專利名稱：泛激酶活化與信號(hào)通路的評(píng)估的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的一些實(shí)施方式涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中信號(hào)蛋白激活狀態(tài)的測定方法。在至 少一些實(shí)施方式中，提供了監(jiān)測患者體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑效率的方法。本發(fā)明更進(jìn)一步地 提供了高靈敏度的測試方法，該方法可用于難以獲得大量細(xì)胞樣品的患者群體，例如新生 兒等。本發(fā)明的一些實(shí)施方式涉及識(shí)別新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白抑制劑的方法。本發(fā)明的一 些實(shí)施方式涉及檢測患者樣本中膿毒癥的方法。還提供了實(shí)踐本發(fā)明方法的試劑盒。許多疾病具有細(xì)胞信號(hào)途徑被破壞而導(dǎo)致包括癌細(xì)胞不受控制地生長和增殖以 及異常發(fā)炎過程等病變的特征。此類缺損可以包括脂類激酶(參與催化磷酸基團(tuán)向脂質(zhì)轉(zhuǎn) 移的一類酶)的活性變化。這些磷酸化的脂質(zhì)依次募集下游蛋白質(zhì)，從而把上游信號(hào)介質(zhì) 例如受體酪氨酸激酶和抗原受體等產(chǎn)生的信號(hào)放大。例如，蛋白激酶Akt由磷脂募集至質(zhì) 膜并被激活。一旦被激活，Akt就在正常組織和癌變組織的存活中起到關(guān)鍵的作用。磷脂酰肌醇3-激酶(PUKs)是一類在很多細(xì)胞表面受體的下游信號(hào)通路中起著 關(guān)鍵作用的脂類激酶家族，控制著生長、增殖以及細(xì)胞存活?；钚缘腜DKs由兩個(gè)亞單位組 成，一個(gè)分子量為85或者55kD的調(diào)節(jié)亞單位(p85或，和一個(gè)分子量為1 IOkD的催化亞 單位(PllO)。調(diào)節(jié)亞單位一方面對(duì)于PII的功能很關(guān)鍵，此外這些調(diào)節(jié)亞單位也能獨(dú)立于 ΡΙ3Κ進(jìn)行信號(hào)傳遞(Ueki et al. ,J Biol. Chem. November 28 ；278 (48) :48453-66 (2003)) 最近的研究證明，ρ85-α能通過可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子NFAT3不依賴PII信號(hào)通路來誘導(dǎo)細(xì) 胞程序死亡(Song et al.，Mol. Cell. Biol. 27 :2713-2731 (2007))。包括糖尿病、心力衰竭和包括結(jié)直腸癌、急性骨髓性白血病、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤 和卵巢癌等很多癌癥在內(nèi)的多種人類疾病中都有PII涉及其中(參見Kim et al. ,Curr. Opin. Investig. Drugs. December ；6 (12) :1250-8(2005)等)。PI3K 抑制劑作為用于包括癌 癥、心力衰竭和自身免疫/炎癥等疾病在內(nèi)的潛在治療劑的研究正在進(jìn)行中。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑同樣涉及細(xì)胞增殖和分化。這個(gè) 路徑在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的調(diào)節(jié)中起作用(Moriguchi et al. , Adv. Pharmacol. 36 121-137(1996) ；Murakami et al. , Methods in Enzymology 283 :584-600(Dunphy, ed., 1997) ；Matten et al. , Seminars in Dev. Biol. 5 :173-181(1994))。在細(xì)胞生長、存活和分化的調(diào)節(jié)中同樣涉及MAPK路徑(Lewis et al.，同前)。此 外，激活的MAPK和/或MAPK表達(dá)水平的提高已在多種人類腫瘤中檢測到((Hoshino，R. et al.，Oncogene 18 :813-822(1999) ；SaIh, B. et al.，Anticancer Res. 19 :741-48(1999)； Sivaraman, V. S. et al. , J. Clin. Invest. 99 :1478-483(1997) ；Mandel 1, J. W et al., Am. J. Pathol. 153 :1411-23 (1998) ；Licato, L.L. et al.Digestive Diseases and Sciences 43，1454-1464 (1998))，并且可能與腫瘤細(xì)胞的侵入、轉(zhuǎn)移和血管生成活性有關(guān) 聯(lián)。因此MAH(途徑不合宜的活化是多種腫瘤普遍的基本特征。因該原因，這一信號(hào)通路的 參與者，例如MEK等，成為癌癥療法的潛在靶標(biāo)。已有幾個(gè)團(tuán)隊(duì)開發(fā)了用于監(jiān)控各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑的測試方法。一個(gè)測試 方法是用外周血小板來檢測PII > Akt通路的抑制劑活性(Bowers et al. MoL, CancerTher. 6 :2600-2607(2007)).然而，這一方法僅測量抑制對(duì)這一通路的影響(抑制血小板活 化)，而并不直接監(jiān)控目標(biāo)信號(hào)蛋白的磷酸化(活化)。此外，技術(shù)性困難也使得用外周血 小板對(duì)這一通路的測定具有挑戰(zhàn)性。類似的，West等人(J. Trauma Injury, Inf. and Crit Care 62:805-811(2008)) 報(bào)道了一個(gè)基于流式細(xì)胞術(shù)的測試方法來檢測膿毒病，其利用外周血單核白細(xì)胞活化的缺 失(由p38和ERK的磷酸化測得)、繼之以體外暴露于脂多糖(lipopolysacharide, LPS)。 然而，這個(gè)測試方法并未確認(rèn)特異性，也未記載ERK的早期活化或者所有三個(gè)MAPK通路的 二次活化。作為一個(gè)臨床相關(guān)測試，該方法還易受高到無法接受的用于臨床相關(guān)測試的高 背景水平的影響。例如，作者由其結(jié)果做出結(jié)論，正常對(duì)照組中表達(dá)磷酸-ERK (P-ERK)的單 核細(xì)胞百分比從沒有LPS刺激的35%增加到LPS體外處理后的58%以上(添加LPS 15分 鐘后測得)。相比之下，推定的膿毒癥患者顯示在添加LPS前有25%的P-ERK單核細(xì)胞，而 LPS體外加樣后提高了不到10%。

發(fā)明內(nèi)容
本領(lǐng)域需要一種能準(zhǔn)確監(jiān)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑在患者體內(nèi)功效的測試方法。也需要 有檢測并監(jiān)控一些與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑信號(hào)蛋白的異?；罨嘘P(guān)的疾病或紊亂的方法?，F(xiàn)有的 測試方法依靠免疫印跡法技術(shù)，該技術(shù)無法從混合細(xì)胞群體中識(shí)別產(chǎn)生反應(yīng)的實(shí)際的細(xì)胞 類型。同樣，由于必須從樣品中除去藥物，這些測試方法不但繁瑣而且靈敏度低。靈敏的測 試方法對(duì)于那些難以由其體內(nèi)內(nèi)獲得大量樣品的患者(例如新生兒)來講，尤為需要。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于測定在含有白細(xì)胞的樣品(即血 液樣品)中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑信號(hào)蛋白的激活程度的方法，包括a)將樣品暴露于泛激酶 (pan-kinase)激活劑，以使樣品中白細(xì)胞的至少一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的可激活蛋白被激活； b)用一種保存劑保存樣品；c)將樣品中被保存的白細(xì)胞的胞內(nèi)表位解掩蔽；d)使保存的白 細(xì)胞中解掩蔽的胞內(nèi)表位與多個(gè)經(jīng)熒光標(biāo)記的捕捉分子接觸，所述多個(gè)捕捉分子包括至少 兩種不同的能結(jié)合至樣品中被保存的已激活的白細(xì)胞的至少兩個(gè)不同的解掩蔽的胞內(nèi)表 位的激活態(tài)的捕捉分子、和至少一種對(duì)照捕捉分子，其中對(duì)照捕捉分子可結(jié)合至在保存的 未被泛激酶激活劑激活(即沒有激活)的白細(xì)胞上的表位；e)檢測由于捕捉分子結(jié)合至激 活態(tài)的解掩蔽的胞內(nèi)表位而捕捉到的被保存的活化白細(xì)胞的熒光性；f)檢測由于對(duì)照捕 捉分子結(jié)合而捕捉的被保存白細(xì)胞的熒光性；以及g)比較由捕捉分子捕捉的被保存的被 活化白細(xì)胞所檢測到的熒光性和由捕捉分子捕捉的被保存白細(xì)胞所檢測到的熒光性。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包含評(píng)估步驟g)所測得的熒光性比較和未 活化的參比樣品中所測得的熒光性比較。在其它實(shí)施方式中，所述方法中樣品取自于患者，在激活與未激活的樣品的熒光 性大致相當(dāng)時(shí)，熒光評(píng)估可以指示該患者有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)疾病或者癥狀。