，羊水，絨毛細胞，以及孕婦體內(nèi)游離的胎兒DNA。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的染色體數(shù)目異常是指人體21號染色體和性 染色體數(shù)目異常。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的21號染色體和性染色體數(shù)目異常是指21號 染色體三體和性染色體單體或者性染色體多倍體，選用21號染色體和性染色體上特異性的遺 傳標記位點，其中在21號染色體上的位點為D21S1435、 D21S11、 D21S1411，在性染色體上 的位點為AMXYF、 DXS981、 DXS6809和X22位。簡單地說，本發(fā)明的試劑盒包括一個混合多種成分的PCR反應體系；選擇來源于真核細 胞的DNA作為模板；在相互配對的引物中，至少有l(wèi)對以上的擴增引物。其中一條互補到真 核細胞DNA目的序列的5，-端，另一條互補于真核細胞DNA目的序列的3'-端；而且PCR緩沖液 和擴增反應需要的蛋白酶必須能夠進行擴增反應。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的七重復合擴增體系可以對至少一個DNA片 段進行擴增，優(yōu)選擴增七個DNA片段，擴增反應的循環(huán)數(shù)是15-35循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，七重復合擴增體系可以同時擴增至少兩個染色體特異 性STR位點，其中優(yōu)選6個STR位點，包括D21S11， D21S1435， D21S1411， DXS981 ， DXS6809， X22和一個AMXY基因片段進行七重復合擴增，STR位點核心重復序列長度為4-5核苷酸序列 片段。七重復合擴增體系的擴增產(chǎn)物由兩個或者兩個以上的DNA擴增片段構(gòu)成，擴增產(chǎn)物的 量同各自位點的起始濃度成iH比例。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，可以用電泳的方法對擴增片段進行分離和分析，其中 優(yōu)選用毛細管電泳法分離七重復合擴增的產(chǎn)物片段。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，可以用熒光染料標記擴增引物。標記引物進行復合擴 增后，可以用擴增產(chǎn)物的累計熒光值定量分析染色體特異性STR位點擴增產(chǎn)物的基因劑量。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，可以根據(jù)STR位點擴增產(chǎn)物等位基因的數(shù)目和等位基 因擴增產(chǎn)物的相對濃度來分析所選染色體的數(shù)目是否存在異常。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，針對染色體遺傳標記STR位點進行多重復合擴增。選 用的STR位點是存在于胚胎或者胎兒細胞的遺傳物質(zhì)，在人群中存在多態(tài)性，核心重復單位 為4-5個核苷酸，所擴增的產(chǎn)物片段在50-1000bp之間，優(yōu)選在100-500bp之間。應用復合擴增 體系對STR位點進行多重擴增，檢測STR位點等位基因數(shù)目的差別和基因劑量的差別，為染 色體數(shù)目異常性疾病的分析提供依據(jù)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，可以至少用一個STR位點D21S1435或D21S11或 D21S1411位點來分析21號染色體三體綜合征，優(yōu)選D21S1435、 D21S11和D21S1411位點兩個 或者兩個以上進行聯(lián)合檢測。擴增產(chǎn)物通過凝膠電泳的方法進行分離并定量，特別是毛細管 電泳的方法進行分離并相對定量。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，可以至少用一個STR位點XS981或DXS6809或X22，和 (或)XY染色體共有的牙釉蛋白基因AMXY來分析性染色體數(shù)目異常，優(yōu)選XS981、 DXS6809、 X22和AMXY四個位點進行兩個或者兩個以上進行聯(lián)合檢測。擴增產(chǎn)物通過凝膠 電泳的方法進行分離并定量，特別是毛細管電泳的方法進行分離并相對定量。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的核酸擴增體系包括制備一個混合多種成 分在單個eppendor滑內(nèi)的PCR反應體系；選擇來源于真核細胞的DNA作為模板；至少有l(wèi)對以 上的擴增引物，在相互配對的引物中，其中一條互補到真核細胞DNA目的序列的5'-端， 一條 互補到真核細胞DNA目的序列的3'-端；PCR緩沖液和擴增反應需要的蛋白酶必須能夠進行擴 增反應。