專利名稱：促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶的組合物和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因操作領(lǐng)域，尤其涉及植物中基因活性和發(fā)育的調(diào)節(jié)。
背景技術(shù)：
在復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制中，促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)整合各種第二信使所傳導(dǎo)的多種細胞內(nèi)信號。MAPKs能使多種酶和轉(zhuǎn)錄因 子磷酸化并調(diào)節(jié)其活性。MAPKs活性由一連串級聯(lián)反應(yīng)觸發(fā)，所述級聯(lián)反應(yīng)通過MAH(激酶 (MAPKK)導(dǎo)致MAPK的蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化。MAPKK由MAPKKK激活，所述MAPKKK通過 其絲氨酸/蘇氨酸磷酸化而變得有活性。MAPK磷酸化級聯(lián)在真核生物中高度保守。確實，已在酵母、果蠅、哺乳動物細胞和 植物中鑒定了同源物。到2002年為止，僅在擬南芥(Arabidopsis)中就鑒定出超過60種 MAPKKK 基因(Ichimura，et al.，(2002) Trends plant Sci 7:301-308)。由于上述級聯(lián)中 涉及大量蛋白，因此，不明確哪種蛋白是必不可少的、如果缺失會造成致命性或在功能上是 多余的。MAPKKKs和其靶標參與真核生物的生長和發(fā)育。例如，在植物中，MAPKKK級聯(lián)與胚 芽發(fā)育、細胞分裂、疾病防御應(yīng)答和非生物脅迫應(yīng)答有關(guān)(Tena，et al. , (2001)Curr Opin Plant Biol 4 :392-400.)。最近發(fā)現(xiàn)，MAPKKK基因中稱為YODA (YDA)的功能突變?nèi)笔Мa(chǎn)生缺失胚柄的擬南芥 (Arabidopsis)植物胚胎，胚柄即為，功能是從胚乳向生長的胚胎提供營養(yǎng)的組織。并不是 所有的yda植物都能發(fā)育成成熟植物，并且那些發(fā)育成成熟植物的yda植物表現(xiàn)出根發(fā)育 延遲并且比野生型植物要小。已知的植物激素不能營救yda表型，這提示新的發(fā)育信號通 路(Lukowitz, et al.，(2004)Sci. STKE 2004 tw21)。在擬南芥ANP家族中，已經(jīng)鑒定出數(shù)種MAPKKKs，并且其與調(diào)節(jié)細胞分裂有關(guān)聯(lián)。 (Krysan, et al.，(2002)plant cell 14:1109-1120)。在本氏煙(N. benthamiana)葉子中 也鑒定出MAPKKK，并且發(fā)現(xiàn)其在抵御丁香假單胞桿菌(Pseudomonas syringae)的過敏反 應(yīng)和抗性中發(fā)揮作用(Pozo，et al.，(2004) The EMBO Journal 23 :3072-3082)。發(fā)現(xiàn)同樣 的MAPKKK在經(jīng)歷丁香假單胞桿菌感染的易感葉子中調(diào)節(jié)細胞死亡(Pozo，et al. , (2004) The EMBO Journal 23 :3072-3082)。發(fā)現(xiàn)表達不同水平的TcAacco NPKl的組成型活性擬南芥直系同源物的轉(zhuǎn)基因 煙草植株，在鹽水平升高、低溫和熱休克存在的情況下，比野生型植物生長得更旺盛，但 是在正常的生長條件下，所述轉(zhuǎn)基因煙草在表型上與野生型植物并無不同(美國專利第 6，613，959號)。操縱這個氧化脅迫信號調(diào)節(jié)劑能保護植物免受各種環(huán)境脅迫，例如熱和高 鹽。參見美國專利第 6，613，959 號(Kovtun, et al.，(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA97 2940-2945)。因此，MAPKKKs參與植物生長和發(fā)育的很多方面。鑒于MAPKKK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)成 員，尤其是MAPKKK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在調(diào)節(jié)范圍從細胞增殖和分化到細胞凋亡的植物細胞進 程中的重要作用，需要鑒定出植物MAPKKK多核苷酸和多肽以及用來調(diào)節(jié)各種應(yīng)答和發(fā)育的這些分子的調(diào)節(jié)劑。