在至少一些實(shí)施方式中，所述方法包括在患者接受治療劑治療炎癥、發(fā)燒、膿毒 癥、癌癥、糖尿病或者心力衰竭后，用由該患者所采樣品重復(fù)步驟a)到g)，并通過監(jiān)控活化 與未活化樣品間熒光檢測結(jié)果的變化來監(jiān)控該治療劑的效果。本發(fā)明還提供了一種方法，其中在確定了激活與未激活樣品間的熒光檢測差異 后，熒光檢測的評(píng)估能指示激酶抑制劑在治療信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)疾病或狀況患者中是否有效。本發(fā)明提供的方法中，把樣品暴露于假定的激酶抑制劑，所述方法進(jìn)一步包括當(dāng) 激活的樣品有至少一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的可激活蛋白不表現(xiàn)出熒光變化時(shí)，則可確定激酶抑制劑的效力。本發(fā)明還提供了用于監(jiān)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制的試劑盒，包括泛激酶激活劑、至少兩種 能與選自下組的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白質(zhì)中至少一個(gè)結(jié)合的捕捉分子P38、ERK、PI3K和核糖 體S6。本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方式、特征及優(yōu)勢，以及各實(shí)施方式的構(gòu)成與操作，在下文 中進(jìn)行詳細(xì)描述，并有相應(yīng)的附圖作為參考。


本發(fā)明所使用的附圖構(gòu)成說明書的一部分，各對(duì)一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方式作 圖解，并且和說明書一同更進(jìn)一步地解釋本發(fā)明的原理。圖1是單核細(xì)胞內(nèi)脂多糖(LPS)引起胞內(nèi)激活的示意圖。圖2是測量未刺激的全血中3個(gè)MAPK通路成員(p38、JNK和ERK)的刺激檢測結(jié) 果。⑶14用于識(shí)別全血樣品中的單核細(xì)胞。圖3是正常全血用LPS在37°C刺激10分鐘后的檢測結(jié)果，顯示出所有⑶14+單核 細(xì)胞都有激活的P38、JNK和ERK。圖4是全血單核細(xì)胞中LPS應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)。本圖顯示，LPS在37°C下刺激2分鐘 后ERK顯示最先被激活，早于JNK或p38的激活。圖5是全血單核細(xì)胞中LPS應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)。LPS在37°C下刺激6分鐘后初始的 ERK激活減弱。在后續(xù)的時(shí)間點(diǎn)(約10分鐘)，p38、JNK和ERK出現(xiàn)增加。圖6是LPS應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)。LPS刺激60分鐘后，所有3個(gè)MAPK通路的活性減弱， 但未恢復(fù)至基線。如果加入額外的LPS，沒有觀察到額外的MAI3K活性提高。LPS的再次刺 激(即使是LPS體外刺激直至2小時(shí)后)不能提高這些通路的信號(hào)。圖7是LPS刺激的單核細(xì)胞中核糖體S6蛋白激活的動(dòng)力學(xué)。S6蛋白激活的峰值 在其他MAPK通路蛋白峰值后出現(xiàn)。圖8是由ERK抑制劑(U0126)或PII抑制劑(Ly940(^)或兩者一同抑制LPS對(duì) S6的激活。僅當(dāng)兩個(gè)通路都被抑制時(shí)，核糖體S6蛋白的才會(huì)被完全抑制。核糖體S6的抑 制只在ERK通路(本處使用U0126)和PII > Akt通路(本處使用Ly2940(^)都被抑制時(shí) 才能實(shí)現(xiàn)。兩種抑制劑同時(shí)存在時(shí)，核糖體S6的完全抑制提供了 PI3K被抑制的補(bǔ)充證據(jù)。圖9是正常樣品(未預(yù)先暴露于LPS)中，LPS引發(fā)了 ERKMAP激酶的快速激活，其 特征為一個(gè)早的峰值(添加LPS后1-4分鐘)、P-ERK的降低、和一個(gè)LPS刺激后10-15分 鐘出現(xiàn)的第二峰值。P-ERK的第二峰值的出現(xiàn)時(shí)間與P-p38和P-SAPK水平達(dá)到最高值的時(shí) 間相同。圖10顯示了一旦再次暴露于LPS，LPS再次刺激后，P-ERK的平均熒光強(qiáng)度(MFI) 相對(duì)于起始時(shí)間(0分鐘)對(duì)照直至90分鐘的期間都未出現(xiàn)顯著改變。圖11，左上顯示來自正常供體的未受刺激全血樣品中測得約有10-15%的表達(dá) P-P38的單核細(xì)胞(⑶14+)。在初步LPS刺激后，整個(gè)單核細(xì)胞群體( 100%)顯示了 MFI 的顯著提高，應(yīng)答在LPS刺激15分鐘后達(dá)到最大MFI值。即使在120分鐘后，P_p38的水 平仍未回到基線，顯示為圖11左下圖的雙峰分布。再次暴露于LPS后，P-p38陽性單核細(xì) 胞的百分比從40% (0分鐘，左下圖)增至46% (再次LPS暴露15分鐘后，右下圖)。MFI 總值則從0分鐘時(shí)的5. 0(左下圖)增至再次暴露于LPS15分鐘后的5. 5 (右下圖)。圖12，左上圖顯示，在正常個(gè)體中，未受刺激的單核細(xì)胞中P-S6水平低，約有10%的單核細(xì)胞顯示了不同種類的、正的P-S6表達(dá)水平。LPS刺激15-60分鐘后，P-S6的水平 達(dá)到峰值，與其下游于P-ERK激活的二次激活相一致。與P-ERK和P-p38不同，P-S6的水 平在LPS刺激后持續(xù)超過120分鐘(圖12，左下)。LPS再次刺激后，P_S6群體的MFI幾乎 沒有變化，且MFI呈緩慢下降，如圖12右下所示。
具體實(shí)施方式
概述在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在含有白細(xì)胞的樣品中測定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑信號(hào)蛋 白的激活狀態(tài)的方法。其它實(shí)施方式提供了在患者或測試樣品中監(jiān)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑效力 的方法。一些實(shí)施方式中，所述方法提供了一種高靈敏度的測試方法，其還可用于難以由其 獲得大量細(xì)胞樣品的患者群體如新生兒等。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及識(shí)別新的信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白抑制劑的方法。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及檢測患者樣品中膿 毒的方法。還提供了用于實(shí)踐本發(fā)明所述方法的試劑盒。本發(fā)明的一個(gè)顯著優(yōu)勢在于提高了特異性和靈敏度，從而允許僅使用極小的試樣 量就可使用所述方法。這對(duì)于僅能獲得少量患者樣品的情形，例如新生兒，很重要。需要提醒的是，本說明書和所附的權(quán)利要求書中，除非上下文明確指明，各單數(shù)形 式表示的“一個(gè)”、“以及”以及“該”均涵蓋相應(yīng)的復(fù)數(shù)形式。盡管任何與本文所述相似或等效的方法、裝置及材料均可用于實(shí)施本發(fā)明，但本 文僅描述特定的方法、裝置及材料。測試樣品的制備本文中術(shù)語“測試樣品”和“樣品”可以互換使用。本發(fā)明所述方法中的測試樣 品可以包括任何含有白細(xì)胞的樣品，例如全血、血漿、骨髓穿刺液(或者任何來自骨髓的細(xì) 胞)、尿液、血清、唾液、腦脊液、尿液、羊水、間質(zhì)液、排泄物、粘液、機(jī)體組織提取液或細(xì)胞提 取液。某些實(shí)施方式中，樣品為血樣。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，血樣為全血。全血可以用標(biāo)準(zhǔn) 的臨床步驟從個(gè)體或試驗(yàn)對(duì)象獲得。血樣的獲得包括從患者身上直接采集血樣，例如由抽血醫(yī)師完成。血樣的獲得也 包括取得先前取自病人的血樣，例如實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員獲得患者的血樣用于采用本發(fā)明所述 方法進(jìn)行分析。血漿可以由全血樣品通過將抗凝血樣進(jìn)行而離心獲得。該方法將得到底部 堆積的血紅細(xì)胞層、中間的白細(xì)胞層、以及上清液血漿層。白細(xì)胞可以用各種本領(lǐng)域已知技術(shù)，包括浮力密度離心等，從全血樣品中分離出 來。白細(xì)胞，即白血細(xì)胞，包含單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞以及嗜曙紅細(xì) 胞。本發(fā)明所述方法中特別優(yōu)選使用單核細(xì)胞。樣品可以采自人類對(duì)象或者具有商業(yè)意義的哺乳動(dòng)物，包括但不局限于猴、?；?者馬。樣品也可以采自家常寵物，包括，但不局限于狗或者貓。在一些實(shí)施方式中，樣品取自“未實(shí)驗(yàn)患者”?！拔磳?shí)驗(yàn)患者”是指未經(jīng)過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑蛋白抑制劑治療的患者。在某些實(shí)施方式中，樣品來自“年齡匹配的”對(duì)照的未實(shí)驗(yàn)患 者。“年齡匹配”是指樣品來自年齡相仿的未實(shí)驗(yàn)患者。在某些實(shí)施方式中，年齡匹配的樣 品來自年齡、性別和人種相似的個(gè)體。在一些實(shí)施方式中，年齡匹配的來自正常個(gè)體的白細(xì) 胞被用作陰性對(duì)照以便比較信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白活性。在一些實(shí)施方式中，樣品經(jīng)過抗凝血?jiǎng)┨幚?。