專利名稱：先天性異常癥的染色體缺失的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及伴有疾病的染色體缺失的檢測(cè)方法，具體而言，是涉及通過(guò)對(duì)特定染 色體區(qū)域的半合子缺失進(jìn)行檢測(cè)來(lái)辨別伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征的方法的 發(fā)明。
背景技術(shù)：
先天性異常綜合征的患者大多數(shù)都被觀察到染色體DNA的特定區(qū)域缺失。目 前，基因組的缺失區(qū)域被明確的先天性異常綜合征已知有很多。作為報(bào)告為以半合子缺 失作為原因的疾病的先天性異常綜合征的例子，例如已知有Williams綜合征(7qll.2)、 Smith-Magenis 綜合征(17pll. 2)、Langer-Giedion 綜合征(8q24)、Wolf-Hirschhorn 綜 合征 0ρ16· 3)、Miller-Dieker 綜合征(17ρ 13. 3)、Prader-Willi and Angelman 綜合征 (15qll-ql3)、WAGR 綜合征(llpl3)、Cri du Chat 綜合征(5ρ15· 3)、Rubinstein-Taybi 綜合征(16ρ13· 3)、毛發(fā)一鼻一指(趾)(Tricho-rhino-phalangeal)綜合征(8q24. 1)、 Potoki-Shaffer 綜合征(llpll. 2)、神經(jīng)皮膚(Neurofibromatosis) I 綜合征(17qll)、 Sotos 綜合征(5q35)、顱縫早閉(Craniosynostosis)綜合征(7ρ21· 1)、Kallmann type 1 綜合征(Xp22. 3) ,Kallmann type 2 綜合征(8pll. 12) ,Van der Woude 綜合征(Iq32_q41)、 ZFHXlB 缺失綜合征 Oq22)、先天性瞼裂狹小(Bi印harophimosis ptosis and epicanthus inversus)綜合征(3q23)、Ip36 綜合征(1ρ36)、貓眼(Cat eye)綜合征(22qll)、Alagille 綜合征(20pll. 23)、Diamond-Blackfan綜合征(19ql3. 2)、先天性腎上腺發(fā)育不全 (Adrenal hypoplasia congenita) (Xp21. 2) >Coffin-lowry 綜合征(Xp22. 3)、DiGeorge 綜 合征(22qll) ,Russell-Silver 綜合征(7pll. 2) ,Duchenne 肌萎縮(Χρ21· 2)等。(專利文 獻(xiàn)1 《基因組DNA的固著基底和使用了該基底的染色體異常及以此作為原因的疾病的檢測(cè) 方法(Y ^ A DNA O定著基盤i當(dāng)該基盤f用0 t染色體異常並t/ (二 Λ (二起因t 3疾患 O検出方法)》)。O內(nèi)的標(biāo)注表示這些綜合征中半合子缺失的染色體區(qū)域。另一方面，先天性異常綜合征中有染色體DNA的特定區(qū)域擴(kuò)增的例子。例如唐氏 綜合征中21號(hào)染色體形成三倍體，Pallister-Killian綜合征中12號(hào)染色體短臂形成四倍 體。Pelizaeus Merzkicher病(髓鞘形成障礙疾病)中Xq22區(qū)域的擴(kuò)增是該病的原因。但是，例如像成為本發(fā)明的判定對(duì)象的“伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征” 那樣，存在很多原因不明的先天性異常綜合征。在這樣的情況下，關(guān)于原因不明的疾病，對(duì) 人基因組DNA進(jìn)行無(wú)遺漏的分析，找出基因組DNA的缺失、擴(kuò)增是非常有意義的。即，通過(guò) 確定疾病原因存在于特定的基因組DNA，來(lái)對(duì)該疾病進(jìn)行準(zhǔn)確迅速的判定，可以進(jìn)行正確的 處置。另外，對(duì)成為該疾病的原因的基因組微細(xì)結(jié)構(gòu)異常的鑒定成為可能，認(rèn)為這也與將來(lái) 的基因水平的治療可能性有關(guān)。專利文獻(xiàn)1 特開(kāi) 2005-304481非專利文獻(xiàn)1 陣列CGH診斷活用指導(dǎo)手冊(cè)(7 H CGH診斷活用另^ Y V ”、、 稻澤讓治 蒔田芳男 羽田明編，p40 50和p78 81，株式會(huì)社醫(yī)藥雜志社2008年2月出版

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對(duì)伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征的疾病，分析人染色體有無(wú) 擴(kuò)增或者缺失，明確其原因，提供該疾病的辨別方法。本發(fā)明人為了發(fā)現(xiàn)能高效分析伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征(Multiple Congenital Anomaly-Mental Retardation)的基因組異常的方法，而進(jìn)行了探討。首先，20家設(shè)施的兒科?？漆t(yī)生進(jìn)行多發(fā)性畸形綜合征的病例登記，根據(jù)臨床 癥狀進(jìn)行判斷，除外強(qiáng)烈懷疑已知的先天性異常癥的病例。然后應(yīng)用基因組無(wú)序陣列 (Genome Disorder Array)進(jìn)行分析，鑒定了已知的微細(xì)結(jié)構(gòu)異常和亞端粒結(jié)構(gòu)異常為原 因的疾病。兒科領(lǐng)域中的臨床遺傳學(xué)?？漆t(yī)生對(duì)無(wú)法通過(guò)使用了基因組無(wú)序陣列的分析明 確原因的疾病進(jìn)行判斷，進(jìn)而限定病例，使用MCG全基因組陣列-4500(MCG Whole Genome Array-4500)進(jìn)行無(wú)遺漏的分析。結(jié)果檢測(cè)出多數(shù)疾病中相同區(qū)域(10q24. 31_10q25. 1)的 基因異常為半合子缺失，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供染色體缺失的檢測(cè)方法，其通過(guò)對(duì)人染色體的10q24. 31_10q25. 1區(qū) 域(以下也會(huì)簡(jiǎn)記為10q24. 