由于這些和其他的原因，需要本發(fā)明。發(fā)明概述通常，本發(fā)明的目的是，提供與MAPKKK有關(guān)的多核苷酸和多肽。本發(fā)明的目的是， 提供包含本發(fā)明的多核苷酸和多肽的轉(zhuǎn)基因植物。此外，本發(fā)明的目的是，提供在植物細胞 或轉(zhuǎn)基因植物中，調(diào)節(jié)本發(fā)明的多核苷酸和多肽表達的方法。本發(fā)明的另一個目的是，提供 增強植物非生物脅迫抗性和耐受性的方法。因此，一方面，本發(fā)明涉及分離的MAPKKK多核苷酸，其編碼SEQ ID N0:2、5、8或10 的多肽；具有SEQ ID NO :1、4、7或9的序列的多核苷酸序列；長度為至少有30個核苷酸的 多核苷酸，其在嚴緊條件下可與任一前述多核苷酸雜交。另一方面，本發(fā)明包括與SEQ ID NO為1、4、7或9具有至少60%的序列同一性的多核苷酸。還包括用基于本發(fā)明序列的引 物從核酸文庫擴增的分離的多核苷酸，所述引物為，例如，如SEQ ID NOS 12和13分別所示 的ZmNPKlb-正向引物和ZmNPKlb-反向引物。一方面，核酸文庫是玉米(Zea mays (玉米)) 文庫。另一方面，核酸文庫是cDNA文庫。在本文中，本發(fā)明另一方面提供了分離的多核苷 酸，所述多核苷酸由于遺傳密碼對于任何本發(fā)明的MAPKKK是簡并的。另一方面，分離的核 苷酸和本發(fā)明的任一 MAPKKKs的多核苷酸是互補的。另一方面，本發(fā)明涉及編碼MAPKKK多 肽的分離的多核苷酸，所述MAPKKK多肽賦予對脫水、鹽度、溫度脅迫、環(huán)境脅迫或病原體的 抗性和耐受性。另一方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物，包括重組表達盒在內(nèi)，其包含可操作地連接于 本發(fā)明任何分離的多核苷酸的植物啟動子。本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。另 一方面，本發(fā)明涉及用重組表達盒轉(zhuǎn)染的宿主細胞，所述重組表達盒包括可操作地連接于 本發(fā)明任何分離的多核苷酸的植物啟動子。一方面，宿主細胞是大豆、水稻或玉米細胞。另一方面，本發(fā)明涉及分離的多肽，所述分離的多肽具有與SEQ ID NO 2、5、8或10 所示的氨基酸序列有至少70%的序列同一性的氨基酸序列，并具有MAPKKK活性。另一方 面，本發(fā)明涉及包含重組表達盒的轉(zhuǎn)基因植物，所述重組表達盒包含可操作地連接于分離 的多核苷酸的植物啟動子，所述分離的多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有與SEQ ID NO 2、 5、8或10所示的氨基酸序列有至少70 %的序列同一性的氨基酸序列，并具有MAPKKK活性。 本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。另一方面，本發(fā)明涉及用重組表達盒轉(zhuǎn)染的宿 主細胞，所述重組表達盒包含可操作地連接于任何編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸的植 物啟動子。另一方面，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)植物細胞中MAPKKK蛋白水平的方法。一方面，所述方 法包括用可操作地連接于啟動子的MAPKKK多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細胞。所述多核苷酸可以位 于有義或反義方向上。所述方法還包括表達所述多核苷酸達足夠調(diào)節(jié)植物細胞內(nèi)MAPKKK 蛋白的時間量。另一方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)植物中MAPKKK蛋白水平的方法。所述方法包括用 MAPKKK多核苷酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細胞，所述MAPKKK多核苷酸，在有義或反義方向上，可操 作地連接于在植物細胞中有功能的啟動子。所述方法包括將轉(zhuǎn)化的植物細胞再生為轉(zhuǎn)化的 植物，所述轉(zhuǎn)化的植物表達的MAPKKK多核苷酸的量足以調(diào)節(jié)植物中的MAPKKK蛋白水平。另一方面，本發(fā)明涉及增強植物非生物脅迫抗性或耐受性的方法。一方面，所述方 法包括將包含編碼本發(fā)明MAPKKK的多核苷酸的構(gòu)建體引入植物細胞。所述多核苷酸可以可操作地連接于在植物細胞有功能的啟動子，以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細胞。