一種檢測(cè)人類y染色體微缺失的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及染色體缺失檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)人類Y染色體微缺失的試劑盒，其包括PCR反應(yīng)液Ⅰ、PCR反應(yīng)液Ⅱ、PCR反應(yīng)液Ⅲ；所述PCR反應(yīng)液Ⅰ包括：特異性擴(kuò)增ZFX/Y、sY254、sY134和SRY位點(diǎn)的引物和熒光探針；所述PCR反應(yīng)液Ⅱ包括：特異性擴(kuò)增ZFX/Y、sY84和Y127位點(diǎn)的引物和熒光探針；所述PCR反應(yīng)液Ⅲ包括：特異性擴(kuò)增ZFX/Y、sY255和sY86位點(diǎn)的引物和熒光探針；本發(fā)明試劑盒通過(guò)設(shè)計(jì)不同STS的特異性熒光探針，并優(yōu)化組合3管反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)一次試驗(yàn)即可檢測(cè)Y染色體的微缺失類型，并通過(guò)ZFX/Y對(duì)不同反應(yīng)體系進(jìn)行有效監(jiān)控。
【專利說(shuō)明】一種檢測(cè)人類Y染色體微缺失的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及染色體缺失檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)人類γ染色體微缺失的試劑 盒。

【背景技術(shù)】
[0002]人類Υ染色體長(zhǎng)臂上存在與精子生成密切相關(guān)的無(wú)精子因子（Azoospermia factor，AZF)，無(wú)精子因子發(fā)生微小的DNA片段缺失稱之為Y染色體微缺失。發(fā)生Y染色體 微缺失，會(huì)引起精子生成障礙，導(dǎo)致少、弱、畸形精子癥甚至無(wú)精子癥。據(jù) W!10統(tǒng)計(jì)，男性原 發(fā)性無(wú)精子癥與少精子癥患者中約10% -15%存在Y染色體微缺失。在精子生成障礙引起 的男性不育患者中，Y染色體微缺失的發(fā)生率是居于第二位的遺傳因素。
[0003] 目前，AZF被劃分為3個(gè)區(qū)，即AZFa、AZFb和AZFc，這些區(qū)域的任何一個(gè)或多個(gè)缺 失都將導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，造成少、弱、畸形精子癥甚至無(wú)精子癥，最終導(dǎo)致不育。在AZF 的3個(gè)區(qū)中，每個(gè)區(qū)域均有明確的序列標(biāo)簽位點(diǎn)（Seciuence tagged site, STS)可供識(shí) 別；每個(gè)區(qū)域的缺失機(jī)理和缺失的斷裂點(diǎn)均已明確。由歐洲男科協(xié)會(huì)（European Academy of Andrology，EM)和歐洲分子遺傳質(zhì)控網(wǎng)（European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)聯(lián)合發(fā)布的1999版、2004版和2013版《Y染色體微缺失分子診斷實(shí)踐指南》 均推薦使用多重PCR-瓊脂糖凝膠檢測(cè)STS的方法來(lái)檢測(cè)Y染色體的微缺失。同時(shí)，指南推 薦每個(gè)區(qū)域檢測(cè)2個(gè)STS，分別為AZFa檢測(cè)sY84和sY86, AZFb檢測(cè)sY127和sY134, AZFc 檢測(cè)sY254和sY255,若每個(gè)區(qū)域的2個(gè)STS同時(shí)發(fā)生缺失時(shí)，則代表該區(qū)域發(fā)生缺失；并 指出通過(guò)以上6個(gè)STS可以檢測(cè)出幾乎所有臨床相關(guān)的微缺失或95%文獻(xiàn)報(bào)道的AZF微缺 失，足以滿足常規(guī)診斷。
[0004] 現(xiàn)有的產(chǎn)品均能檢測(cè)指南推薦的6個(gè)STS,即：sY84、sY86、SY127、sY134、sY254、 sY255,但現(xiàn)有包含ZFX/Y和SRY雙內(nèi)控的產(chǎn)品均是不同管內(nèi)擴(kuò)增不同的內(nèi)控。在進(jìn)行多管 多重PCR擴(kuò)增時(shí)，要對(duì)每一管反應(yīng)體系的正常擴(kuò)增進(jìn)行監(jiān)控，而不同內(nèi)控不能有效地監(jiān)控 多管反應(yīng)體系檢測(cè)的穩(wěn)定性和可靠性。
[0005] 另外，現(xiàn)有產(chǎn)品采用的技術(shù)平臺(tái)也具有局限性。
[0006] υ多重pcr-瓊脂糖凝膠電泳。首先，瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度低， 產(chǎn)物量（上樣量）較少時(shí)條帶不易判別，難以區(qū)分弱陽(yáng)性與陰性，容易造成假陽(yáng)性或假陰 性；其次，該方法的分辨率低，擴(kuò)增片段之間必須達(dá)到30bp以上，才能較好區(qū)分；再者，瓊脂 糖凝膠電泳從制膠、上樣到信號(hào)讀取，均需人工操作，工作量大。
[0007] 2)其他平臺(tái)，如北京閱微（CN102912028A)采用測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，北京海斯特 (CN103571 957A)采用DHPLC進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)序儀和HPLC價(jià)格昂貴，儀器操作和結(jié)果判讀專業(yè) 性要求高，不利于推廣。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種在一次試驗(yàn)中所有PCR反應(yīng)體系采用同 一個(gè)內(nèi)控ZFX/Y進(jìn)行監(jiān)測(cè)，能方便、快速、可靠地檢測(cè)人類Y染色體微缺失的試劑盒。