31-10q25. 1區(qū)域等)的半合子缺失進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)辨別伴有精神 發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征(以下，也稱為本發(fā)明的檢測(cè)方法)。所謂半合子缺失，是指兩條一組的染色體中缺失一條的雜合性缺失。認(rèn)為在 10q24. 31-10q25. 1區(qū)域的純合子缺失的情況下生存本身恐怕很難。本發(fā)明的檢測(cè)方法，優(yōu)選利用含有10q24. 31_10q25. 1區(qū)域的一部分的核酸與樣 品核酸的雜交來(lái)檢測(cè)因該基因區(qū)域的半合子缺失而產(chǎn)生的信號(hào)，由此來(lái)進(jìn)行。另外，這種 優(yōu)選的方式，典型地說(shuō)在固著有含有該基因區(qū)域的一部分的核酸(以下記為核酸探針)的 基板(DNA陣列)上適當(dāng)進(jìn)行。所使用的核酸探針是寡核苷酸、cDNA、BAC(細(xì)菌人工染色 體Bacterial Artificial Chromosome) DNA、PAC (噬菌體人工染色體Phage Artificial Chromosome) DNA、或YAC (酵母人工染色體Yeast Artificial Chromosome) DNA 等。作為核 酸探針的優(yōu)選方式，可以舉出這些核酸通過(guò)PCR等方法得到的無(wú)窮盡化的基因擴(kuò)增產(chǎn)物。 這樣的核酸探針的使用在后面敘述。另夕卜，也可以應(yīng)用DNA芯片法、DNA印跡(Southern blotting)法、RNA印 跡(Northern blotting)法、實(shí)時(shí) RT-PCR 法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerase Chain Reaction)、FISH法、或CGH法等，實(shí)施本發(fā)明的檢測(cè)方法。作為供于本發(fā)明的檢測(cè)方法的試驗(yàn)樣品，優(yōu)選血液樣品，特別優(yōu)選為血漿，但也可 以使用組織切片、淋巴液、痰液、組織培養(yǎng)物等。另外，也可以將羊水、臍帶血、絨毛用作樣 品。進(jìn)而，作為著床前的診斷，也可以將受精卵用作樣品。通過(guò)本發(fā)明，提供一種辨別先天性異常綜合征的染色體缺失的方法，更具體地說(shuō) 提供一種辨別伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征的方法。


圖1是例示出對(duì)伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征的基因組異常進(jìn)行鑒定 的方案的圖。
圖2A是表示在本實(shí)施例的病例1 (case 1)時(shí)以應(yīng)用MCG全基因組陣列-4500進(jìn) 行CGH分析得到的熒光強(qiáng)度比作為指標(biāo)的結(jié)果的相片。圖2B是表示在本實(shí)施例的病例2 (case 2)時(shí)以應(yīng)用MCG全基因組陣列-4500進(jìn) 行CGH分析得到的熒光強(qiáng)度比作為指標(biāo)的結(jié)果的相片。圖3是表示本實(shí)施例中應(yīng)用MCG全基因組陣列-4500的分析結(jié)果的基因組異常區(qū) 域的圖譜(mapping)的相片。圖4A是表示在本實(shí)施例的病例1 (case 1)時(shí)以應(yīng)用AgilentM4K微陣列 (oligoarray)進(jìn)行分析得到的熒光強(qiáng)度比作為指標(biāo)的結(jié)果的相片。圖4B是表示在本實(shí)施例的病例2 (case 2)時(shí)以應(yīng)用AgilentM4K微陣列進(jìn)行分 析得到的熒光強(qiáng)度比作為指標(biāo)的結(jié)果的相片。圖5是表示本實(shí)施例中應(yīng)用AgilentM4K微陣列的分析結(jié)果的基因組異常區(qū)域的 圖譜的相片。圖6是表示利用使用了本實(shí)施例的正常人淋巴細(xì)胞的染色體標(biāo)本的熒光原位雜 交進(jìn)行染色體缺失分析的結(jié)果的相片。
具體實(shí)施例方式使用DNA陣列的形式(I)DNA 陣列如上所述，在進(jìn)行本發(fā)明的測(cè)定方法時(shí)，優(yōu)選使用搭載有寡核苷酸、cDNA、BAC DNA, PAC DNA、或YAC DNA等核酸探針的DNA陣列。作為用作該陣列的基板的材料，可以使 用玻璃、塑料、膜、三維陣列，但通常優(yōu)選載玻片等玻璃基板。玻璃等固體基板更優(yōu)選通過(guò) 聚-L-賴氨酸、氨基硅烷、金一招等的凝集來(lái)涂敷基板。(2)WGA_4500 陣列作為極為有力的進(jìn)行本發(fā)明的檢測(cè)方法的實(shí)施方式，可以進(jìn)行使用了 MCG全基 因組陣列(Whole Genome Array)-4500 (也會(huì)簡(jiǎn)稱為WGA-4500 ；非專利文獻(xiàn)1)的CGH(比 較基因組雜交Comparative Genomic Hybridization)法，所述MCG全基因組陣列-4500 搭載有無(wú)遺漏地被覆染色體的BAC DNA。WGA-4500是全基因組陣列，其搭載有22種常染 色體和X、Y性染色體的全部染色體均無(wú)遺漏的4523個(gè)BAC克隆，平均分辨率為約0. 7Mb。 這涉及人染色體常染色質(zhì)區(qū)域的約三分之一。在應(yīng)用WGA-4500的情況下，通常認(rèn)為含有 10q24. 31-10q25. 1區(qū)域的一部分的核酸探針的吸附量比的以2為底的對(duì)數(shù)比為-0. 3以下 時(shí)，檢測(cè)出本發(fā)明涉及的半合子缺失，但并不限于該基準(zhǔn)。在引用該基準(zhǔn)的情況下，更具體而言，在RPl 1-551E2、RP11-416N2、RPl 1-18114、 RP11-30H12、 RP11-16H23、 RP11-80B2、 RP11-99N20、 RP11-541N10、 RP11-302K17、 RP11-89G15、 RP11-68M5、 RP11-21N23、 RP11-105N15、 RP11-302K17、 RP11-551E2、 RP11-416N2、 RP11-18I14、 RP11-30H12、 RP11-107I14、 RP11-108L7、 RP-11-91A6、 RP11-37L21、(都是BAC DNA)為-0. 3以下時(shí)，被認(rèn)為是檢測(cè)出半合子缺失。(3)陣列的其他形式另外，也可以使用使陣列上搭載的核酸探針與上述的半合子缺失的圖形相吻合進(jìn) 行限定而減少的DNA-陣列。不過(guò)，該DNA陣列中至少要具有含10q24. 31_10q25. 1區(qū)域的一