將所述轉(zhuǎn)化的植 物細胞再生成轉(zhuǎn)化的植物。以足以誘導(dǎo)非生物脅迫抗性和耐受性的水平，在轉(zhuǎn)基因植物的 至少一些細胞中表達MAPKKK。一方面，非生物脅迫是干旱、低溫、鹽、滲透脅迫、霜凍或冰凍、 高溫、氧化脅迫或化學(xué)脅迫。所述方法可以提供對其他環(huán)境脅迫，例如，UV-B、臭氧、光致氧 化、除草劑、病原體，或也涉及氧化脅迫損傷的其他脅迫等的耐受性。根據(jù)下面的描述，本發(fā)明的其他目的、特征、優(yōu)勢和方面對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言會 變得明顯。然而，應(yīng)當理解，下面的描述和具體實施例，盡管表明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但 是，僅以舉例而給出。由閱讀下面的描述和本發(fā)明公開內(nèi)容的其他方面，本公開的發(fā)明實質(zhì) 和范圍內(nèi)的各種改變和修改會毫無困難地變得對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的。附圖簡要說明從下述詳細描述和附圖更全面的了解本發(fā)明并且序列表形成本申請的一部分。

圖1.寒冷脅迫下，B73和CML349間脅迫誘導(dǎo)的ZmNPKlb基因表達的差異。圖2. MAPKKK的CLUSTAL X(l. 83)多重序列比對。針對水稻序列，OsNPKl樣蛋白 即 NP_917084(SEQ ID NO :14)、NP_917080 (SEQ ID NO :15)和 BAF24980 (SEQ ID NO :16)， 以及擬南芥 ANPl 序歹Ij 022040 (SEQ ID NO :17)，比對 ZmNPKla (SEQ ID NO :2)，ZmNPKlb (SEQ ID NO 5)和 ZmNPKld(SEQ ID NO :10)。將部分蛋白即 ZmNPKlc (SEQ ID NO :8)，排除在比對 外。優(yōu)選用星號標記保守殘基，其主要位于該蛋白的N端半部分。圖3.基于其氨基酸序列，從玉米、水稻和擬南芥NPKl樣序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹。用多 重比對工具CLUSTAL，構(gòu)建系統(tǒng)樹圖。序列的簡單描述如下文表1所示，本申請?zhí)峁┝?MAPKKK序列的詳情。表 權(quán)利要求
1.分離的促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)多核苷酸選自(a)編碼SEQID NO :2、5、8或10的多肽的多核苷酸；(b)包含SEQID NO :1、4、7或9所示序列的多核苷酸；(c)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽與SEQID N0:2、5、8或10的全長具有至少95%的 序列同一性，其中％序列同一性由默認參數(shù)下的GAP Version 10確定；(d)由于遺傳密碼，由任何(a)至(c)分離的簡并的多核苷酸；以及(e)與(a)至(d)中任一的全長多核苷酸互補的多核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其編碼MAPKKK多肽，所述MAPKKK多肽賦予對 低溫、霜凍、冰凍、鹽、滲透脅迫、干旱、高溫、化學(xué)脅迫、環(huán)境脅迫或涉及氧化脅迫損傷的其 他脅迫的耐受性。
3.載體，包含至少一個權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
4.表達盒，包含至少一個可操作地連接于啟動子的權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中 所述多核苷酸位于有義或反義方向上。
5.宿主細胞，其被引入至少一個權(quán)利要求4所述的表達盒。
6.如權(quán)利要求5所述的宿主細胞，其是植物細胞。
7.轉(zhuǎn)基因植物，包含至少一個權(quán)利要求4所述的表達盒。
8.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、加 拿大油菜(canola)、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥和小米。
9.權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。
10.具有MAPKKK活性的分離的多肽，選自(a)包含SEQID NO :2、5、8或10中任一的分離的多肽；(b)與SEQID NO :2、5、8或10的氨基酸序列至少95%相同的多肽；(c)由包含核苷酸序列的核酸分子編碼的多肽，所述核苷酸序列與SEQID NO 1,4,7 或9的全長至少95%相同；(d)包含任何SEQID NO :2、5、8或10的至少200個連續(xù)氨基酸的片段。