[0009] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：提供一種檢測(cè)人類Υ染色體 微缺失的試劑盒，包括PCR反應(yīng)液 1、PCR反應(yīng)液11、PCR反應(yīng)液111 ;
[0010] 所述PCR反應(yīng)液I包括：
[0011] 特異性擴(kuò)增ZFX/?位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示；ZFX/ Y位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID N0 :3 ;
[0012] 特異性擴(kuò)增Y染色體sY254位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所 示；sY254位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :6 ;
[0013] 特異性擴(kuò)增Y染色體sY134位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8所 示；sY134位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :9 ;
[0014] 特異性擴(kuò)增Y染色體SRY位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :1〇和SEQ ID NO :11所 示；SRY位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :12 ;
[0015] 所述PCR反應(yīng)液II包括：
[0016] 特異性擴(kuò)增ZFX/Υ位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；ZFX/ Y位點(diǎn)熒光探針,序列如SEQ ID NO :3 ;
[0017] 特異性擴(kuò)增sY84位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :14所示sY84 位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :15 ;
[0018] 特異性擴(kuò)增sY127位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :16和SEQ ID NO :17所示； sY127位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :18 ;
[0019] 所述PCR反應(yīng)液III包括：
[0020] 特異性擴(kuò)增ZFX/Y位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；ZFX/ Y位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :3 ;
[0021] 特異性擴(kuò)增sY255位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :19和SEQ ID NO :20所示； sY255位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :21 ;
[0022] 特異性擴(kuò)增sY86位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :22和SEQ ID NO :23所示；sY86 位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :24。
[0023] 本發(fā)明有益效果：目前，市場(chǎng)上的現(xiàn)有產(chǎn)品雖然符合EAA/EMQN指南的檢測(cè)要求， 但不是所有產(chǎn)品都包含ZFX/Υ和SRY雙內(nèi)控，而包含雙內(nèi)控的產(chǎn)品均是不同管內(nèi)擴(kuò)增不同 的內(nèi)控。本發(fā)明在進(jìn)行多管多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增時(shí)，對(duì)每一管反應(yīng)體系的正常擴(kuò)增進(jìn)行內(nèi)部 控制，采用ZFX/Υ作為每一管反應(yīng)體系的內(nèi)控，有效地監(jiān)控多管反應(yīng)體系檢測(cè)的穩(wěn)定性和 可靠性。且本發(fā)明試劑盒通過(guò)設(shè)計(jì)不同STS的特異性熒光探針，優(yōu)化組合3管反應(yīng)體系，實(shí) 現(xiàn)一次試驗(yàn)即可檢測(cè)Y染色體的微缺失類型，并能保證對(duì)不同反應(yīng)體系的有效監(jiān)控，從而 避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的假陰性現(xiàn)象，使用本發(fā)明試劑盒，還可以有效地減少操作人員的工作量， 降低污染風(fēng)險(xiǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為本發(fā)明試劑盒第I管正常男性DNA樣本檢測(cè)圖；
[0025] 圖2為本發(fā)明試劑盒第II管正常男性DNA樣本檢測(cè)圖；