5部分的核酸探針。例如在使用BAC DNA作為核酸探針的情況下，優(yōu)選至少?gòu)纳鲜龅?2種BAC DNA組中選擇的一種以上的BAC DNA被固定。另外，更優(yōu)選同時(shí)固定有10q24. 31_10q25. 1 區(qū)域以外的相應(yīng)BAC DNA—種以上。(4)目標(biāo)核酸的無(wú)窮盡化(無(wú)近蔵化)在DNA陣列的制作中，通常得到的BAC DNA等中有少量會(huì)制造出大量的基因組DNA 固著基板而實(shí)用化，所以優(yōu)選作為基因擴(kuò)增產(chǎn)物得到該DNA (將該基因擴(kuò)增工程也稱為“無(wú) 窮盡化”)。就無(wú)窮盡化而言，首先是BAC DNA等經(jīng)過(guò)4堿基識(shí)別酶例如RsaI、DpnI、HaeIII 等消化后，接上銜接頭(adaptor)，進(jìn)行連接。銜接頭是由10 30個(gè)堿基、優(yōu)選15 25個(gè) 堿基組成的寡聚核苷酸，兩條鏈具有互補(bǔ)的序列，退火后，形成平滑末端的一側(cè)的3’末端的 寡核苷酸需要磷酸化。然后使用序列與銜接頭的一方的寡核苷酸的序列相同的引物，用PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，就可以無(wú)窮盡化。另一方面，各BAC DNA等也可以使用具有特征性的50 70個(gè)堿基的氨基化寡核苷酸作為檢測(cè)用探針。上述無(wú)窮盡化后的DNA在基板上點(diǎn)樣(spot)的濃度優(yōu)選IOpg/ μ 1 5 μ g/ μ 1， 更優(yōu)選lng/μ 1 200ng/y 1。點(diǎn)樣量?jī)?yōu)選Inl 1 μ 1，更優(yōu)選IOnl lOOnl。另外， 對(duì)在基板上固著的樣品的各點(diǎn)的大小和形狀沒(méi)有特別限定，但比如可以是其大小為直徑 0.01 1mm，從上面看的形狀是圓形 橢圓形。對(duì)干燥后的點(diǎn)的厚度沒(méi)有特別限定，但為 1 100 μ m。進(jìn)而對(duì)點(diǎn)的個(gè)數(shù)沒(méi)有特別限定，但每個(gè)使用的基板為10 50000個(gè)，更優(yōu)選 為100 5000個(gè)。各DNA重復(fù)一次到四次點(diǎn)樣，但優(yōu)選重復(fù)兩次或者三次。干燥點(diǎn)例如可以用點(diǎn)樣儀將無(wú)窮盡化后的BAC DNA等滴到基板上，形成多個(gè)點(diǎn) 后，通過(guò)干燥點(diǎn)進(jìn)行制作。作為點(diǎn)樣儀，可以使用噴墨式打印機(jī)、針狀陣列(pin-array) 式打印機(jī)、氣泡式噴墨(注冊(cè)商標(biāo))打印機(jī)，但優(yōu)選使用噴墨式打印機(jī)。例如可以使用 GENESH0T (注冊(cè)商標(biāo))(日本礙子株式會(huì)社、名古屋)等。通過(guò)將如此無(wú)窮盡化后的BAC DNA等固著在基板上，優(yōu)選固著在固體基板上，可以 制造所要求的DNA固著基板。(5)雜交的方式(a)雙色熒光法在使用DNA陣列和標(biāo)記核酸的雜交法[CGH(Comparative Genomic Hybridization)法]中，例如可以使用雙色熒光法進(jìn)行。雙色熒光法是指對(duì)例如一個(gè)DNA陣列或者一段雜交區(qū)域使用兩種不同試樣來(lái)源 的標(biāo)記目標(biāo)核酸的方法。在這里，與標(biāo)記目標(biāo)核酸結(jié)合的標(biāo)記化合物都是不同的。制備將 正常樣品來(lái)源的目標(biāo)核酸標(biāo)記后的標(biāo)記目標(biāo)核酸，制備用患者樣品來(lái)源的目標(biāo)核酸標(biāo)記后 的標(biāo)記目標(biāo)核酸，將這兩者混合后，與一個(gè)CGH陣列上的核酸探針進(jìn)行雜交，由此算出吸附 量比。例如在用熒光標(biāo)記的情況下，根據(jù)其熒光值的強(qiáng)度比算出吸附量比。(b)標(biāo)記本發(fā)明中的“標(biāo)記”是指使能夠檢測(cè)出來(lái)的物質(zhì)與目標(biāo)核酸結(jié)合的行為，如果能夠 檢測(cè)出來(lái)的話，都可以組入本發(fā)明涉及的目標(biāo)核酸。例如可以選擇熒光物質(zhì)、無(wú)機(jī)化合物、 蛋白質(zhì)(在ELISA(酶聯(lián)免疫吸收分析Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)等中應(yīng)用 的酶標(biāo)記抗體等)、放射性同位素、FRET (熒光共振能量轉(zhuǎn)移)等。對(duì)用作標(biāo)記的熒光物質(zhì)沒(méi)有特別限定，但可以使用異硫氰酸熒光素(FITC)、Cy3、Cy5、Cy7、綠色熒光蛋白(GFP，Green Fluorescent Protein)、藍(lán)色熒光蛋白(BFP，Blue Fluorescent Protein)、黃色熒光蛋白(YFP, Yellow Fluorescent Protein)、紅色熒光蛋 白(RFP，Red Fluorescent Protein)、Alexa、吖啶(Acridine)、DAPI、溴化乙錠(Ethidium bromide)、SYBR Green、得克薩斯紅(Texas Red)、稀土類熒光標(biāo)識(shí)試劑[4,4'-雙(1"， 1"，1〃，2〃，2〃，3〃，3〃 -七氟-4"，6〃 -己二酮_6"-基)_氯磺酰-鄰三聯(lián)苯 (BHHCT)]、吖啶橙、TAMRA, ROX 等。對(duì)用作標(biāo)記的無(wú)機(jī)化合物沒(méi)有特別限定，例如可以舉出由半導(dǎo)體無(wú)機(jī)材料制成的 量子點(diǎn)。作為其例子，可以舉出二氧化硅、CdTe、a^e、Cdk的納米微粒。這種微?？梢酝?過(guò)改變其粒徑來(lái)使發(fā)出的熒光波長(zhǎng)發(fā)生變化，在直徑2nm時(shí)是藍(lán)色，在直徑3nm時(shí)是綠色， 在直徑4nm時(shí)是黃色，在直徑5nm時(shí)是紅色。