抗凝血?jiǎng)┑睦影?，但不局限?維生素K抑制劑如殺鼠靈、EDTA (乙二胺四乙酸)、A⑶(酸性枸櫞酸鹽葡萄糖)、肝磷脂以及 1，3-茚滿二酮。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化此處所用術(shù)語“可激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白”或者其語義等效表達(dá)，均是指一種具有至少一個(gè)同工型(及某些情況下有兩個(gè)或更多同工型)的蛋白質(zhì)，所述同工型與該蛋白 質(zhì)的一個(gè)特定構(gòu)型相對(duì)應(yīng)，具備特定的生物的、生化的、或者物理的屬性例如酶活性、修飾 (如轉(zhuǎn)錄后修飾)或構(gòu)象。對(duì)于特定的生物活性、修飾或者構(gòu)象，該可激活化的蛋白質(zhì)可以 是被激活的或者未激活的(即未經(jīng)激活)。具體來講，可激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的激活 或者活化型具有特定的生物活性、修飾或者構(gòu)象，而可激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的未激活的 或非活性的(無活性)構(gòu)型并不具有(或具有較少或較低水平的)所述特定的生物活性、 修飾或者構(gòu)象。在一些實(shí)施方式中，可以有多于一個(gè)同工型與活性或者激活狀態(tài)相關(guān)聯(lián)；例 如，可以有一個(gè)同工型與可供底物結(jié)合的“開放式”構(gòu)象相關(guān)，第二個(gè)過渡狀態(tài)的同工型，以 及一個(gè)缺乏活性的同工型(如活性被抑制)。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，可激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的生物的、生化的、或者物理 的性質(zhì)(如酶學(xué)活性、修飾或構(gòu)象)可被激活劑或者細(xì)胞信號(hào)發(fā)生所誘導(dǎo)或者激活。激活 劑的例子包括但不局限于激酶、磷酸酶、蛋白酶(如胱天蛋白酶)、以及激素。細(xì)胞信號(hào)發(fā) 生的例子包括，但不局限于受體群集、或者與關(guān)聯(lián)分子或配體相結(jié)合。此處所用的術(shù)語“同工型”是指可激活蛋白質(zhì)的一種形式，其具有一種特異的、以 及優(yōu)選是可檢測的生物活性、修飾、或者構(gòu)象。該同工型可以是可激活受體的一種激活的 (或者活性)形式，或者是未激活的(或非活性的)形式。如前所述，在某些實(shí)施方式中，激 活態(tài)特異性捕捉分子(例如抗體)與可激活受體元件的相應(yīng)同工型的結(jié)合是該可激活受體 元件的識(shí)別、以及該可激活受體元件的激活狀態(tài)的指示。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明 提供了用于確定受體元件同工型分布型的方法，該分布型包括測定可激活受體元件的激活 的同工型(或活性同工型)的存在。在特定的實(shí)施方式中，可激活受體元件的激活的同工型或活化狀態(tài)是該可激活受 體的一種形式，其具有該可激活受體的其它至少一個(gè)同工型所不具備的特定的或者特異性 的生物的、生化的、或者物理的性質(zhì)。這些性質(zhì)的例子包括但不局限于酶學(xué)活性(如激酶 活性和蛋白酶活性)和受體元件結(jié)合活性。因此，這些特定的或者特異性的性質(zhì)或活性與 可激活受體的激活同工型相關(guān)聯(lián)。這樣的性質(zhì)或活性有時(shí)在此是指激活態(tài)活性。激活態(tài)活性的實(shí)例是被激活受體元件的激酶活性。此處所述術(shù)語“具有蛋白激 酶活性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白”是指一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白，其能在被激活時(shí)催化氨基酸或 其具有羧基的衍生物的磷酸化。優(yōu)選的激酶是那些能催化絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸殘基 磷酸化的激酶。能通過提供一種可被激酶磷酸化的底物、一種可被激酶利用的磷酸酯源，并 測定激酶存在下的底物磷酸化來測定激酶的活性?？杉せ钍荏w元件的激活同工型的抗原性可區(qū)別于該可激活受體元件未激活同工 型的抗原性、或者可區(qū)別于不同激活態(tài)的同工型的抗原性。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，受體 元件的激活同工型所具有的表位是該受體元件的未激活同工型所缺少的，或反之亦然。在 另一個(gè)實(shí)施方式中，這一區(qū)別是由于受體元件上共價(jià)添加的部分，例如磷酸酯基團(tuán)；或者是 由于受體元件的結(jié)構(gòu)變化，例如通過蛋白裂解；或是由于受體元件因其它原因?qū)е碌臉?gòu)型 變化，該變化以抗原性不同的方式造成所述元件出現(xiàn)同樣的序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，這 樣的構(gòu)型改變可引起受體元件的激活同工型呈遞至少一個(gè)在未激活同工型中不存在的表 位，或者不呈遞至少一個(gè)在未激活(即，非活化的)同工型中存在的表位。在一些實(shí)施方式 中，供捕捉分子結(jié)合的表位集中在受體元件活性位點(diǎn)周圍，盡管如本領(lǐng)域所知，受體元件一個(gè)區(qū)域的構(gòu)型變化同樣會(huì)導(dǎo)致該元件不同區(qū)域的變化。在某些實(shí)施方式中，所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，該 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在對(duì)胞外信號(hào)的應(yīng)答中可影響基因調(diào)節(jié)，并控制細(xì)胞增殖以及分化。該通路 還涉及卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的成熟。MAPK通路在例如蛙和哺乳動(dòng)物如小鼠、大鼠和人類等中 被發(fā)現(xiàn)。該通路可以被細(xì)胞因子例如白介素-I(IL-I)和腫瘤壞死因子(TNF)激活，并可被 如Mos、Raf, Ras,以及V12HaRas等蛋白質(zhì)組成型地激活。在其它實(shí)施方式中，所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是PII通路。PII通路為磷脂酰肌醇3-激 酶通路，其介導(dǎo)并調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡。PII通路還介導(dǎo)包括增殖、生長、分化、運(yùn)動(dòng)性、血 管再生、有絲分裂發(fā)生、轉(zhuǎn)化、存活力、以及衰老等在內(nèi)的細(xì)胞代謝過程?？山閷?dǎo)PII通路 的細(xì)胞因子包括PI3K、Akt和BAD。這些因子介導(dǎo)并調(diào)節(jié)細(xì)胞程序死亡。PII因子包括I 型PII--—種包括p85和pllO的胞內(nèi)酶(cytostolic enzyme)復(fù)合體。BAD已被鑒定為 bcl-2家族中的促細(xì)胞程序死亡的一員。核糖體蛋白S6(RPS6)屬于核糖體蛋白族S6E，它參與經(jīng)選擇性翻譯對(duì)細(xì)胞生長以 及增殖的控制(Molina H. et al. ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 :2199-2204, (2007)) ^t 真核細(xì)胞核糖體中，它是核糖體蛋白S6激酶的主要底物。在翻譯期間，它調(diào)節(jié)任何含有5' 末端寡嘧啶序列(5‘ TOP)的RNA的翻譯。5' TOP編碼細(xì)胞周期行進(jìn)的相關(guān)蛋白、核醣體 蛋白以及延伸因子。RPS6的磷酸化與選擇性5' TOP翻譯的增強(qiáng)有關(guān)。RPS6的主要磷酸化 位點(diǎn)包括絲氨酸 235、236、240、以及 244 (Peterson，R. T. and Schreiber，S. L. , 1998) RPS6 的磷酸化受生長因子、腫瘤助長劑、以及促分裂原所刺激。在生長阻滯期間，RPS6被脫磷酸 化。在某些實(shí)施方式中，所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白為PII核醣體S6蛋白、p44/42MAP激 酶、TYK2、p38MAP 激酶、PKC、PKA、SAPK, ELK、JNK、cjun、RAS, Raf、MEK 1/2、MEK 3/6、MEK 4/7、ZAP-70、LAT、SRC、LCK、ERK 1/2、Rskl、PYK2、SYK、PDK1、GSK3、FKHR、AFX、PLCg、PLCy、 FAK、CREB、α ΠΙ β 3、Fc ε RI、BAD、p70S6K、STAT1、STAT2、STAT3、STAT5、STAT6 或上述蛋白 的組合。在特定的實(shí)施方式中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白為P38和ERK和PDK或核糖體S6。其它 實(shí)施方式中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白為p38、ERK、和核糖體S6。JNK和核糖體S6提供了適用本 發(fā)明所述方法的其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白。在某些實(shí)施方式中，所述樣品與泛激酶激活劑一起孵育。在某些實(shí)施方式中，所述 泛激酶激活劑為脂多糖(LPQ。術(shù)語“LPS”應(yīng)當(dāng)理解為包括各種天然產(chǎn)生的以及人工合成 或者半合成制得的變體。LPS由一個(gè)脂質(zhì)部分脂質(zhì)A和一個(gè)共價(jià)結(jié)合于膜結(jié)構(gòu)域的多糖單位組成。多糖區(qū) 域由末端的0-特異性鏈、一種包含最多可達(dá)50個(gè)重復(fù)寡糖單位的通常為兩個(gè)到八個(gè)單體 的亞結(jié)構(gòu)、和與脂質(zhì)A相連接的核心區(qū)域組成。0-特異性鏈的特征在于它在不同種類中巨大的結(jié)構(gòu)可變性。如下所述，脂質(zhì)A組 分負(fù)責(zé)下文所述的LPS的生物活性。所述生物活性由脂質(zhì)A的不同?；Ｊ阶兓瘉碚{(diào) 控。該活性的范圍包括由諸如多數(shù)天然產(chǎn)生的LPS變體(如弗里德奧沙門氏菌和馬流產(chǎn)沙 門氏菌)可引起的激動(dòng)效應(yīng)，直至植物共生微生物或者合成衍生的LPS變體所引起的拮抗 作用(C. Alexander and Ε. Τ. Rietschel，Biospektrum, Vol. 4，No. 5，pp. 275—281，1999)。