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的多重擴增系統(tǒng)是七重復合聚合酶鏈反應系 統(tǒng)，可以至少擴增一個DNA片段，優(yōu)選同時擴增七個DNA片段，擴增反應的循環(huán)數(shù)通常為 15-35個循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，七重復合擴增體系可以同時擴增兩個或者兩個以上的 染色體特異性DNA片段，包括STR位點但不限于STR位點，也可以對其他DNA片段進行復合 擴增。擴增產(chǎn)物由兩個或者兩個以上的DNA片段構(gòu)成，產(chǎn)物的量同各自位點的起始濃度成TE 比例。本發(fā)明中檢測樣品中染色體數(shù)目存在異常的試劑盒包括(1)提供包括(a)待檢樣品、 (b)可熱啟動的耐熱DNA聚合酶和(c) 2-脫氧核苷三磷酸(dNTPs)的擴增反應體系，以6及包括能夠與待檢位點雙鏈靶多核苷酸的第一條互補鏈結(jié)合的熒光標記的正向引物，和能夠 與待檢STR位點雙鏈靶多核苷酸的第二條互補鏈結(jié)合的反向引物；(2)通過一次聚合酶鏈反 應擴增所說的多個靶多核苷酸目的片段；(3)多重復合擴增后應用電泳的方法，檢測各位點 不同的等位基因片段大小和數(shù)目，分析累計產(chǎn)物發(fā)出的熒光量來檢測靶多核苷酸的存在和相對量。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，可以使用合成的特異性引物擴增染色體特異性STR位 點，這些引物同STR位點兩側(cè)毗鄰的特異性區(qū)域進行雜交，擴增的特定區(qū)域可以保證是特定 染色體上的STR位點被擴增?？梢允褂肈NA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，并可用分子 篩和快速蛋白質(zhì)液相層析法(FPLC)純化，然后進行氨解處理。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，可以應用熒光染料、生物素、放射性同位素、稀土金 屬元素等標記引物進行多重復合擴增，用于擴增后產(chǎn)物的分離，優(yōu)選應用熒光染料標記。可以使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，并可用分子篩和快速蛋白質(zhì)液相層析法 (FPLC)純化，然后進行氨解處理。氨解處理后分別在引物5'端標記熒光發(fā)生基團，包括6-FAM 或者HEX但不限于這些熒光染料發(fā)光基團。以FPLC層析法純化熒光標記的引物，然后可以使 用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，根據(jù)復合擴增產(chǎn)物片段大小來分析樣本中STR數(shù)目和 劑量變化。任何可以分離核酸片段大小的方法例如過濾，高效液相色譜，電泳，親和收集等 方法均可用于本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，通過凝膠電泳的方法進行分離并定 量，優(yōu)選使用毛細管電泳法分離染色體特異性STR位點。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，可以根據(jù)引物擴增產(chǎn)物的累計熒光值定量檢測染色體 特異性STR位點擴增產(chǎn)物的相對量，并通過計算每個STR位點擴增產(chǎn)物的數(shù)目和每個STR位點擴增相對劑量來分析所選染色體的是否存在染色體數(shù)目異常。本發(fā)明提供一種使用多重定量熒光PCR技術(shù)(QF-PCR)檢測21-三體和性染色體數(shù)目異 常的試劑盒，該試劑盒包括PCR反應液1管(約800 pl/管)、引物混合物l管(約200 ^1/管)、 T叫酶l管(約25 pl/管)、21三體陽性標準品1管(約25ul/管)、性染色體異常陽性標準品l管(約 25pl/管)、陰性對照l管(約25pl/管)。特征在于其中使用的引物混合物包括針對D21S1435位 點的引物5,-AGAGCCCCATTCCCCTCTC-3， (SEQ ID NO:l )和5'-TCAgTgCCATCAAGAAAAATGA-3， (SEQIDNO:2);針對D21S11位點的引物5，-GTCTGTTATGGGACTTTTCT-3， (SEQIDNO:3) 和5，-TTGTATTAGTCAATGTGAGA-3， ( SEQ ID NO:4 );針對D21S1411位點的引物: 5'—CCAGCCTTCTAAATATTCAT-3， (SEQ ID NO:5)禾口5，—AGATAGAACGGATAGAAAAT—3， (SEQ ID NO:6);針對AMXYF位點的引物5，-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3， ( SEQ ID NO:7)和5，-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3，( SEQ ID NO:8 ); 針對DXS981位點的引物 5，-TCTTCTCTCCACTTTTCAGAGT-3， (SEQ IDNO:9)和5，-GCTAAAAACTTGGAATGATATA-3' (SEQ ID NO:IO);針對DXS6809位點的引物5，-GCTTTAGGCTGATGTGAGGA-3， (SEQ IDNO:ll)和 5，-GGGCATGACTAGATTATGTAG-3，( SEQ ID NO: 12 ); 針對X22位點的引物 5，-ACATAGTGATTCTGCCAGGA-3' (SEQ ID NO:13)和5，-GGGCTCTTTCAATCTGAACA-3， (SEQ ID NO:14)。