如此也可以檢測(cè)出熒光，也可以檢測(cè)出其粒子 的存在。例如，作為檢測(cè)粒子存在的方法，可以使用AFM(原子間力顯微鏡)。作為標(biāo)記，還可以使用地高辛(Digoxigenin =DIG)，生物素等。作為使用生物素的 例子，例如可以舉出利用以下的紫色發(fā)色，即讓結(jié)合于目標(biāo)核酸的生物素與抗生物素蛋白 (avidin)結(jié)合，使其與結(jié)合有生物素的堿性磷酸酶結(jié)合，添加作為堿性磷酸酶的底物的硝 基四氮唑蘭和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，由此可以顯示紫色。進(jìn)而，也可以進(jìn)行非酶性的標(biāo)記。例如也可以使用ULS array CGH Labeling Kit(Kreatech Biotechnology BV 公司)等。(c)目標(biāo)核酸的純化本發(fā)明中，在從樣品制備目標(biāo)核酸時(shí)，有必要進(jìn)行純化。此時(shí)，在后述的標(biāo)記時(shí)，發(fā) 生各種副反應(yīng)，并且蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等細(xì)胞溶解物對(duì)背景噪聲產(chǎn)生很大的影響，如果不進(jìn)行純 化，使利用核酸微陣列等的雜交試驗(yàn)的性能顯著下降?！凹兓痹谶@里和提取、分離、分取等是同義詞。作為用于其的方法，可以有使用了 擔(dān)載有氧化硅、纖維素衍生物等的核酸吸附性膜的柱(cartrige)的方法；還有利用乙醇沉 淀、異丙醇沉淀、苯酚一氯仿提取、使用了離子交換樹(shù)脂、結(jié)合有十八烷基等疏水性取代基 的氧化硅載體、示出尺寸排除效應(yīng)的樹(shù)脂的固相提取柱、色譜法等的方法。進(jìn)而也可以包括 利用電泳法的純化。另外，本發(fā)明中溶劑置換廣義上也被稱為純化。本發(fā)明中，在從目標(biāo)細(xì)胞制作目標(biāo)核酸的情況下，也可以進(jìn)行兩次純化工序。本 發(fā)明中，作為從目標(biāo)細(xì)胞的純化工序，即作為第一次的純化工序，可以使用使用了擔(dān)載有 氧化硅、纖維素衍生物等的核酸吸附性膜的柱的方法；乙醇沉淀；異丙醇沉淀；苯酚一氯 仿提取等。其中優(yōu)選使用將三醋酸纖維素皂化而制備的核酸吸附性多孔膜保持在柱中的 QuickGene系列(富士膠片株式會(huì)社)進(jìn)行純化，這是因?yàn)?，通過(guò)使用QuickGene系列，可以 使用低價(jià)格的機(jī)器，半自動(dòng)地進(jìn)行目標(biāo)核酸的制備。進(jìn)而也可以進(jìn)行另一個(gè)階段的純化工序。即，用于提高所制備的目標(biāo)核酸的濃度、 純度的純化。例如在使用了苯酚一氯仿提取法、各種沉淀方法的情況下，其純化度通常比柱 層析法差，會(huì)影響后續(xù)的工序。作為第二次的純化法，可以使用使用了擔(dān)載有氧化硅等的 核酸吸附性膜的柱的方法；還可以使用利用乙醇沉淀、異丙醇沉淀、使用了離子交換樹(shù)脂、 結(jié)合有十八烷基等疏水性基團(tuán)的氧化硅載體、示出尺寸排除效應(yīng)的樹(shù)脂的固相提取柱、色 譜法等的方法。其中最合適的是利用QuickGene SP試劑盒(富士膠卷株式會(huì)社)的純化 方法。
QucikGene SP試劑盒的核酸吸附性多孔膜與氧化硅系核酸吸附性多孔膜相比非 常薄，適合少量核酸的提取，與其他方法相比也可以得到高濃度的目標(biāo)核酸。另外，與可以 進(jìn)行少量液體量的純化的乙醇沉淀法或異丙醇沉淀相比，可以得到更高純度的目標(biāo)核酸， 是適合得到少量且高濃度的目標(biāo)核酸的方法。[其他的檢測(cè)方式](1)染色體檢查如果能夠明確與原因不明的伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征相關(guān)聯(lián)的人 基因組的特定區(qū)域的異常，尤其是在伴有IOMb左右的缺失而10q24. 31_10q25. 1區(qū)域有半 合子缺失的情況下，可以通過(guò)G鑒別染色法等染色體檢查進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明可以通過(guò)觀察 該區(qū)域的染色體狀態(tài)的不同(含有10q24. 31-10q25. 1區(qū)域的染色體條帶的有無(wú)消失)檢 測(cè)出來(lái)。(2)利用FISH法的檢測(cè)如果是數(shù)Mb以下的微細(xì)的基因組異常，可以應(yīng)用FISH法[熒光原位雜交(FISH Fluorescence in situ hybridization) Yasui, K. , Imoto, I. , Fukuda, Y. , Pimkhaokham, A. , Yang, Z. Q. , Naruto, Τ. , Shimada, Y. , Nakamura, Y. , and Inazawa, J !Identification of target genes within an amp1 icon at 14ql2_ql3 in esophageal squamous cell carcinoma(食管鱗狀細(xì)胞癌中14ql2_ql3的擴(kuò)增子中目標(biāo)基因的鑒定).Genes Chromosomes Cancer (基因染色體癌)，32，112-118，2001]等，以基于核酸雜交的信號(hào)為基 礎(chǔ)進(jìn)行檢測(cè)。此時(shí)，制作10q24. 31-10q25. 1區(qū)域的FISH探針，與患者來(lái)源的染色體進(jìn)行雜 交，觀察信號(hào)數(shù)量的減少，由此可以檢測(cè)出半合子缺失。(3) DNA 印跡法應(yīng)用DNA印跡法時(shí)，對(duì)由樣品得到的基因組DNA進(jìn)行限制酶消化，對(duì)其進(jìn)行凝膠電 泳后，在硝酸纖維素膜上固定之后，使其與標(biāo)記過(guò)的10q24. 32-q25. 1區(qū)域的DNA進(jìn)行雜交 而進(jìn)行檢測(cè)，由此檢測(cè)出樣品中存在該基因的方法。在半合子缺失的情況下，相對(duì)于從正常 來(lái)源的樣品得到的檢測(cè)量(條帶的濃度)，從患者來(lái)源的樣品得到的檢測(cè)量少，且認(rèn)為有不 同的條帶出現(xiàn)，由此可以進(jìn)行判定。