LPSffiese, K. Brandenburg, U. Seydel, and S. Muller-Leoennies The Dual Role of Lipopolysaccharide as Effector and Target Molecule. Biol. Chem.， 380，pp. 767-784 中讀到。脂多糖由革蘭氏陰性細(xì)菌所產(chǎn)生，是先天免疫的高效激活劑。它們與人類單核細(xì) 胞上的toll樣受體4(TLR4)/CD14受體結(jié)合并誘發(fā)如TNFa、MIF、IL-I β、IL-6、IL-8、 IL-12、IL-15和IL-18等促炎癥細(xì)胞因子、各種集落刺激因子、各種脂質(zhì)介體的產(chǎn)生和分 泌，并使氧減少。脂多糖還通過這些機(jī)理激活非特異性免疫應(yīng)答，作為這樣的應(yīng)答的結(jié)果是，可以 更好地消除微生物、病毒和癌細(xì)胞。被LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和脂質(zhì)介體產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致發(fā)炎、發(fā) 熱和膿毒等現(xiàn)象。由于LPS在膿毒中的毒性效應(yīng)，激動(dòng)性LPS被稱為內(nèi)毒素。在另一些實(shí)施方式中，泛激酶激活劑為TLR4激活劑。本發(fā)明可使用其它表面酪氨 酸激酶受體激活劑來刺激單核細(xì)胞中的其它通路，例如用GM-CSF激活外周血單核細(xì)胞中 的JAK/STAT通路，或用激動(dòng)劑比如IL-4來激活外周血淋巴細(xì)胞中的JAK/STAT通路。各樣品制備中的最適孵育時(shí)間和溫度可采用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)來確定。在至少一個(gè)實(shí)施 方式中，泛激酶激活劑進(jìn)行的激活持續(xù)1-10分鐘。在此期間中，可以監(jiān)測信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑信 號(hào)蛋白的早期活化。例如，如下面所舉例的那樣，ERK的激活在暴露于泛激酶激活劑2分鐘 內(nèi)就可以測得。其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑信號(hào)蛋白的激活在暴露于泛激酶激活劑15分鐘內(nèi)達(dá)到 飽和。在另一些實(shí)施方式中，泛激酶激活劑的活化進(jìn)行得超過30分鐘。在此期間中，可 以監(jiān)測信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑信號(hào)蛋白的后期活化。例如，如下面所舉例的那樣，核糖體S6的信號(hào) 有時(shí)在暴露于泛激酶激活劑30分鐘后開始達(dá)到峰值。保存及解掩蔽方法在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制備用于測定蛋白表位的生物樣品的方 法，該方法保存胞內(nèi)蛋白質(zhì)表位以供后續(xù)檢測。所述方法包括保存(固定)步驟，包括將 所述樣品與用量使終濃度足以使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸分子形成交聯(lián)的保存劑(固定劑)接 觸；清洗步驟，包括向所述生物樣品中添加用量使終濃度足以溶解樣品中所含任何紅細(xì)胞、 并使白細(xì)胞透化的清潔劑；和標(biāo)記步驟，將所述樣品和對(duì)一個(gè)或多個(gè)表位特異的可檢測的 結(jié)合劑接觸。具體的方法在參考文獻(xiàn)，待授權(quán)的美國專利申請(qǐng)U. S. Appl. No. 10/928，570中 有詳述。應(yīng)當(dāng)理解，如果所述樣品中不含有紅細(xì)胞，即樣品已經(jīng)過預(yù)分級(jí)化，那么溶解步驟 就是不必要的。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制備用于測定蛋白表位的生物樣品的方 法，該方法可保存信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白質(zhì)表位以供后續(xù)檢測。所述方法包括一個(gè)保存(固定) 步驟，包括將所述樣品與用量使終濃度足以使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸分子形成交聯(lián)的保存劑 (固定劑)接觸。所述保存劑(固定劑)的濃度可以為約0.1%到20%、約0.5%到15%、 約到10%、約到8%、約到4%、約到2%。所述保存劑(固定劑)可以以濃 縮液或稀釋溶液的形式加入從而達(dá)到所需的濃度。所述保存劑(固定劑)可以是任何使用 者所需的合適試劑，例如乙醛、甲醛、或者多聚甲醛、或者福爾馬林。本發(fā)明所述用于保存胞內(nèi)蛋白質(zhì)表位以供后續(xù)檢測的制備用于測定蛋白表位的 生物樣品的方法還包括一個(gè)清洗步驟，其中向所述樣品中添加用量使終濃度足以溶解樣 品存在中的任何紅細(xì)胞、并使白細(xì)胞透化的清潔劑。使用者可以根據(jù)各種條件來選擇清潔劑的濃度，所述清潔劑的濃度可以為約0. 到^^、約化丨^到一^^約化丨^到？^^約 0. 1%到6%、約0. 1%到5%、約0. 1%到4%、約0. 1%到3%、約1%到2%、約0. 到 1%。所述清潔劑可以根據(jù)各種因素來選用，可以是離子型或者非離子型的清潔劑。清 潔劑優(yōu)選非離子型的清潔劑。目前一種優(yōu)選的清潔劑為乙氧化辛基酚，商品名為Triton X-100 (Sigma T^84)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法使用Triton X-100。適用于本發(fā) 明方法的清潔劑能透化細(xì)胞并保留表面表位的完整性?？捎糜诒景l(fā)明的離子型清潔劑進(jìn) 一步包括辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，商品名Ig印al CA-630(Sigma-N-6507)或Nonidet P-40 (NP-40) (Sigma)、Bri j_58、以及線性醇烷氧基化物，商品名為 Plurafac A_38 (BASF 公 司)或 Plurafac A-39 (BASF 公司)。在復(fù)合的細(xì)胞群體例如未稀釋的外周血、骨髓穿刺液、以及腹膜液中，經(jīng)過一個(gè)步 驟來通過表面標(biāo)記物區(qū)分細(xì)胞子集并檢測胞內(nèi)磷酸-表位染色是有用的。本發(fā)明提供的制 備用于保存胞內(nèi)蛋白質(zhì)表位以供后續(xù)檢測的用于測定蛋白表位的含紅細(xì)胞的生物樣品的 方法，可以勝任將胞內(nèi)表位檢測與細(xì)胞表面表位檢測進(jìn)行結(jié)合。本發(fā)明提供的方法中，胞內(nèi) 和胞外的表位都能保持完整，從而允許后續(xù)流式細(xì)胞分析進(jìn)行測量。例如，用典型的單核細(xì) 胞標(biāo)記物包括，如CD14，進(jìn)行的表面測定可與胞內(nèi)表位測定相結(jié)合。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述方法還包括進(jìn)一步的醇處理步驟，該步驟包括將生 物樣品與足量醇接觸，醇的最終濃度達(dá)到足以將固定步驟中因?yàn)榻宦?lián)而消失的細(xì)胞表位解 掩蔽。正如此處所述，醇處理步驟可以保留大部分的胞外表位，使用者可以根據(jù)需要保留的 表位來調(diào)整孵育的時(shí)長、溫度和濃度。所述醇的終濃度還可根據(jù)其它變量，包括，例如孵育時(shí)間、溫度、以及解掩蔽和測 定的特定目標(biāo)表位等，來進(jìn)行選擇。所述醇的終濃度可以為約25%到75%、約30%到70%、 約35 %到65 %、約40 %到60 %、約45 %到55 %。所述醇可以進(jìn)一步從乙醇和甲醇中選擇。 如果需要，可以用丙酮替代醇處理步驟中的醇。樣品與醇或者丙酮接觸的溫度可以是，例如 約-30 V、約-20°C、約-10°C、約-5°C、約0°C、約4°C、約6°C、約8°C、或者任何其它有助于 胞內(nèi)表位解掩蔽并且不降低細(xì)胞表面表位反應(yīng)性的溫度。捕捉分子及本發(fā)明中的其它試劑本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白被激活以便放大信號(hào)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑蛋白的水平通常用捕捉分子來測定。在此所用的術(shù)語“捕捉分子”是指任何能在適當(dāng)條 件下與本發(fā)明的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白結(jié)合的分子或者分子復(fù)合物。