[0026] 圖3為本發(fā)明試劑盒第III管正常男性DNA樣本檢測(cè)圖；
[0027] 圖4為本發(fā)明試劑盒第I管AZFc區(qū)缺失樣本檢測(cè)圖；
[0028] 圖5為本發(fā)明試劑盒第II管AZFc區(qū)缺失樣本檢測(cè)圖；
[0029] 圖6為本發(fā)明試劑盒第III管AZFc區(qū)缺失樣本檢測(cè)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 為詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式 并配合附圖詳予說(shuō)明。
[0031] 本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于：在每個(gè)PCR反應(yīng)體系采用同一個(gè)內(nèi)控ZFX/Y進(jìn)行監(jiān)測(cè)， 并實(shí)現(xiàn)一次試驗(yàn)即可檢測(cè)Y染色體的微缺失類型，方便、快速、結(jié)果可靠。 W
[0032] ZFX/Y是位于性染色體上的鋅指蛋白基因，在χ、γ染色體上均有其同源序列，該位 點(diǎn)在男性和女性樣本中都可以正常擴(kuò)增。選擇ZFX/Y基因作為每個(gè)PCR反應(yīng)體系的內(nèi)控，可 以同時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增效果，避免操作誤差造成的假陰性現(xiàn)象。本發(fā)明采用多重 多色熒光PCR技術(shù)，每個(gè)反應(yīng)體系中多增加1個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)，就會(huì)增加反應(yīng)體系的擴(kuò)增難度， 對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的有效擴(kuò)增產(chǎn)生較大的影響。但本發(fā)明通過(guò)對(duì)ZFX/Y基因引物和探針的設(shè) 計(jì)、篩選，優(yōu)化每個(gè)反應(yīng)體系的擴(kuò)增條件，實(shí)現(xiàn)每個(gè)PCR反應(yīng)體系采用同一個(gè)內(nèi)控ZFX/Y進(jìn) 行監(jiān)測(cè)，確保每個(gè)反應(yīng)體系檢測(cè)的穩(wěn)定性和可靠性。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 1、技術(shù)基礎(chǔ)
[0035] 1· 1利用已知的Υ染色體微缺失及STS的研究成果進(jìn)行多重PCR反應(yīng)液的設(shè)計(jì)和 實(shí)施。
[0036] 其主要研究?jī)?nèi)容包括：根據(jù)1999版、2004版和2013版EM/EMQN指南的要求和 推薦的STS，設(shè)計(jì)不同熒光標(biāo)記的STS檢測(cè)探針；根據(jù)不同區(qū)域STS的特點(diǎn)和探針標(biāo)記基 團(tuán)，分別設(shè)計(jì)3管PCR反應(yīng)體系，每管反應(yīng)體系用相應(yīng)的STS擴(kuò)增引物和探針進(jìn)行多重?zé)?光PCR擴(kuò)增，特異性地檢測(cè)不同的STS。每管反應(yīng)體系均用人類鋅指蛋白基因 ZFX/Y作為 頭驗(yàn)內(nèi)控，弟I管反應(yīng)體系問(wèn)時(shí)擴(kuò)增雄性性別決定基因（Sex-determine Region of Y- Chromosome，SRY)作為性別異常對(duì)照。
[0037] 1. 2利用實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增的檢測(cè)
[0038] 實(shí)時(shí)熒光PCR(real-time PCR，RT-PCR)，是一種以熒光化學(xué)染料為發(fā)光基團(tuán)，通過(guò) PCR擴(kuò)增，以及探針與目的片段的雜交來(lái)對(duì)整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的技術(shù)。與傳統(tǒng) 的PCR方法相比，實(shí)時(shí)熒光PCR可以實(shí)現(xiàn)高效、快速、實(shí)時(shí)的自動(dòng)化檢測(cè)。
[0039] 將3管PCR反應(yīng)體系加入模板DNA后，置于實(shí)時(shí)焚光PCR儀（Applied Biosystems 7500)中，設(shè)定PCR反應(yīng)程序，即可完成對(duì)樣本的檢測(cè)和分析。
[0040] 2、具體技術(shù)實(shí)施方案
[0041] 2. 1 STS和內(nèi)控的引物、探針設(shè)計(jì)
[0042] 根據(jù)EAA/EMQN指南的要求，選擇指南推薦的STS和內(nèi)控位點(diǎn)，在NCBI (National Center of Biotechnology Information)上查找各個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增片段和擴(kuò)增引物序列，根 據(jù)引物和擴(kuò)增片段的位置關(guān)系設(shè)計(jì)相應(yīng)的Taqman熒光探針序列，由英濰捷基（上海）貿(mào)易 有限公司合成。序列合成完畢后由公司人員核對(duì)，然后根據(jù)需要稀釋成所需濃度。通過(guò)各 STS的擴(kuò)增檢測(cè)，驗(yàn)證引物、探針的擴(kuò)增特異性。根據(jù)EAA/EMQN指南的推薦，本發(fā)明試劑和 選擇的位點(diǎn)的引物、探針序列見(jiàn)表1。
[0043] 表 1