(4) RNA 印跡法 就RNA印跡法而言，將從樣品得到的全部RNA供于電泳，以與DNA印跡法相同的操 作在膜上固定，使其與標(biāo)記過(guò)的10q24. 32-q25. 1區(qū)域的DNA進(jìn)行雜交而進(jìn)行檢測(cè)，由此檢 測(cè)出樣品中存在該基因的方法。相對(duì)于從正常來(lái)源的樣品得到的檢測(cè)量(條帶的濃度)，從 患者來(lái)源的樣品得到的檢測(cè)量少的情況下，可以判定為10q24. 32-q25. 1區(qū)域的半合子缺失。⑶實(shí)時(shí)RT-PCR法就實(shí)時(shí)RT-PCR法而言，準(zhǔn)備至少一種與樣品DNA的10q24. 32_q25. 1區(qū)域的轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進(jìn)行基因的擴(kuò)增工序，根據(jù)該擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)生 成、生成量來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的方法。相對(duì)正常來(lái)源的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物量，來(lái)自患者來(lái)源DNA的擴(kuò) 增產(chǎn)物量少，由此可以判定半合子缺失。將直到鑒定與本發(fā)明有關(guān)的基因異常為止的方案示于圖1。另外，該鑒定的更具體 內(nèi)容作為實(shí)施例加以公開(kāi)。
實(shí)施例以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明加以更具體的說(shuō)明。(A)MCG全基因組陣列-4500如上所述，在實(shí)施本發(fā)明的檢測(cè)方法時(shí)，為了找出人染色體的10q24. 31_10q25. 1 區(qū)域的半合子缺失與伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征有關(guān)而采用的檢測(cè)手段，是 MCG全基因組陣列-4500。關(guān)于其檢測(cè)基板是公知的(非專利文獻(xiàn)1)，但在這里還是簡(jiǎn)單地 說(shuō)明其制作過(guò)程。根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)和加州大學(xué)圣克魯茲分校的基因組數(shù)據(jù) 庫(kù)網(wǎng)站及被選擇的DNA的BLAST檢索結(jié)果，選出人基因組的常染色質(zhì)區(qū)域中存在的4523種 BAC/PAC 克隆。制備選擇出來(lái)的BAC DNA和PAC DNA后，用Dpnl、RsaI, HaeIII分別對(duì)其進(jìn)行消 化，然后進(jìn)行與銜接頭合成寡核苷酸的連接。接下來(lái)使用含有銜接頭序列的引物進(jìn)行兩次 PCR0將這個(gè)過(guò)程稱為無(wú)窮盡化，將得到的DNA定義為無(wú)窮盡化DNA。使用噴墨式的點(diǎn)樣儀 (GENESH0T(注冊(cè)商標(biāo))，日本礙子株式會(huì)社，名古屋)將無(wú)窮盡化的DNA在陣列上點(diǎn)樣兩 次，制作出所希望的高密度CGH陣列(MCG全基因組陣列-4500)。(B)人染色體中該區(qū)域的確定(1)2名伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征患者的臨床癥狀本實(shí)施例中，就兩名用于確定與伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征相對(duì)應(yīng)的 人染色體的區(qū)域的樣品提供者[伴有精神發(fā)育遲滯的新先天性異常癥患兒2名(病例1、 2)]的臨床癥狀而言，在可能的范圍內(nèi)公開(kāi)。病例1 (男孩)，出生時(shí)體重觀30克，沒(méi)有分娩時(shí)的假死現(xiàn)象，4歲0個(gè)月時(shí)的診斷 結(jié)果是重度精神發(fā)育遲滯，巨頭癥(+2SD)，外斜視，面容異常。詳細(xì)的情況為頭頸部 顏 面處頭蓋有輕度的巨大頭蓋、額部突出，眼球有重度內(nèi)斜視，鼻部有鼻孔朝前及鞍鼻。在成 長(zhǎng)發(fā)育 神經(jīng)癥狀方面為重度精神發(fā)育遲滯，頭部控制(定頸)為5個(gè)月，坐穩(wěn)為M個(gè)月， 無(wú)行走和語(yǔ)言，作為神經(jīng)癥狀未發(fā)現(xiàn)痙攣發(fā)作。自閉傾向?yàn)橹囟龋【o張低下。病例2 (男孩)出生時(shí)體重M58克，確診存在Atrial septal defect (房間隔缺 損)，VSD (Ventricular septal defect 室間隔缺損)及 PDA (Patent ductus arteriosus 動(dòng)脈導(dǎo)管未閉)的心臟外科領(lǐng)域的疾病。3歲零8個(gè)月的診斷結(jié)果的特征是唇腭裂，聽(tīng)力 障礙(IOOdB)，小眼球癥，短指，特殊面容(濃眉、寬鼻梁、內(nèi)眥贅皮、闊鼻)，小指彎曲，反張 姿勢(shì)。詳細(xì)而言為頭頸部 顏面部為眼距寬，內(nèi)眥贅皮及右眼小眼球，鼻部有鼻梁扁平，鼻 孔朝前及輕微的鞍鼻。口部有唇腭裂，軀干部有外陰部存在隱睪，四肢中手指的小指短小內(nèi) 彎。成長(zhǎng)發(fā)育 神經(jīng)癥狀為重度精神發(fā)育遲滯〔發(fā)育指數(shù)(DQ)為20 30〕，不能坐穩(wěn)。未 發(fā)現(xiàn)作為神經(jīng)癥狀的痙攣發(fā)作。肌緊張低下。(2)使用了 DNA陣列的分析[實(shí)施例1](a)利用基因組無(wú)序陣列的分析結(jié)果基因組無(wú)序陣列是固著有人基因組DNA在先天性異常癥疾病中有缺失或擴(kuò)增的 區(qū)域的基因組DNA (BAC克隆)的基板。應(yīng)用基因組無(wú)序陣列進(jìn)行分析時(shí)，可以檢測(cè)出Williams綜合征、Smith-Magenis 綜合征、唐氏綜合征、Langer-Giedion 綜合征、Wolf-Hirschhorn 綜合征、Miller-Dieker綜合征、Prader Willi and Angelman 綜合征、WAGR 綜合征、Cri du Chat 綜合征、 Pallister-Killian綜合征、Rubinstein-Taybi綜合征、毛發(fā)一鼻一指(趾)綜合征、 Potoki-Shaffer綜合征、神經(jīng)皮膚I綜合征、Sotos綜合征、顱縫早閉綜合征、Kallmann type2綜合征、Kallmann typel綜合征、Van der Woude綜合征、ZFHXl B缺失綜合征、 Blepharoph imosis and印icanthus綜合征、1ρ36綜合征、貓眼綜合征、Alagille綜合 征、Diamond-Blackfan綜合征、先天性腎上腺發(fā)育不全綜合征、類固醇硫酸酶(Steroid sulfatase)綜合征、Digeorge 綜合征、Russell-Silver 綜合征、Duchenne 肌萎縮、 Pelizaeus Merzbacher病、及亞端粒異常疾病等都可以進(jìn)行檢測(cè)。
