專利名稱：檢測(cè)人21號(hào)染色體str基因型的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及熒光定量PCR技術(shù)(QF-PCR)，具體涉及一種檢測(cè)人類21號(hào)染色體STR基因型的試劑盒，是多個(gè)STR基因座基因型的快速高通量檢測(cè)。
背景技術(shù)：
21三體綜合征(又稱唐氏綜合征)是活產(chǎn)兒中發(fā)病率最高的染色體異常疾病，約占1/600。該疾病患者的21號(hào)染色體數(shù)目由正常的兩條變?yōu)?條，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的智力發(fā)育遲緩，易并發(fā)心臟病、白血病、免疫功能低下等。該疾病目前無(wú)法治療，主要通過產(chǎn)前診斷進(jìn)行預(yù)防。我國(guó)大規(guī)模開展的產(chǎn)前診斷主要手段和金標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞遺傳學(xué)染色體核型分析，該方法準(zhǔn)確、可靠，但建立在手工操作基礎(chǔ)上，依賴人工分析和經(jīng)驗(yàn)積累，存在檢測(cè)周期長(zhǎng)(2-3周時(shí)間)、檢測(cè)通量低下等諸多問題。染色體核型分析作為主流技術(shù)，已難以滿足臨床日益增長(zhǎng)的產(chǎn)前診斷需求。QF-PCR是一種快速分子診斷技術(shù)，能基于自動(dòng)化平臺(tái)對(duì)遺傳標(biāo)記STR(短串聯(lián)重復(fù)序列)的多態(tài)性進(jìn)行定性、定量分析以診斷目標(biāo)染色體數(shù)目，有助于突破目前染色體核型分析的技術(shù)瓶頸，達(dá)到快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化、高通量檢測(cè)的目的。STR存在于染色體上的特定位置，遵循孟德爾遺傳規(guī)律，每個(gè)STR基因座與所在染色體具有連鎖關(guān)系，能夠代表相應(yīng)染色體的數(shù)量。具體來(lái)說，正常染色體有兩條，在特定STR基因座上可表現(xiàn)為I個(gè)等位基因(來(lái)源于父母的兩個(gè)等位基因一致，也稱純合子)或基因量相等的2個(gè)等位基因(來(lái)源于父母的兩個(gè)等位基因不同，也稱雜合子)。對(duì)21三體綜合征而言，多余的I條21號(hào)染色體來(lái)自于母親或父親，理論上在特定STR基因座應(yīng)有3個(gè)等位基因，但由于STR的多態(tài)性有限，實(shí)際檢測(cè)時(shí)在21號(hào)染色體STR基因座可能出現(xiàn)三種基因型情況:第一種為I個(gè)等位基因，即3條染色體的STR等位基因相 同；第二種為2個(gè)等位基因，即3條染色體中有兩條的等位基因一致，但兩個(gè)等位基因的基因量有差別，約為1:2或2:1的比例；第三種為3個(gè)等位基因，SP3條染色體的等位基因各不相同，其基因量比例近似為1:1:1。后兩種基因型能夠提示染色體數(shù)量為3條，都具有診斷價(jià)值，以第三種最有診斷價(jià)值。基于STR多態(tài)性和基因組正常變異的復(fù)雜性，STR檢測(cè)用于特定染色體的數(shù)目診斷時(shí)需要聯(lián)用多個(gè)STR基因座，而STR又具有人群的特異性，因此，選擇本人群中多態(tài)性好、雜合度高的多個(gè)STR基因座聯(lián)合，更易獲得有診斷價(jià)值的基因座、達(dá)到準(zhǔn)確診斷染色體數(shù)目的目的。目前用于染色體數(shù)目檢測(cè)的QF-PCR商品化試劑盒，如英國(guó)的Aneufast、Elucigene QSTR,瑞典的 Chromo Quent> Deryser,美國(guó) ABI 的 TrueScience AneuploidySTR Kits,所選擇的聞多態(tài)性基因座都是基于白人(或聞加索人)的群體樣本，可能未必適用于中國(guó)人群。研發(fā)針對(duì)中國(guó)人群的QF-PCR診斷試劑盒，首先就是要選擇本人群具有高多態(tài)性的STR基因座的方法，這需要在一定樣本量基礎(chǔ)上建立群體遺傳學(xué)資料以從中挑選；其次，就是建立復(fù)合檢測(cè)多個(gè)STR基因座的QF-PCR檢測(cè)方法，達(dá)到高通量、快速檢測(cè)的目的，這對(duì)引物設(shè)計(jì)、PCR條件控制等提出了較高的要求。
QF-PCR檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化也是臨床普及應(yīng)用的重要前提。目前市場(chǎng)的同類型產(chǎn)品和已有專利缺乏對(duì)STR等位基因的精確分型，檢測(cè)結(jié)果表述難以統(tǒng)一，不利于臨床常規(guī)應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制。要做到STR等位基因的精確分型，首先需要對(duì)特定群體中觀察到的所有等位基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆，再通過DNA測(cè)序證實(shí)各等位基因的序列組成，按照國(guó)際遺傳學(xué)通用法則進(jìn)行等位基因命名，然后將已知等位基因混合制備成標(biāo)準(zhǔn)品，與待測(cè)標(biāo)本同時(shí)電泳，配合軟件分析對(duì)待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行等位基因分型。盡管STR分型技術(shù)已在法醫(yī)DNA分型及其他領(lǐng)域的應(yīng)用已得到廣泛認(rèn)可，但在檢測(cè)染色體數(shù)目的QF-PCR技術(shù)中尚未得到應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)人21號(hào)染色體STR基因型的試劑盒，是一種快速?gòu)?fù)合擴(kuò)增檢測(cè)人類21號(hào)染色體STR基因座的QF-PCR試劑盒，用于檢測(cè)21號(hào)染色體的數(shù)目，主要用于診斷21三體綜合征。