因而，一種捕捉分子，包括 任何分子，如蛋白質(zhì)、小分子有機(jī)物、碳水化合物(包含多糖)、多聚核苷酸、脂質(zhì)等。這些條 件的選擇、以及對(duì)結(jié)合條件的改動(dòng)或調(diào)整都是公知的。例如，眾所周知，溫度、PH和孵育時(shí) 間都對(duì)結(jié)合有影響。通常，結(jié)合具有高度特異性，排除了大量與多于一個(gè)配體的顯著結(jié)合。 本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，捕捉分子是抗體或者配體結(jié)合片段或者其類似物。捕捉分子也 可以是在實(shí)踐本發(fā)明特定實(shí)施方式中能與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白相結(jié)合的其它蛋白質(zhì)或者核 酸或者其類似物。在優(yōu)選的實(shí)施例中，捕捉分子是抗體，特別是單克隆抗體。在此所用術(shù)語“抗體”是 指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白(Ig)中具備免疫活性的部分。所述抗體包括但不局限 于多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性多克隆抗體、抗體模擬物、嵌合體、單鏈、Fab、Fab\ F(ab' )2片段、Fv、以及Fab表達(dá)文庫。通常，由人體獲得的抗體分子屬于IgG、IgM、IgA、 IgE和IgD中的任意一個(gè)，這些分類之間的區(qū)別在于分子中重鏈的不同。一些類別還具有亞類，例如IgGl、IgG2等等。此外，人類中的輕鏈可以是κ鏈或者是λ鏈。在此所述抗體包 含上述各種類別、亞類和類型的抗體。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，抗體的片段能實(shí)現(xiàn)與抗原結(jié)合的功能。此處所述術(shù)語“抗原結(jié)合片 段”包括但不局限于⑴由Vl、VH、Cl和Cm結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由Vh和Cm結(jié)構(gòu) 域組成的Fd片段；(iii)由八和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv) 結(jié)構(gòu)域組成的dAb片 段；(ν)單獨(dú)的CDR區(qū)域；(vi)F(ab' )2片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中一個(gè)Vh結(jié)構(gòu) 域和一個(gè)\結(jié)構(gòu)域通過肽交聯(lián)劑交聯(lián)在一起，使這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域聯(lián)結(jié)形成一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn) (Bird et al，Science 242:423-426(1988) ；Huston et al,Proc. Natl. Acad. ScL USA 55: 5879-5883(1988)) ； (viii)雙特異性 Fv 二聚物(PCT/US92/09965)；以及(ix)通過基因融 合構(gòu)建的雙鏈抗體、多價(jià)或者多特異性片段(W094/13804 ;P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 90 :6444_6448(1993))。本發(fā)明所述捕捉分子可以包含熒光標(biāo)記。術(shù)語“熒光標(biāo)記，，是指一種可以被直接 (即一級(jí)標(biāo)記)或者間接(即二級(jí)標(biāo)記)測得的分子，例如標(biāo)記可以是被目測和/或檢測或 用其它方式識(shí)別其存在或者缺失的分子?；衔锟梢灾苯踊蛘唛g接地與標(biāo)記形成共軛，該 標(biāo)記能發(fā)出可檢測信號(hào)，例如熒光劑、酶、抗體、磁性粒子等微粒、化學(xué)熒光劑、或特異性結(jié) 合分子等等。特異性結(jié)合分子包括配對(duì)分子，如生物素與鏈霉親和素、地高辛與抗地高辛等 等。標(biāo)記物包括但不局限于熒光標(biāo)記和酶。 通常，標(biāo)記物可以是發(fā)色或者熒光的染料或者部分及其結(jié)合伴侶。標(biāo)記物也可以 包括酶(辣根過氧化物酶等)和磁性粒子。在某些實(shí)施方式中，檢測標(biāo)記為一級(jí)標(biāo)記。一 級(jí)標(biāo)記是指能被直接檢測的標(biāo)記，例如熒光團(tuán)。在某些實(shí)施方式中，標(biāo)記物可以包括發(fā)色團(tuán)或者磷光體，但優(yōu)選熒光染料或者部 分。熒光團(tuán)可以是小分子熒光體或者類蛋白熒光體。熒光標(biāo)記是指任何可以通過其固有的熒光特性被檢測的分子。合適的熒光標(biāo)記 包括但不局限于熒光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀 綠、芪、螢黃、Cascade Blue 、德州紅、IAEDANS, EDANS, BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5. 5、LC Red 705以及俄勒R綠。合適的光學(xué)染料在本文所引用的Richard P. Haugland著 的1996年的《分子探針手冊(cè)》中有詳述。合適的熒光標(biāo)記還包括但不局限于綠色熒光蛋白 (GFP ；Chalfie et al, Science 263(5148) :802_805(1994)；和 EGFP ;Clontech_Genbank Accession Number U55762)、藍(lán)色焚光蛋白(BFP ； 1. Quantum Biotechnologies, Inc. 加拿大魁北克；2. Stauber, R. H. Biotechniques 24 (3) :462_471 (1998) ；3. Heim, R. and Tsien, R. Y. Curr. Biol. 6 178-182 (1996))、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP ；1. Clontech Laboratories, Inc.,美國力口 州)、熒光素酶(Ichiki et al.，J. Immunol. 150(12) 5408-5417(1993))、0-半乳糖苷酶(Nolan et al. , Proc Natl Acad Sci USA 85(8) 2603-2607(1988))和 Renilla(WC) 92/15673 ；WO 95/07463 ；WO 98/14605 ；WO 98/26277 ； WO 99/49019 ；U. S. Pat. No. 5，292，658 ；U. S. Pat. No. 5，418，155 ；U. S. Pat. No. 5，683，888 ； U. S. Pat. No. 5，741，668 ；U. S. Pat. No. 5，777，079 ；U. S. Pat. No. 5，804，387 ；U. S. Pat. No. 5，874，304 ；U. S. Pat. No. 5，876，995 ；and U. S. Pat. No. 5，925，558)。所有上述參考文獻(xiàn) 被引用到本文作為參考。

本發(fā)明可用的附加標(biāo)記包括=Alexa-Fluor系列染料(Alexa Fluor 350，AlexaFluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633,Alexa Fluor 660,Alexa Fluor 680)、Cascade Blue、Cascade Yellow> R-藻紅蛋白(PE) (Molecular Probes，美國俄勒岡)FITC、羅丹明、德州紅(Pierce，美國伊 利諾伊)、Cy5、Cy5. 5、Cy7(Amersham Life Science，美國賓夕法尼亞)。Cy5PE、Cy5. 5PE、 Cy7PE、Cy5. 5APC、Cy7APC的串聯(lián)共軛方法為本領(lǐng)域已知技術(shù)。熒光探針共軛的定量可以由 標(biāo)記程度來評(píng)估，并且包括染料光譜特性的方法是本領(lǐng)域已知的。在另一種實(shí)施方式中，熒光標(biāo)記為GFP，并且在至少一些實(shí)施方式中使用的是海 筆、海鰓或發(fā)光水母的GFP。在某些實(shí)施方式中，使用了二級(jí)檢測標(biāo)記。二級(jí)標(biāo)記是指可以間接檢測的標(biāo)記，例 如二級(jí)標(biāo)記可以與可供檢測的一級(jí)標(biāo)記結(jié)合或者反應(yīng)、可以作用于其它產(chǎn)物以產(chǎn)生一級(jí)標(biāo) 記(如酶)、等等。二級(jí)標(biāo)記包括但不局限于結(jié)合伴侶配對(duì)中的一個(gè)；可化學(xué)修飾的部 分；核酸酶抑制劑，酶比如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、熒光素酶等等。在特定的實(shí)施方式中，所述二級(jí)標(biāo)記是結(jié)合伴侶配對(duì)。例如標(biāo)記可以是能與其結(jié) 合伴侶結(jié)合的半抗原或者抗原。例如，合適的結(jié)合伴侶配對(duì)包括但不局限于抗原(諸如蛋 白質(zhì)(包括肽)和小分子)與抗體(包括其片段(Fabs、等等)；蛋白質(zhì)與小分子，包括生物 素/鏈霉親和素；酶與底物或者抑制劑；其它蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用對(duì)；受體-配體；以 及碳水化合物與其結(jié)合伴侶。核酸-核酸結(jié)合蛋白也可使用。合適的結(jié)合伴侶配對(duì)包括但 不局限于生物素(或亞氨基生物素)與鏈霉親和素、地高辛與其抗體、以及Prolinx 試 劑。