從病例1和病例2中的2名伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征的患兒中提取 DNA,按照常規(guī)方法進(jìn)行使用了基因組無(wú)序陣列的陣列CGH法的分析，但在該情況下未檢測(cè) 出基因組結(jié)構(gòu)異常。 (b)使用了 MCG全基因組陣列-4500的分析再次從病例1和2的患者的血液制備DNA，根據(jù)下記的要領(lǐng)進(jìn)行分析，該分析是根 據(jù)上述的要領(lǐng)制作的、基于使用了 MCG全基因組陣列-4500的陣列CGH法的與基因組結(jié)構(gòu) 異常有關(guān)的分析。使用 BioPrime DNA 標(biāo)記系統(tǒng)(labeling System)(美國(guó) Invitrogen 公司)，對(duì)病 例1和2的伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征的2名患兒來(lái)源的DNA進(jìn)行Cy3標(biāo)記， 對(duì)健康者來(lái)源的DNA進(jìn)行Cy5標(biāo)記。兩種DNA各50 μ 1，分別向其中加入250 μ 1的Cot-I DNA(美國(guó) hvitrogen 公司)、3M 的 NaOAc (美國(guó) Sigma 公司)；35 μ 1、100 % 乙醇 875 μ 1， 在-80°C下冷卻10分鐘，在4°C下進(jìn)行30分鐘的15000rpm離心分離。另一方面，將MCG全基因組陣列-4500放入沸騰的滅菌水中2分鐘，然后依次 在70%、85(%、100(%的冷乙醇中各浸泡2分鐘進(jìn)行脫水，使其干燥，在421下保溫。在 Hybrimaster HS-300 (Aloka株式會(huì)社，東京)上放置進(jìn)行過(guò)上述處理的MCG全基因組陣 列-4500，滴下預(yù)雜交液(ΜΜ40μ 1、酵母tRNA 6 μ 1,20% SDS 12 μ 1)，在42°C下進(jìn)行10分 鐘的預(yù)雜交。然后滴下溶解有上述DNA的雜交液(MM 80μ1、酵母tRNA 12μ 1,20% SDS Μμ 1)，在42°C下進(jìn)行48 72小時(shí)的雜交反應(yīng)。MM是指MasterMix，即，將甲酰胺5ml、硫 酸葡聚糖lg、20XSSC Iml進(jìn)行混合，加入蒸餾水混至7ml充分溶解得到的溶液。然后，芯片的清洗是使用保溫成50°C的2 X SSC，進(jìn)行1分鐘，進(jìn)而相同條件下進(jìn)行 10分鐘，使用保溫成50°C的50%甲酰胺/2XSSC(PH 7.0)進(jìn)行10分鐘，使用保溫成42°C 的IX SSC進(jìn)行10分鐘。然后充分干燥，應(yīng)用GenePix4000B (美國(guó)Amersham Biosciences 公司)，對(duì)微陣列用532nm激光掃描Cy3熒光，用635nm激光掃描Cy5熒光。因?yàn)镃y3熒光 和Cy5熒光的能量有很大不同，所以用Cy3和Cy5對(duì)從所有點(diǎn)得到的數(shù)值進(jìn)行校正使得為 相同的值，接著求出各點(diǎn)的Cy3/Cy5的值(ratio)。對(duì)該值進(jìn)行l(wèi)og變換而求出L0& (比)， 將此值作為縱軸，橫軸表示人10號(hào)染色體(Chromosome 10)的位置，用以Mb為單位的數(shù)值 表示(圖2 縱軸表示LO& (ratio)的數(shù)值，橫軸表示從10號(hào)染色體的短臂的前端到長(zhǎng)臂的 末端的約144Mb中的位置)。需要說(shuō)明的是，圖2是由圖2A(與病例1有關(guān))與圖2B(與病 例2有關(guān))構(gòu)成的。其結(jié)果，就病例1的患者而言，在10號(hào)染色體中的10q24. 32_q25. 1檢測(cè)出2. 1Mb 的半合子缺失，就病例2的患者而言，在10q24. 31-q25. 1區(qū)域最小檢測(cè)出3. 2Mb的半合子
10缺失。這些缺失區(qū)域得到確認(rèn)的BAC DNA在前者為RP11-551E2、RP11-416N2、RP11-18I14、 RP11-30H12、 RP11-16H23、 RP11-80B2、 RP11-99N20、 RP11-541N10、 RP11-302K17、 RP11-89G15、RP11-68M5，在后者為 RP11-107I14、RP11-108L7、RP11-91A6、RP11-37L21、 RP11-68M5、RP11-21N23、RP11-551E2、RP11-416N2、RP11-18I14、RP11-30H12、RP11-16H23、 RP11-80B2、 RP11-541N10、 RP11-302K17、 RP11-89G15、 RP11-68M5、 RP11-105N15、 RP11-302K17、RP11-551E2、RP11-416N2、RP11-18I14、RP11-30H12。如果將病例 1 和病例 2 加以比較，RP11-551E2、RP11-416N2、RP11-18I14、RP11-30H12、RP11-16H23、RP11-80B2、 RP11-541N10, RP11-302K17、RP11-89G15、RP11-21N23、RP11-99N20 的 BAC DNA 是兩者共同 存在的區(qū)域。圖3示出病例1和病例2中找出的半合子缺失區(qū)域的圖譜圖。根據(jù)上述實(shí)施例1，明確了伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征可以根據(jù) 10q24. 