本發(fā)明試劑盒包括獨(dú)立包裝的擴(kuò)增試劑和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)試劑，所述的擴(kuò)增試劑包括弓I物混合物、熱啟動(dòng)C-Taq酶、擴(kuò)增反應(yīng)液、質(zhì)控品，采用體外聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增；所述的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)試劑包括分子量?jī)?nèi)標(biāo)、等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)品(Allelic Ladder),在單通道或多通道毛細(xì)管電泳儀上檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；所述引物混合物包括12對(duì)引物SEQ IDN0.1-24，所述擴(kuò)增反應(yīng)液包含PCR緩沖液、MgCl2和dNTP，質(zhì)控品優(yōu)選9947A女性DNA，也可以是已知基因型的其它DNA，用以控制實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量。本發(fā)明試劑盒沒有采用文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的引物序列，而是根據(jù)復(fù)合檢測(cè)的要求對(duì)12個(gè)基因座的擴(kuò)增引物重新進(jìn)行了設(shè)計(jì)，引物混合物中的引物均對(duì)應(yīng)于基因座的側(cè)翼序列，其中每對(duì)引物中有一條引物的5’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記。每對(duì)引物分別用三種不同的熒光染料FAM、HEX、TAMRA進(jìn)行標(biāo)記，用于同時(shí)擴(kuò)增21號(hào)染色體上的11個(gè)STR基因座和I個(gè)性染色體基因座。所述引物混合物中，D21S1432、D21S11、D21S1246和D21S1412等4個(gè)基因座的引物采用FAM (藍(lán)色)標(biāo)記;D21S1437、D21S1413、D21S2039和D21S1270等4個(gè)基因座的引物采用HEX (綠色)標(biāo)記；Amelogenin、D21S1435、D21S1446和D21S1409等4個(gè)基因座的引物采用TAMRA (黃色)標(biāo) 記。所述引物信息具體參見表I。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)人21號(hào)染色體STR基因型的試劑盒，由擴(kuò)增試劑和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)試劑組成， 所述的擴(kuò)增試劑包括引物混合物、熱啟動(dòng)C-Taq酶、擴(kuò)增反應(yīng)液、質(zhì)控品，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)試劑包括分子量?jī)?nèi)標(biāo)、等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)品；所述的引物混合物包括12對(duì)引物SEQ ID N0.1-24，所述擴(kuò)增反應(yīng)液包含PCR緩沖液、MgCl2和dNTP，質(zhì)控品選用9947A女性DNA或已知基因型的其它DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)人21號(hào)染色體STR基因型的試劑盒，其特征在于，所述分子量?jī)?nèi)標(biāo)包括 75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500 的14個(gè)片段長(zhǎng)度，采用熒光染料SIZ標(biāo)記分子量?jī)?nèi)標(biāo)，使用時(shí)加入電泳混合液與待測(cè)樣本一起電泳。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)人21號(hào)染色體STR基因型的試劑盒，其特征在于，所述等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)品由各STR基因座的所有已知等位基因經(jīng)混合調(diào)平衡后制備而成，使用時(shí)加入電泳混合液與待測(cè)樣本一起電泳，經(jīng)ABI GeneMapper IDv3.2軟件分析。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)人21號(hào)染色體STR基因型的試劑盒，其特征在于，所述弓I物混合物中的引物均對(duì)應(yīng)于基因座的側(cè)翼序列，其中每對(duì)弓丨物中有一條引物的5 ’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)人21號(hào)染色體STR基因型的試劑盒，其特征在于，每對(duì)引物分別用三種不同的熒光染料FAM、HEX、TAMRA進(jìn)行標(biāo)記，用于同時(shí)擴(kuò)增21號(hào)染色體上的11個(gè)STR基因座和I個(gè)性染色體`基因座。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)人類21號(hào)染色體STR基因型的試劑盒，由擴(kuò)增試劑和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)試劑組成，主要包含12對(duì)熒光標(biāo)記的引物、包含14個(gè)片段大小的分子量?jī)?nèi)標(biāo)、等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)品和一個(gè)質(zhì)控品。本發(fā)明試劑盒，使用時(shí)標(biāo)本需要量少、診斷快速，可用于絨毛、羊水、血液等多種組織，既可進(jìn)行產(chǎn)前診斷，也可用于21三體流產(chǎn)胚胎多余染色體的來(lái)源分析；能夠精確地診斷基因型，有利于診斷結(jié)果表述和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量評(píng)價(jià)；能實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化、高通量地檢測(cè)21號(hào)染色體數(shù)目，并實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量可控和標(biāo)準(zhǔn)化，具有臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103103267SQ201310020780
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月19日
發(fā)明者朱宇寧, 呂時(shí)銘, 薛佳, 鄭衛(wèi)國(guó), 陳雁, 張民 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院, 無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司, 杭州博圣生物技術(shù)有限公司