在特定的實(shí)施方式中，結(jié)合伴侶配對(duì)包括抗原和將會(huì)與該抗原特異性結(jié)合的抗 體。所述“特異性結(jié)合”是指伴侶間結(jié)合的特異性足夠?qū)⑴潴w與系統(tǒng)內(nèi)其它組分或雜質(zhì)的結(jié) 合區(qū)分開來。結(jié)合性必須足以在測試方法的條件下保持伴侶間的結(jié)合，所述測試條件包括 清洗步驟以除去非特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，該配對(duì)的解離常數(shù)應(yīng)低至10_4至KT6M4 以下，優(yōu)選低至10_5至IO-9M-1以下，更優(yōu)選低至10_7至IO-9M-1以下。在特定的實(shí)施方式中，所述二級(jí)標(biāo)記是可化學(xué)修飾的部分。該實(shí)施方式中，包含 反應(yīng)活性官能團(tuán)的標(biāo)記物與待標(biāo)記的分子結(jié)合。所述官能團(tuán)可以隨后用一級(jí)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo) 記(如實(shí)驗(yàn)前或者實(shí)驗(yàn)后)。合適的官能團(tuán)包括但不局限于氨基、羧基、馬來酰亞胺基、 橋氧基、硫醇基，其中尤為優(yōu)選氨基和硫醇基。例如，含有氨基的一級(jí)標(biāo)記可以與含有氨基 的二級(jí)標(biāo)記相連，比如通過使用本領(lǐng)域已知的連接劑如公知的同功或異功的雙功能連接劑 (參見 1994 Pierce Chemical Company catalog,technical section on cross-linkers, pages 155-200，并入本文作為參考)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明所述捕捉分子使用了多個(gè)熒光標(biāo)記，在優(yōu)選的實(shí)施方 式中，使用至少兩個(gè)同一熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)配對(duì)中的熒光標(biāo)記。

FRET是本領(lǐng)域已知的現(xiàn)象，其中一個(gè)熒光染料的激活可以不發(fā)射光子而轉(zhuǎn)移到另 一個(gè)熒光染料。FRET配對(duì)由供體熒光團(tuán)和受體熒光團(tuán)組成。供體的熒光發(fā)射光譜與受體的 熒光吸收光譜必須有重疊，且兩個(gè)分子必須緊密靠近。使得50%的供體鈍化(將能量轉(zhuǎn)移 至受體)時(shí)供體與受體間的距離被定義為Forster半徑(Ro)，其代表性數(shù)值為10-100入。 含有FRET配對(duì)的熒光發(fā)射光譜的變化可以被檢測到，指示緊密靠近(即相互距離在100 A 以內(nèi))的配對(duì)的數(shù)量變化。這是兩個(gè)分子相互結(jié)合或者解離的代表性結(jié)果，其中一個(gè)標(biāo)記有FRET供體，另一個(gè)標(biāo)記有FRET受體，其中這樣的結(jié)合將FRET配對(duì)緊密靠近。這樣的分 子間結(jié)合會(huì)導(dǎo)致受體的熒光發(fā)射強(qiáng)度增加或者供體熒光發(fā)色的猝滅。本發(fā)明可用的FRET配對(duì)(供體/受體)包括但不局限于EDANS/熒光素、 IAEDANS/熒光素、熒光素/四甲基羅丹明、熒光素/LC Red 640、熒光素/Cy 5、熒光素/Cy 5. 5以及熒光素LC Red 705.在FRET的另一方面，可以使用熒光供體分子和非熒光的受體分子(猝滅劑)。這 一應(yīng)用中，當(dāng)猝滅劑移離供體附近時(shí)供體的熒光發(fā)射會(huì)增強(qiáng)，而當(dāng)猝滅劑靠近供體附近時(shí) 則供體的熒光發(fā)射會(huì)減弱。可用的猝滅劑包括但不局限于TAMRA、DABCYL、QSY 7、以及QSY 33。可用的供體/猝滅劑包括但不局限于EDANS/DABCYL、德州紅/DABCYL、BODIPY/DABCYL、 螢黃/DABCYL、香豆素/DABCYL、以及熒光素/QSY 7染料。利用FRET和熒光猝滅可以實(shí)時(shí)監(jiān)測標(biāo)記分子間的結(jié)合，提供關(guān)于結(jié)合反應(yīng)時(shí)間 過程的連續(xù)信息。FRET程度的變化可以由供體和受體部分的熒光量的比例的變化函數(shù)來確定，這個(gè) 過程叫做“定比例”。底物絕對(duì)量的變化、激活強(qiáng)度、以及樣品在激發(fā)波長下的濁度或其它背 景吸收對(duì)供體和受體的熒光強(qiáng)度有相似的影響。因此，相，兩個(gè)發(fā)射強(qiáng)度之間的比例是比兩 者中任何一個(gè)的單獨(dú)強(qiáng)度更可靠和優(yōu)選的測試參數(shù)。此處描述的比例法熒光報(bào)告系統(tǒng)與現(xiàn)有的蛋白質(zhì)結(jié)合方法相比具有顯著的優(yōu)勢， 因?yàn)槠湓试S實(shí)現(xiàn)對(duì)表達(dá)性或者非表達(dá)性的單個(gè)活細(xì)胞進(jìn)行高靈敏度的檢測和分離。在特定 的實(shí)施方式中，測試系統(tǒng)使用易于加樣并截留于胞內(nèi)的無毒性、非極性的熒光底物。同類蛋 白質(zhì)對(duì)熒光底物的修飾因?yàn)榈孜镛D(zhuǎn)化成產(chǎn)物而產(chǎn)生熒光發(fā)射漂移。由于報(bào)告分子以比例方 式讀取，所述方法在各種報(bào)告蛋白測試法中具有獨(dú)特性，對(duì)各種變量如進(jìn)入單個(gè)細(xì)胞的底 物加樣量等，有控制。這一穩(wěn)定的、易于檢測的、胞內(nèi)的讀取消除了在進(jìn)行表達(dá)分析前建立 克隆細(xì)胞系的需要。該系統(tǒng)和其它類似的流式分類系統(tǒng)可用于從有上百萬個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞池 中分離出攜帶特定受體元件簇和/或激活特性的細(xì)胞。可以采用標(biāo)準(zhǔn)步驟(drmr. com. abcon)或使用Molecular Probes公司(美國俄勒 岡)的蛋白-蛋白/蛋白-染料交聯(lián)試劑盒來進(jìn)行抗體結(jié)合。標(biāo)記部分與檢測分子例如抗 體的共軛是免疫分析技術(shù)中的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟。參見，例如，0' Sullivan等1981年發(fā)表在 Langone 和 Van Vunakis 編輯的 Methods in Enzymology 第 73 卷 147-166 頁的〃用于酶免 疫測試的酶-抗體共軛物的制備方法〃(Academic Press,New York，N. Y.)。標(biāo)記部分可用 傳統(tǒng)方法與蛋白質(zhì)或者多肽結(jié)合。例如，偶聯(lián)劑二醛、碳二亞胺、馬來酰亞胺、雙_酰亞胺、 雙重氮聯(lián)苯胺、及類似物質(zhì)等可用于將上述熒光、化學(xué)發(fā)光以及酶標(biāo)記物標(biāo)記到抗體上。參 見，例如，U. S. Pat. No. 3，940, 475 (熒光計(jì))和 U. S. Pat. No. 3，645，090 (酶法)；Hunter 等 人，Nature，144 945(1962) ；David 等人，Biochemistry，13 1014-1021 (1974) ；Pain 等人， J. Immunol Methods, 40 :219_230 (1981)；以及 Nygren J. , Histochem. and Cytochem. ,30 407-412 (1982)。熒光或者化學(xué)發(fā)光標(biāo)記可用來提高放大和靈敏度至5-10pg/ml，甚至更好。在本發(fā)明實(shí)施方式中，捕捉 分子是激活特異性的。本發(fā)明所述方法和組分可用于 檢測樣品中任何特定的受體元件同工型，所述同工型可被抗原性檢出或者與其它同工型進(jìn) 行抗原性區(qū)分。例如，如本發(fā)明舉例說明并描述的那樣(參見，例如，實(shí)施例)。本發(fā)明所述 激活態(tài)特異性捕捉分子可用于本發(fā)明的方法，來識(shí)別復(fù)合細(xì)胞群體內(nèi)子集或者亞群的不同的 信號(hào)級(jí)聯(lián)、以及在潛在的信號(hào)層級(jí)中蛋白激活(例如激酶激活)的順序。進(jìn)一步地，在本 發(fā)明的方法中，流式細(xì)胞術(shù)，特別是多色流式細(xì)胞術(shù)的使用允許實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路 的多維度分析和功能評(píng)估。此處所用術(shù)語“激活態(tài)特異性捕捉分子”或“激活態(tài)分子”或它們的語義等效表達(dá) 是指可特異性地與相應(yīng)的特定抗原結(jié)合的捕捉分子(即抗體)。在某些實(shí)施方式中，相應(yīng)的 特定抗原是可激活受體元件的特定同工型。另外，優(yōu)選的，激活態(tài)特異性抗體的結(jié)合指示了 特定可激活受體元件的特定激活態(tài)。在某些實(shí)施方式中，激活態(tài)特異性捕捉分子與相應(yīng)的可激活受體元件的同工型的 結(jié)合指示了可激活受體元件的識(shí)別以及該可激活受體元件的激活狀態(tài)。在特定的實(shí)施方式中，激活態(tài)特異性捕捉分子是含有可與可激活受體元件上目標(biāo) 結(jié)構(gòu)相結(jié)合的識(shí)別結(jié)構(gòu)的肽。多種識(shí)別結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域是公知的，并可采用本領(lǐng)域已知方 法制成，包括噬菌體展示文庫(參見，如Gururaja et al.