32-q25. 1的半合子缺失來(lái)進(jìn)行辨別。另外，至少明確了通過(guò)應(yīng)用MCG全基因組陣 列-4500進(jìn)行檢測(cè)，可以辨別伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征。根據(jù)這些結(jié)果，明確了利用可以檢測(cè)出10q24. 32_q25. 1中的半合子缺失的方法， 由此可以進(jìn)行本發(fā)明的檢測(cè)方法。這表明在例如DNA芯片法、DNA印跡法、RNA印跡法、實(shí) 時(shí)RT-PCR法、FISH法、或CGH等已知的基因分析方法中，可以按照以該基因缺失變異為檢 測(cè)靶的常規(guī)方法，檢測(cè)出10q24. 32-q25. 1中的半合子缺失，進(jìn)行伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā) 性畸形綜合征的辨別。以下示出基于使用了 MCG全基因組陣列-4500以外的基因檢測(cè)基板的CGH方法的 分析(實(shí)施例2)與基于FISH法的分析(實(shí)施例3)的示例，但是本發(fā)明的范圍不被這些方 法限定。即，本發(fā)明只要檢測(cè)靈敏度可以確定上述基因的缺失變異，例如可以利用基于樣品 的基因與相當(dāng)于10q24. 32-q25. 1的核酸(寡核苷酸、cDNA、BAC DNA、PAC DNA、或YACDNA 等)的雜交而產(chǎn)生的信號(hào)的檢測(cè)方法(DNA芯片法、DNA印跡法、RNA印跡法、實(shí)時(shí)RT-PCR 法、FISH法、或CGH法等)、或者G鑒別染色法等染色體檢查等的雜交以外的現(xiàn)象為檢測(cè)原 理的方法，廣泛進(jìn)行。[實(shí)施例2]利用Agilent244K微陣列(oligoarray)(美國(guó)Agilent公司)的分 析使用從病例1和病例2的患者制備的DNA(各0. 2 μ g)，利用基于Agilent公司 的oligo aCGH微陣列M4k type的CGH法進(jìn)行分析。M4k type的陣列被覆人基因組的 236000以上的編碼區(qū)域及非編碼區(qū)域，可以進(jìn)行人基因組的無(wú)遺漏分析。探針的平均分辨 率為6. 4Kb。分析的概要如下所述按照Agilent公司的協(xié)議來(lái)進(jìn)行。病例1和病例2的患者及健康者來(lái)源的DNA各2. 0 μ g，分別用2種限制酶(AluI 和RsaI)加以消化，利用使用了 Exo-Klenow片段的切口平移(nick translation)法，健康 者來(lái)源的DNA使用熒光色素Cy5進(jìn)行了標(biāo)記，患者來(lái)源的DNA使用熒光色素Cy3進(jìn)行了標(biāo) 記。使用Microcon YM-30過(guò)濾單元(filter unit) (MiIlipore公司)對(duì)標(biāo)記過(guò)的DNA進(jìn) 行純化。將Cy 3 及 Cy 5 標(biāo)記過(guò)的 DNA 158 μ 1，1. Omg/ml 的人 Cotl DNA 50 μ 1，IOX 封 阻劑(Blocking Agent) 52 μ 1,2X 雜交緩沖液(Hybridization buffer) 260 μ 1 加熱至 95°C后，冷卻到37°C。將該溶液490 μ 1載置于固定有Agilent M4K寡核苷酸陣列的墊波 片(gasket slide)上，用配件進(jìn)行固定，在65°C下進(jìn)行40小時(shí)的雜交。陣列的清洗是室溫的Buffer 1液中邊攪拌邊進(jìn)行5分鐘清洗，然后在保持為37°C的Buffer 2液中邊攪拌 邊進(jìn)行1分鐘清洗。將該芯片充分干燥，應(yīng)用GenePix4000B(美國(guó)Amersham Biosciences 公司)，對(duì)微陣列用532nm激光掃描Cy3熒光，用635nm激光掃描Cy5熒光。因?yàn)镃y3熒 光和Cy5熒光的能量有很大不同，用Cy3和Cy5對(duì)從全部點(diǎn)得到的數(shù)值進(jìn)行校正，使得為 相同的值，接著求出各點(diǎn)的Cy3/Cy5的值(ratio)以及(ratio)，將其結(jié)果示于圖4， 縱軸示出"-Log2 (ratio) ”的數(shù)值，橫軸示出病例1中從10號(hào)染色體的102. 3Mb (Mb 兆堿 基(megabase)的簡(jiǎn)稱；具體為 102，368，279base)到 106. 9Mb (具體為 106，961，455base) 的4. 59Mb (具體4，593，176base)的染色體的位置。病例2中橫軸示出從10號(hào)染色體 的98. 6Mb (Mb 兆堿基(megabase)的簡(jiǎn)稱；具體為98，668，22lbase)到IlOMb (具體為 110, 576, 455base)的11. 9Mb (具體11，908，234kise)的染色體的位置。而且圖4左側(cè)示出 10號(hào)染色體短臂與長(zhǎng)臂的圖和用AgilentM4K微陣列分析后的10號(hào)染色體全部的CGH分 析的圖?；疑木€及虛線表示其右側(cè)記載的基因在10號(hào)染色體上的位置。需要說(shuō)明的是， 圖4是由圖4A(與病例1有關(guān))與圖4B(與病例2有關(guān))構(gòu)成。得到的結(jié)果與實(shí)施例1 (b)的結(jié)果一樣，可以詳細(xì)評(píng)價(jià)缺失的大小。對(duì)于病例1的 患者，在10號(hào)染色體的10q24. 32-q25. 1檢測(cè)出半合子缺失，缺失的大小是2. 1Mb。對(duì)于病 例2的患者，在10q24. 31-q25. 1檢測(cè)出半合子缺失，缺失的大小為3. 3Mb。圖5示出病例1 與病例2中被檢測(cè)出來(lái)的半合子缺失區(qū)域的圖譜。[實(shí)施例3]基于FISH法的分析使用FISH法確認(rèn)了伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征的患者染色體中有 10q24.31-10q25. 1區(qū)域的半合子缺失。首先，用兩名該患者的血液制備淋巴細(xì)胞，制作了中 期染色體。即，將人淋巴細(xì)胞與12. Syg/ml植物凝集素(Phytohemagglutinin) —起培養(yǎng) 3天，進(jìn)而添加0. 