引物工作濃度范圍為O. 05yM-lO.OyM，優(yōu)選范圍為O. 1 y M -1. 8 u M。 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的引物的5'端使用熒光發(fā)光基團標記的。 值得特別說明的是，本試劑盒采用一個七重的復合擴增體系，可以同時包括性染色體STR 位點和21號染色體在內(nèi)的等七個DNA片段。通過體系優(yōu)化，可以對iH常樣本中所選的七個位點 進行均衡擴增，也可以對異常樣本中可能存在的21-三體和(或)性染色體異常同時進行分析 和篩査。為了確保本發(fā)明試劑盒的準確性，我們還應用細胞株提取的DNA作為陽性參考品。借 助這些額外標準品，使用本發(fā)明的試劑盒在相同條件下進行平行檢測，以進一歩驗證本發(fā)明 試劑盒的檢測精確度和準確性，并作為生產(chǎn)本發(fā)明試劑盒的附加的質(zhì)量控制標準。


圖1圖2顯示兩個正常樣本多重擴增產(chǎn)物的電泳圖。圖1顯示一個IH常男性樣本擴增電泳圖。圖2顯示一個正常女性樣本擴增電泳圖。 圖3圖4顯示兩個21-三體異常樣本多重擴增產(chǎn)物的電泳圖。其中圖3顯示一個女性21-三體樣本擴增電泳圖。圖4顯示一個男性21-三體樣本擴增電泳圖。 圖5顯示一個XXY異常樣本的多重擴增產(chǎn)物的電泳圖。 圖6顯示一個Timi綜合征樣本多重擴增產(chǎn)物的電泳圖。
具體實施方式
實施例l:檢測試劑盒及其使用(1) 制備包括下列組成成分的試劑盒PCR反應液1管(800 pl/管)、引物混合物l管(200 )il /管)、Taq酶l管(25 pl /管)、21三體陽性標準品1管(25ul/管)、性染色體異常陽性標準品l 管(25pl/管)、陰性對照l管(25pl/管)。(2) 標本采集、運送和保存1. 標本采集標本為血液，羊水，絨毛組織。血液為常規(guī)取靜脈血2ml或者胎兒臍帶血 0.5-lml， EDTA抗凝處理；經(jīng)穿刺獲羊水2-5ml或者絨毛組織兩條。2. 保存可立即檢測，4匸保存一周，-20匸保存期可達一年。3.運輸標本運送應采用0。C冰壺。 (3)檢測歩驟和結(jié)果分析DNA提取建議使用Qiagen DNA提取試劑盒。羊水DNA提取4°C lOOOg離心1.5ml羊水10分鐘，去掉上清。加入200 u 1冰預冷的1 X PBS溶液重懸沉淀。接下來按照Qiagen Blood Protocol說明書進行，直到最后一歩。加入100 u 1AE溶液或者蒸餾水到QIAamp spin column,室溫溫育至少5分鐘。室溫6000g離心1分 鐘收集DNA溶液。臍血、靜脈血或者絨毛組織按照Qiagen Blood Protocol說明書進行，最后收集到200 u 1 DNA 溶液。QF-PCR操作歩驟k對于每一個PCR反應體系，混合以下成分到總體積為25ul。設(shè)置陰陽性對照。組 分 反應體積pcr反;、V:體系 16 u i引物混合物 4wlTaq酶系 0.5 ti IDNA樣品 xul (10—20ng)水 3.5—x反應休系總量 ^ 7i2、 PCR反應條件93'C預變性4分鐘，然后93'C 1分鐘，58°C1分鐘，72°C1分鐘，共26 個循環(huán)；最后6(TC45分鐘。擴增產(chǎn)物電泳對于每一個分析，lulPCR產(chǎn)物和13.5ulHi-Di formamide、 0.5ul GeneScan ROX-500 Size standard混合。95。C加熱變性混合物5分鐘。放置冰上至少1分鐘。瞬時離心混合物。上樣 ABI310/ABI3100遺傳分析儀，然后應用軟件進行結(jié)果分析。結(jié)果圖譜如圖l，圖2，圖3， 圖4，圖5，圖6所示。其中圖l，圖2為iH常男性和正常女性的結(jié)果分析圖譜。實施例2:通過QF-PCR擴增21號染色體上的STR位點檢領(lǐng)lj21-三體綜合征來自供體的血樣、羊水或絨毛組織按照Qiagen DNA提取試劑盒的標準程序進行DNA提取 純化。每個樣本DNA溶液的濃度用TE buffer (5mMTris-HClpH8.0， lmM EDTApH8.0)調(diào)整 到20-40ng/u 1。應用試劑盒中提供的引物混合物，PCR緩沖液體系和Taq酶按照試劑盒檢測規(guī) 程進行擴增反應并上樣分析。擴增反應同時擴增D21S11， D21S1435， D21S1411， AMXY，DXS981， DXS6809, X22等七個位點，上樣結(jié)果的分析圖譜如圖3，圖4。如圖所示，21號染 色體上的三個位點D21S11， D21S1435和D21S1411擴增分析位點的基因型，在為21-三體綜合 征時可形成l:l:l的峰(面積)或者2:1的熒光峰(面積)，純合子時為單熒光峰(面積)不能 提供遺傳信息。因此可以快速檢測21-三體綜合征。反應同時檢測性染色體上的遺傳位點(基 因)，但是所有位點均為l:l的熒光峰或者為單峰，不能提供診斷性染色體異常的遺傳信息。