，Chem. Biol. (2000) 7 515-27 ； Houimel et al. , Eur. J. Immunol. (2001)31 :3535_45 ；Cochran et al. , J. Am. Chem. Soc. (2001) 123 625-32 ；Houimel et al.，Int. J. Cancer (2001) 92 :748_55，均并入本文作為參 考)。在特定的實(shí)施方式中，所述激活態(tài)特異性捕捉分子包含下述識(shí)別結(jié)構(gòu)SKVILFE-隨機(jī) 肽環(huán)-SKVILFE。具有這樣的識(shí)別結(jié)構(gòu)的捕捉分子可以高親和性地與特定目標(biāo)結(jié)構(gòu)結(jié)合。進(jìn) 一步的，本發(fā)明的方法中使用的捕捉分子可以附接有熒光團(tuán)。多種識(shí)別結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域是公知的(例如Cochran et al.，J. Am. Chem. Soc. (2001) 123 625-32 ；Boer et al.，Blood (2002) 100 :467_73，均并入本文作為參考)，并可 采用本領(lǐng)域已知方法制成(參見，如:Boer et al. ,Blood(2002) 100 467-73 ；Gualillo et al.，MoI. Cell. Endocrinol. (2002) 190 :83_9，均并入本文作為參考)，包括例如用組合化 學(xué)方法生產(chǎn)對(duì)可激活蛋白上目標(biāo)結(jié)構(gòu)具有親和性的識(shí)別結(jié)構(gòu)比如聚合物(參見，如=Barn et al.，J. Comb. Chem. (2001)3 :534_41 Ju et al.，Biotechnol. (1999)64 :232_9，均并入 本文作為參考)。在另一實(shí)施方式中，激活態(tài)特異性捕捉分子是一種蛋白質(zhì)，它只和特定的 可激活受體元件的磷酸化同工型結(jié)合，而不結(jié)合該可激活受體元件的未磷酸化或者非磷酸 化的同工型。在另一實(shí)施方式中，激活態(tài)特異性捕捉分子是一種蛋白質(zhì)，它只和可激活受體 元件的胞內(nèi)同工型結(jié)合，而不結(jié)合胞外同工型，或者與此相反?？贵w中，有很多市售的產(chǎn)品能特異性結(jié)合一個(gè)蛋白質(zhì)的磷酸化同工型、但不和該 蛋白未磷酸化的同工型結(jié)合。為了研究能可逆地被磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，生產(chǎn)了很多 此類抗體。尤其是，生產(chǎn)出的很多此類能夠特異性與蛋白激酶的磷酸化、激活的同工型結(jié) 合的抗體，此處有時(shí)稱之為激酶激活態(tài)抗體或者其語義等效表達(dá)。在某些實(shí)施方式中， 本發(fā)明所使用的抗體包括抗下列物質(zhì)的抗體磷酸-P44/42 MAP激酶(Thr202/Tyr204)、 磷酸-TYK2 (Tyrl054/1055)、磷酸-p38 MAP 激酶(Thrl80/Tyrl82)、磷酸 PKC-PAN-底 物、磷酸-PKA-底物、磷酸-SAPK/JNK(Thrl83/Tyrl85)、磷酸-酪氨酸(P-tyr-100)、 p44/42 MAPK、磷酸-MEKl/2(Ser217/221)、磷酸-p90RSK(Ser381)、p38 MAPK、JNK/SAPK、磷 酸-Rafl (Ser259)、磷酸 Elk-1 (Ser383)、磷酸-CREB(Serl33)、磷酸-SEK1/MKK4(Thr261)、 磷酸-Jun (Ser 63)、磷酸-MKK3/MKK6 (Ser 189/207)、AKT、磷酸-FKHR、FKHR、磷酸 _Gsk3 alp21、pAFX、PARP、BAD、BADser 112、BADser 136、磷酸-BADser 155、p27、p21、cFLIP、抗 MYC、p53、NFKB, Ikka，、Ikk^、磷酸-酪氨酸和磷酸-蘇氨酸組合。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，這些抗體為單克隆抗體。在某些實(shí)施方式中，這些抗體被組合使用。本發(fā)明中也可以使用非激活態(tài)的捕捉分子，即對(duì)照捕捉分子。在特定的實(shí)施方式 中，非激活態(tài)的捕捉分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的激活態(tài)與未激活態(tài)形式的表位都能結(jié)合。 這樣的捕捉分子可以用來測定樣品中未激活態(tài)和激活態(tài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的總量。在另 一實(shí)施方式中，非激活態(tài)捕捉分子可結(jié)合呈現(xiàn)于受體的未激活態(tài)形式、但在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 蛋白激活態(tài)形式中消失的表位。這樣的捕捉分子可用來測定樣品中未激活態(tài)受體的數(shù)量。 這兩類非激活態(tài)受體都能用于測定，例如來自經(jīng)候選的生物活性試劑處理前后樣品的激活 態(tài)受體數(shù)量的變化，是否與未激活態(tài)受體數(shù)量的變化相一致。例如，此類捕捉分子可用于測 定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的激活的增強(qiáng)是否是由于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的未激活態(tài)被激活、或是 由于蛋白質(zhì)表達(dá)的提高、或是兩者都有。在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)照捕捉分子與可激活細(xì)胞 的不受信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活影響的表位結(jié)合。此處引為參考的待授權(quán)的美國專利申請(qǐng)U. S. Appl. No. 11/276，948進(jìn)一步舉例說 明了對(duì)照捕捉分子的用途。優(yōu)選的，對(duì)照捕捉分子可結(jié)合到激活態(tài)特異性捕捉分子所結(jié)合 的同一細(xì)胞上，盡管表位未被泛激酶激活劑激活。因此，例如在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中， 泛激酶激活劑可激活單核細(xì)胞上的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。激活態(tài)特異性抗體可檢測單核細(xì)胞中信 號(hào)通路的激活。CD14對(duì)所述泛激酶激活劑無響應(yīng)，因而可以用作對(duì)照捕捉分子的靶標(biāo)。因 此，所述測試方法可以檢測樣品中的單核細(xì)胞，以及其中哪些已被激活。應(yīng)當(dāng)理解，至少在 某些實(shí)施方式中，對(duì)照捕捉分子可以和不同的細(xì)胞結(jié)合。因此，舉例來說，在監(jiān)測單核細(xì)胞 激活時(shí)，抗淋巴細(xì)胞特異性捕捉分子可以用作捕捉分子。在多數(shù)實(shí)施方式中，對(duì)照捕捉分子和激活態(tài)特異性捕捉分子可被加入到“相同試 管”中。所述“相同試管”應(yīng)當(dāng)理解為它是同一個(gè)反應(yīng)容器，所述容器可以是試管、或微孔板 的加樣孔或相似容器。因此，對(duì)照捕捉分子和傳統(tǒng)的同型對(duì)照不同，它提供了測試細(xì)胞更為 真實(shí)的基線熒光評(píng)估。例如，在所測細(xì)胞為單核細(xì)胞的那些實(shí)施方式中，對(duì)照捕捉分子可以 與CD14結(jié)合，后者是不受激活影響的單核細(xì)胞標(biāo)記。這樣就允許進(jìn)行單核細(xì)胞群體熒光的 基線設(shè)定。當(dāng)那些細(xì)胞被激活后，熒光發(fā)生變化，變化的程度因而是對(duì)熒光的增強(qiáng)更為真實(shí) 的測量。因此，這些對(duì)照的使用提供了一個(gè)更好的減少所測細(xì)胞的背景熒光的方法。由于 蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)過去難以識(shí)別，定量更無從談起，因此對(duì)背景的控制對(duì)于本發(fā)明所述 方法整體的靈敏度很重要。因此，至少在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明觀察到的熒光強(qiáng)度的位移通常為平均熒光 強(qiáng)度增強(qiáng)10倍甚至更高。在其它實(shí)施方式中，熒光強(qiáng)度的位移為熒光強(qiáng)度增強(qiáng)20倍或更 高、30倍或更高、甚至50至100倍或更高。免疫分析使用捕捉分子和熒光標(biāo)記來對(duì)捕捉分子進(jìn)行定量的分析系統(tǒng)是公知的?？捎糜诒?發(fā)明的免疫分析方法的例子，包括但不局限于，熒光發(fā)光分析(FLA)、化學(xué)發(fā)光分析(CA)、 酶聯(lián)免疫吸光分析(ELISA)以及類似技術(shù)。參見，例如Blackwell于1996年出版Johnstone 和Thorpe著的《實(shí)用免疫化學(xué)》第三版(Blackwell Publishing，美國馬薩諸塞)；Ausbul 等人2003年編著的《分子生物學(xué)通用方案》(Wiley & Sons，美國新澤西)；Ghindilis等人 2003年編著的《免疫分析方法與方案》(Blackwell Publishing，美國馬薩諸塞)以及美國 專利公開號(hào)20030044865。免疫分析可以是固相分析、液相分析、以及相似情形。 在實(shí)施方式中，免疫分析可以設(shè)計(jì)為自動(dòng)的、高通量的儀器。例如貝克曼考爾特公司(Beckman Coulter, Inc.)的Access 系列儀器是公知的適用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述方法。 Access 免疫分析系統(tǒng)可通過使用反應(yīng)管加樣器實(shí)現(xiàn)多達(dá)每小時(shí)100個(gè)樣品的高通量分 析，可達(dá)到連續(xù)3小時(shí)樣品的處理。