025 μ g/ml秋水仙酰胺培養(yǎng)數(shù)小時(shí)之后，除去上清，加入0. 075M KCl低張 液，靜置30分鐘。接著除去上清，然后用卡諾液進(jìn)行固定，在載波片上展開(kāi)染色體，制備中 期染色體。應(yīng)用切口平移試劑盒(nick translation kit)，使含有半合子缺失區(qū)域 (10q24. 33)的BAC DNA(RP11_416N2)在16°C下過(guò)夜反應(yīng)，攝入地高辛-11-dUTP。同樣地， 作為對(duì)照使含有患者染色體中沒(méi)有缺失的10q21. 2區(qū)域的BAC DNA(RP11_357A18)進(jìn)行同 樣的反應(yīng)，攝入生物素-16-dUTP。然后將兩種標(biāo)記的BAC DNA在75°C下加熱10分鐘，冰冷 后，在中期染色體上，在37°C下過(guò)夜雜交。使用50%甲酰胺/2x 35(( !17.0)，在371下將 沒(méi)有雜交上的標(biāo)記BAC DNA清洗15分鐘，接著使用h SSC室溫下清洗15分鐘，然后使用 IxSSC室溫下清洗15分鐘。然后，為了進(jìn)行熒光標(biāo)記，添加0. 02mg/ml抗生物素蛋白-FITC 及1. 2 μ g/ml抗-地高辛-羅丹明，在中期染色體上37°C下使其反應(yīng)1小時(shí)。接著，使用 4x SSC室溫下清洗10分鐘，然后使用含有0.05% Triton-X-100的乜SSC，室溫下清洗10 分鐘，使用4x SSC室溫下清洗10分鐘。中期玻片在通過(guò)離心分離進(jìn)行了干燥后，加入一滴 125ng/ml 4’，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，蓋上蓋波片，進(jìn)行顯微鏡觀察，進(jìn)行顯微鏡相 片的攝影。其結(jié)果，對(duì)照組的RP11-357A18的BAC DNA有2例均進(jìn)行10號(hào)染色體長(zhǎng)臂的2 條染色體的綠色熒光染色，含有缺失區(qū)域的10q24. 33的RP11-416N2 BACDNA中僅僅10號(hào) 染色體長(zhǎng)臂的一條染色體被紅色熒光染色(圖6)。這種結(jié)果表示病例1和病例2的患者的 10q24. 33區(qū)域存在半合子缺失。
工業(yè)上的可利用性對(duì)于2例伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征，發(fā)現(xiàn)染色體的相同區(qū)域 (10q24-10q25)的半合子缺失是原因。其結(jié)果，可以通過(guò)檢查染色體的10q24_10q25區(qū)域有 無(wú)異常來(lái)確定診斷伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征。
權(quán)利要求
1.一種染色體缺失的檢測(cè)方法，其中，是通過(guò)對(duì)人染色體的10q24. 31-10q25. 1區(qū)域的半合子缺失進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)辨別伴有精 神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色體缺失的檢測(cè)方法，其中，人染色體的10q24. 31-10q25. 1區(qū)域的半合子缺失的檢測(cè)，是利用含有該 10q24. 31-10q25. 1區(qū)域的一部分的核酸與樣品核酸的雜交來(lái)檢測(cè)因該10q24. 31_10q25. 1 區(qū)域的半合子缺失而產(chǎn)生的信號(hào)，由此來(lái)進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的染色體缺失的檢測(cè)方法，其中，含有人染色體的10q24. 31-10q25. 1區(qū)域的一部分的核酸與樣品核酸的雜交，在固著 了含有該10q24. 31-10q25. 1區(qū)域的一部分的核酸的基板上進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的染色體缺失的檢測(cè)方法，其中，含有人染色體的10q24. 31_10q25. 1區(qū)域的一部分的核酸，是寡核苷酸、cDNA、BAC DNA、 PAC DNA^YAC DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的染色體缺失的檢測(cè)方法，其中，含有人染色體的10q24. 31_10q25. 1區(qū)域的一部分的核酸，是寡核苷酸、cDNA、BAC DNA、 PAC DNA^YAC DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色體缺失的檢測(cè)方法，其中，對(duì)含有人染色體10q24. 31-10q25. 1區(qū)域的一部分或者全部的核酸的檢測(cè)，是通過(guò)DNA 芯片法、DNA印跡法、RNA印跡法、實(shí)時(shí)RT-PCR法、FISH法、或CGH法進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于，針對(duì)伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征，分析人染色體有無(wú)擴(kuò)增或者缺失，明確其原因，從而提供該疾病的辨別方法。本發(fā)明通過(guò)對(duì)人染色體的10q24.31-10q25.1區(qū)域的半合子缺失進(jìn)行檢測(cè)，辨別伴有精神發(fā)育遲滯的多發(fā)性畸形綜合征，優(yōu)選通過(guò)檢測(cè)因含有10q24.31-10q25.1區(qū)域的一部分的核酸與樣品核酸的雜交而基于該染色體區(qū)域的半合子缺失而產(chǎn)生的信號(hào)，來(lái)進(jìn)行。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102112628SQ20098013022
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者井本逸勢(shì), 會(huì)津善紀(jì), 林深, 稻澤讓治 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人東京醫(yī)科齒科大學(xué), 富士膠片株式會(huì)社