實施例3:通過QF-PCR擴增性染色體上的遺傳位點檢測Klinefelter綜合征來自供體的血樣、羊水或絨毛組織按照Qiagen DNA提取試劑盒的標準程序進行DNA提取 純化。每個樣本DNA溶液的濃度用TE buffer (5mMTris-HClpH8.0， lmM EDTApH8.0)調(diào)整 至U20-40ng/y 1。應用試劑盒中提供的引物混合物，PCR緩沖液體系和T叫酶按照試劑盒檢測規(guī) 程進行擴增反應并上樣分析。擴增反應同時擴增D21S11， D21S1435， D21S1411， AMXY， DXS981， DXS6809， X22等七個位點，上樣結(jié)果的分析圖譜如圖5。如圖所示，21號染色體 上的三個位點D21S11， D21S1435和D21S1411擴增分析位點的基因型，形成雜合子l:l的熒光 峰(面積)或者純合子時為單熒光峰(面積)，不能提供遺傳信息。性染色體上的遺傳位點 AMXY， X22形成2:l的熒光峰(面積)，表示X染色體上基因劑量是Y染色體上的兩倍，而X 染色體上的位點DXS981和DXS6809形成1:1的熒光峰(面積)，表明有兩條X染色體的存在， 聯(lián)合分析可以快速檢測Klinefelter綜合征。實施例4:通過QF-PCR擴增性染色體上的遺傳位點檢測Tumer綜合征來自供體的血樣、羊水或絨毛組織按照Qiagen DNA提取試劑盒的標準程序進行DNA提取 純化。每個樣本DNA溶液的濃度用TE buffer (5mMTris-HClpH8.0， lmM EDTApH8.0)調(diào)整 到20-40ng/u 1。應用試劑盒中提供的引物混合物，PCR緩沖液體系和Taq酶按照試劑盒檢測規(guī) 程進行擴增反應并上樣分析。擴增反應同時擴增D21S11， D21S1435, D21S1411， AMXY， DXS981， DXS6809， X22等七個位點，上樣結(jié)果的分析圖譜如圖6。如圖所示，21號染色體 上的三個位點D21S11， D21S1435和D21S1411擴增分析位點的基因型，形成雜合子l:l的熒光 峰(面積)或者純合子時為單熒光峰(面積)，不能提供遺傳信息。性染色體上的遺傳位點 AMXY， X22， DXS981和DXS6809都形成單熒光峰(面積)。結(jié)合患者臨床癥狀聯(lián)合分析可 以快速檢測超雌綜合征。序列表<110>中山人學達安基閃股份有限公n]<120>檢測21號染色體和性染色體數(shù)S異常的方法及試劑盒<140> <141> <160>14 <20> 1 <211> 19 <212>DNA<2i3>人r.序列<220><223>根據(jù)特定核tr酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 15'-AGAGCCCCAT TCCCCTCTC-3'<210>2 <211>22 <212> DNA<2i3>人r.序列<220><223>根據(jù)特定核tr酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 25'-TCAGTGCCAT CAAGAAAAAT GA-3'<210>3 <211>20 <212>DNA <213>人l:序列 <220><223>根據(jù)特定核昔酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的探針。 <柳> 35'-GTCTGTTATG GGACTTTTCT-3'<210>4 <211>20 <212> DNA<213>人i:序列<220><223>根據(jù)特定核昔酸序列設(shè)計，以片H乍PCR擴增的探針。 <400> 45，-TTGTATTAGT CAATGTGAGA-3' <210>511<2U>20 <212>DNA<2i3>人i:序列<220><223>根據(jù)特定核tr酸序列設(shè)計，以W作PCR擴增的探針。 <400> 55'-CCAGCCTTCT AAATATTCAT-3'<210>6 <211>20 <2I2>DNA<2i3>人r.序列<220><223>根據(jù)特定核甘酸序列設(shè)計，以W作PCR擴增的探針。 <400> 65，-AGATAGAACG GATAGAAAAT-3'<210>7 <211>22 <212>DNA<2i3>人i:序列<220><223>根據(jù)特定核tt酸序列設(shè)計，以HJ作PCR擴增的探針。 <400> 75,-CCCTGGGCTC TGTAAAGAAT AG-3'<210> 8 <2">22 <2I2>DNA<2i3>人i:序列<220><223>根據(jù)特定核t 酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的探針。 <400> 85'-ATCAGAGCTT AAACTGGGAA GC-3'<210>9 <211>22 <212>DNA<2i3>人i:序列<220><223>根據(jù)特定核立酸序列設(shè)計，以W作PCR擴增的探針。 <400> 95'-TCTTCTCTCC ACTTTTCAGA GT-3'<210> 10 <211>2212<212> DNA<2i3>人r.