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)人類Y染色體微缺失的試劑盒，其特征在于，包括PCR反應(yīng)液I、PCR反應(yīng) 液II和PCR反應(yīng)液III ; 所述PCR反應(yīng)液I包括： 特異性擴(kuò)增ZFX/Y位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；ZFX/Y位 點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :3 ; 特異性擴(kuò)增Y染色體sY254位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所示； sY254位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :6 ; 特異性擴(kuò)增Y染色體sY134位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8所示； sY134位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :9 ; 特異性擴(kuò)增Y染色體SRY位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :11所示； SRY位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :12 ; 所述PCR反應(yīng)液II包括： 特異性擴(kuò)增ZFX/Y位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；ZFX/Y位 點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :3 ; 特異性擴(kuò)增sY84位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :14所示sY84位點(diǎn) 熒光探針，序列如SEQ ID NO :15 ; 特異性擴(kuò)增sY127位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :16和SEQ ID NO :17所示；sY127 位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :18 ; 所述PCR反應(yīng)液III包括： 特異性擴(kuò)增ZFX/Y位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；ZFX/Y位 點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :3 ; 特異性擴(kuò)增sY255位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :19和SEQ ID NO :20所示；sY255 位點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :21 ; 特異性擴(kuò)增sY86位點(diǎn)的引物，序列如：SEQ ID NO :22和SEQ ID NO :23所示；sY86位 點(diǎn)熒光探針，序列如SEQ ID NO :24。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)人類Y染色體微缺失的試劑盒，其特征在于，所述ZFX/Y 位點(diǎn)突光探針5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記BHQ ; 所述sY254位點(diǎn)熒光探針5'端標(biāo)記HEX，3'端標(biāo)記BHQ1 ; 所述sY134位點(diǎn)熒光探針5'端標(biāo)記R0X，3'端標(biāo)記BHQ2 ; 所述SRY位點(diǎn)熒光探針5'端標(biāo)記CY5, 3'端標(biāo)記BHQ3 ; 所述sY84位點(diǎn)熒光探針5'端標(biāo)記HEX，3'端標(biāo)記BHQ1 ; 所述sY127位點(diǎn)熒光探針5'端標(biāo)記R0X，3'端標(biāo)記BHQ2 ; 所述sY255位點(diǎn)熒光探針5'端標(biāo)記HEX，3'端標(biāo)記BHQ1 ; 所述sY86位點(diǎn)熒光探針5'端標(biāo)記R0X，3'端標(biāo)記BHQ2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)人類Y染色體微缺失的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒 的每個(gè) PCR 反應(yīng)液還分別包括：10XPCR Buffer，5XQ Solution，25mM MgCl2,25mM dNTP， 1U/ μ L UNG 酶，HotStart Taq。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)人類Y染色體微缺失的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒 的每個(gè)PCR反應(yīng)液中每條引物和熒光探針的起始濃度為100 μ M。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104232779SQ201410489611
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】滕樂(lè), 林斯里, 田潔 申請(qǐng)人:亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司