11.重組表達盒，包含可操作地連接于啟動子的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼權(quán)利 要求10所述的多肽。
12.轉(zhuǎn)化的宿主細胞，包含權(quán)利要求10所述的分離的多肽。
13.如權(quán)利要求12所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是轉(zhuǎn)化的植物細胞。
14.如權(quán)利要求13所述的植物細胞，其中所述植物細胞選自高粱、玉米、水稻、小麥、大 豆、向日葵、加拿大油菜、苜蓿、大麥和小米。
15.由權(quán)利要求13所述的植物細胞再生的轉(zhuǎn)化的植物。
16.權(quán)利要求15所述植物的轉(zhuǎn)化的種子。
17.增強植物非生物脅迫耐受性的方法，所述方法包括下述步驟(a)將包含編碼促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)的多核苷酸的構(gòu)建體引入 植物細胞，其中所述多核苷酸可操作地連接于在植物細胞中有功能的啟動子，且其中所述 多核苷酸選自(1)編碼SEQID NO :2、5、8或10的多肽的多核苷酸；(2)包含SEQID NO :1、4、7或9所示序列的多核苷酸；(3)與SEQID NO :1、4、7或9具有至少90%序列同一性的多核苷酸，其中％序列同一 性基于全編碼區(qū)，并由默認參數(shù)下的GAP VersionlO確定；(4)由于遺傳密碼，由任何(1)至(3)分離的簡并的多核苷酸；以及(5)與(1)至中任一的多核苷酸互補的多核苷酸；(b)從所述轉(zhuǎn)化的植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中，相對于對照，以足以增強所述轉(zhuǎn) 基因植物的非生物脅迫耐受性的水平，在所述轉(zhuǎn)基因植物的至少一些細胞中表達所述 MAPKKK0
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述非生物脅迫包括低溫、霜凍、冰凍、鹽、滲透脅 迫、干旱、高溫、化學(xué)脅迫、環(huán)境脅迫或涉及氧化脅迫損傷的其他脅迫。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述MAPKKK蛋白激活或增加脅迫誘導(dǎo)基因的表達。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述脅迫誘導(dǎo)基因包括ZmMAP激酶4(MPK4)或 ZmMAP 激酶 5 (MPK5)。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述脅迫誘導(dǎo)基因可操作地連接于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn) 移酶啟動子、ASI啟動子或熱休克啟動子。
22.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述編碼MAPKKK的多核苷酸為組成型表達的。
23.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述編碼MAPKKK的多核苷酸為誘導(dǎo)表達的。
24.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述編碼MAPKKK的多核苷酸以細胞特異性、組織 特異性或器官特異性的方式表達。
25.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
26.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。
全文摘要
提供了在不同的環(huán)境條件下，調(diào)節(jié)植物應(yīng)答、發(fā)育和產(chǎn)量的方法和組合物。提供了利用MAPKKK的方法。MAPKKK序列用于多種方法中，包括調(diào)節(jié)根發(fā)育、調(diào)節(jié)葉和/或枝條發(fā)育、調(diào)節(jié)非生物脅迫下的耐受性和調(diào)節(jié)產(chǎn)量。還提供了轉(zhuǎn)化的植物、植物細胞、組織、種子和表達載體。
文檔編號C12N15/54GK102112614SQ200980129945
公開日2011年6月29日 申請日期2009年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月10日
發(fā)明者卡爾利·雷曼, 安娜·立茲尼克, 索巴·希瓦薩恩卡爾 申請人:先鋒國際良種公司