序列<220><223>根據(jù)特定核昔酸序列設(shè)計，以W作PCR擴增的探針。 <400> 105'-GCTAAAAACT TGGAATGATA TA-3'<210> 11 <21>20 <212>DNA<2i3>人r.序列<220><223>根據(jù)特定核tJ酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的探針。 <400>115'-GCTTTAGGCT GATGTGAGGA-3'<210> 12 <211>21 <212> DNA <213>人l:序列 <220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的探針。 <400> 125'-GGGCATGACT AGATTATGTA G-3'<20> 13 <2U>20 <212>DNA<2i3>人i:序列<220><223>根據(jù)特定核tr酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的探針。 <400> 135,-ACATAGTGAT TCTGC.CAGGA-3，<210> 14<211>20<212>DNA<2i3>人i:序列<220><223>根據(jù)特定核昔酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的探針。 <400> 145，- GGGCTCTTTC AATCTGAACA -3'
權(quán)利要求
1、本發(fā)明是提供一種用于檢測人21-三體和性染色體數(shù)目異常的的試劑盒，其特征在于所使用的熒光染料標記的上游和下游寡核苷酸引物分別是針對D21S1435位點的是5’-AGAGCCCCATTCCCCTCTC-3’(SEQ ID NO1)和5’-TCAgTgCCATCAAGAAAAATGA-3’(SEQ ID NO2)；針對D21S11位點的是，5’-GTCTGTTATGGGACTTTTCT-3’(SEQ ID NO3)和5’-TTGTATTAGTCAATGTGAGA-3’(SEQ ID NO4)；針對D21S1411位點的是5’-CCAGCCTTCTAAATATTCAT-3’(SEQ ID NO5)和5’-AGATAGAACGGATAGAAAAT-3’(SEQ ID NO6)；針對AMXYF位點的是5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3’(SEQ ID NO7)和5’-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’(SEQ ID NO8)；針對DXS981位點的是5’-TCTTCTCTCCACTTTTCAGAGT-3’(SEQ ID NO9)和5’-GCTAAAAACTTGGAATGATATA-3’(SEQ ID NO10)；針對DXS6809位點的是5’-GCTTTAGGCTGATGTGAGGA-3’(SEQ ID NO11)和5’-GGGCATGACTAGATTATGTAG-3’(SEQ ID NO12)；針對X22位點位點的是ACATAGTGATTCTGCCAGGA-3’(SEQ ID NO13)和5’-GGGCTCTTTCAATCTGAACA-3’(SEQ ID NO14)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征在于擴增體系為七重復合擴增體系。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征在于擴增體系優(yōu)選了一個AMXY基因片段和六個STR位 點，包括D21S11， D21S1435, D21S1411, DXS981, DXS6809, X22， STR位點核心重復序 列長度為4-5核苷酸序列片段。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征在于所說的生物樣品是可疑染色體數(shù)目異常的臨床樣品。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征在于染色體數(shù)目異常是指21號染色體三體和性染色體 單體或者性染色體多倍體，選用21號染色體和性染色體上特異性的遺傳標記位點，包括STR 位點。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種早期篩查21-三體和性染色體數(shù)目異常的試劑盒。該試劑盒利用定量熒光多重聚合酶鏈反應技術(shù)，分別以21-三體和性染色體上特異的遺傳位點進行熒光引物七重復合擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物劑量的差異分析染色體數(shù)目異常，達到檢測臨床樣品中21號染色體和性染色體數(shù)目異常的目的。
文檔編號C12Q1/68GK101323877SQ200710028600
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日
發(fā)明者明 李, 李佩瓊, 帆 江, 均 章, 陳華云 申請人:中山大學達安基因股份有限公司