在特定的實(shí)施方式中，使用流式細(xì)胞術(shù)來檢測熒光。也可以使用其它熒光檢測方 法，例如Quantum dot methods (參見，例如Goldman et al. , J. Am. Chem. Soc. (2002) 124 6378-82 ；Pathak et al.，J. Am. Chem. Soc. (2001) 123 4103-4 ；以及 Remade et al.，Proc. Natl. Sci. USA(2000) 18 :553_8，均并入本文作為參考)。對(duì)于固相免疫分析，捕捉分子(例如單克隆抗體)被固定到固定支持物上。通常， 固定化可以通過在測定步驟前按如下方法通過使捕捉分子不溶化、或者此后通過免疫沉淀 來實(shí)現(xiàn)或者吸附于非水溶性基質(zhì)或表面(U. S. Pat. No. 3，720, 760)；或非共價(jià)或者共價(jià)偶 聯(lián)(例如，用戊二醛或者碳二亞胺交聯(lián)，可以有或者沒有對(duì)支持物的預(yù)激活，如在U. S. Pat. No. 3，645，852 或 Rotmans et al. ;J. Immunol. Methods，57 :87_98 (1983))中描述的那樣使 用硝酸和還原劑)。用于固定化的固相可以是任何基本上不溶于水并可用于免疫法分析的惰性支持 物或者載體，包括例如下列形式的支持物表面、顆粒、多孔基質(zhì)等等。常用的支持物例子包 括小片，SEPHADEX 凝膠，聚氯乙烯，塑料珠，由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯及類似原料制成 的微孔板或者試管包括96孔板、以及特殊材料如濾紙、瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖和其它多糖。捕 捉分子也可被固定于基質(zhì)上，如聚合物珠、膠體金屬或者氧化鐵顆粒。珠子可以是塑料、玻 璃或任何其它合適的材料，典型地在1-20微米范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，可使用順磁性 珠子。膠體金屬顆粒如膠體金和銀顆粒以及氧化銀顆粒可以用多種不同的市售方法或者本 領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其它工藝來制備。可替代地，可以使用反應(yīng)活性的非水溶性基質(zhì)如溴化氫活化的碳水化合物和美國 專利申請(qǐng)?zhí)?3，969，287,3, 691，016,4, 195，128,4, 247，642,4, 229，537 及 4，330，440 中所述 的反應(yīng)活性的基質(zhì)來固定化捕捉分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，固定化的捕捉分子涂布在微孔 板上。另一個(gè)實(shí)施方式中，固相是一種可以同時(shí)分析數(shù)個(gè)樣品的多孔微孔板。固相用如上所述捕捉分子涂布，其可以按要求進(jìn)行非共價(jià)或者共價(jià)相互作用或者 物理聯(lián)接。形成附著的技術(shù)在美國專利申請(qǐng)?zhí)?，376，110及其參考文獻(xiàn)中有描述。如果用 共價(jià)方式，平板或者其它固相需與交聯(lián)劑和捕捉分子一起在文獻(xiàn)中公知的條件下孵育。通常用來使捕捉分子附著于固相基質(zhì)的交聯(lián)劑包括，例如1，1_雙(重氮乙 酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯，如帶有4-疊氮水楊酸的酯、同功雙功能酰 亞胺酯，包括琥珀酰亞胺酯比如3，3' - 二硫代二(丙酸琥珀酰亞胺酯)、和雙功能的馬來 酰亞胺如二-N-馬來酰亞胺-1，8-辛烷。衍生試劑如甲基-3-((對(duì)疊氮酚)-二硫)丙酰 亞胺可以產(chǎn)生可光激活的中間體，適用于光存在下形成交聯(lián)。涂布后的平板通常用封閉試劑處理，封閉試劑可非特異性地與未被占用的結(jié)合位 點(diǎn)結(jié)合并達(dá)到飽和，從而避免游離配體與平板孔上的過多位點(diǎn)之間形成不想要的結(jié)合。適 用于這一目的的封閉試劑的例子包括凝膠、牛血清白蛋白、蛋清蛋白、酪蛋白和脫脂奶。封 閉處理通常在室溫下進(jìn)行1-4小時(shí)，代表性地為1. 5到3小時(shí)。捕捉分子的用量足夠大，以得到和校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)相比較好的信號(hào)輸出，但與樣品中所 關(guān)注的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的最高期望水平相比通常不會(huì)摩爾過量。為達(dá)到充分的靈敏度，測試樣品量的添加應(yīng)使固定化的捕捉分子與樣品適當(dāng)稀釋后測試樣品中游離的待測分析 物的預(yù)期最大濃度相比達(dá)到摩爾過量。通常，選擇樣品和固定化捕捉分子的孵育條件，以使解離最小化從而使分析的靈 敏度最大化，并且確保樣品中存在足夠多的待測分析物，所述待測分析物可與固定化捕捉 分子結(jié)合。應(yīng)當(dāng)理解，最適反應(yīng)條件的選擇通常只需要常規(guī)的實(shí)驗(yàn)。孵育在基本恒定的溫度 下進(jìn)行，溫度范圍從0°c到40°C，通常為室溫，或室溫上下。孵育時(shí)間通常不超過10小時(shí)。 在添加了蛋白酶抑制劑以防止測試樣品中的蛋白酶降解待測信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的情況下， 孵育時(shí)間可以延長。本發(fā)明的方法本發(fā)明提供了在樣品中測定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的激活狀態(tài)的方法，包括使樣品中 被保存的白細(xì)胞中解掩蔽的胞內(nèi)表位與多個(gè)熒光標(biāo)記的捕捉分子接觸，所述多個(gè)熒光標(biāo)記 的捕捉分子含有至少兩個(gè)不同的捕捉分子，這些分子能與樣品中被保存的、激活的白細(xì)胞 中至少兩個(gè)不同的解掩蔽的胞內(nèi)表位的激活態(tài)相結(jié)合。在該實(shí)施方式中，被捕捉分子捕捉 到的被保存的、激活的白細(xì)胞可通過用上述免疫分析方法中的一種來檢測。在某些實(shí)施方 式中，熒光檢測可測出結(jié)合于激活態(tài)解掩蔽胞內(nèi)表位的帶標(biāo)記捕捉分子。被保存的白細(xì)胞 可用相似方法檢出。因此 ，在某些實(shí)施方式中，免疫分析可通過對(duì)照捕捉分子的結(jié)合性來檢 出被保存白細(xì)胞的熒光。當(dāng)使用本發(fā)明所述方法中的熒光標(biāo)記組分和本發(fā)明所述方法中的組合物時(shí)，將 會(huì)發(fā)現(xiàn)不同類型的熒光檢測系統(tǒng)，例如流式細(xì)胞術(shù)系統(tǒng)，可用來實(shí)施本發(fā)明。在一些實(shí)施 方式中，使用流式細(xì)胞術(shù)系統(tǒng)或用于高通量篩選的系統(tǒng)，如96孔板或者更高孔數(shù)的微孔 板。進(jìn)行熒光材料相關(guān)分析的方法是本領(lǐng)域公知的，并且在例如=Lakowicz, J.R.著的《熒 光波譜原理》(Plenum Press，美國紐約，1983) ；Herman, B.著的《共振能轉(zhuǎn)移顯微法》(出 自 Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, vol. 30, Taylor, D. L.禾口 Wang，Y. -L.編著，Academic Press，美國加利福尼亞， 1989，pp. 219-243) ；Turro, NJ.的《現(xiàn)代分子光化學(xué)》(Benjamin/Cummings Publishing Col, Inc.，1978，pp. 296-361)中有詳述。樣品中的熒光可以用熒光計(jì)測量。通常，由激發(fā)光源發(fā)出的具有第一波長的激發(fā) 光穿過激發(fā)光學(xué)裝置。激發(fā)光學(xué)裝置引起激發(fā)光來激發(fā)樣品。作為響應(yīng)，樣品中的熒光蛋 白發(fā)出波長不同于激發(fā)波長的發(fā)射光。采集光學(xué)裝置然后采集樣品所發(fā)射的光。所述裝置 可以包括溫度控制器使樣品在掃描過程中保持在特定溫度。根據(jù)一種實(shí)施方式，多軸轉(zhuǎn)換 臺(tái)移動(dòng)載有多個(gè)樣品的微孔板，從而使不同位置的孔都能被照射到。多軸轉(zhuǎn)換臺(tái)、溫度控制 器、自動(dòng)聚焦裝置以及與成像和數(shù)據(jù)采集有關(guān)的電子元件可以通過適當(dāng)?shù)臄?shù)字化計(jì)算機(jī)程 序來管理。所述計(jì)算機(jī)也可以把測試中采集到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成另一種形式。另一種實(shí)施方式中，捕捉分子，例如抗體，由類似于已知的、并在流式細(xì)胞術(shù)中用 來標(biāo)準(zhǔn)化的珠子進(jìn)行固定。可以用本領(lǐng)域已知技術(shù)和/或此處所述的方法將多個(gè)激活態(tài)特 異性捕捉分子附著到珠子上?？梢栽谠试S多個(gè)激活受體元件(如果有的話)結(jié)合于多個(gè)固 定化捕捉分子的條件下，將這些被共軛的微珠與樣品接觸，樣品優(yōu)選為細(xì)胞提取物?？梢韵?固定化的激活態(tài)特異性抗體_激活態(tài)受體分子復(fù)合物中加入第二批包括帶有獨(dú)特標(biāo)記的 非激活態(tài)特異性捕捉分子，并且珠子可以通過流式細(xì)胞術(shù)基于各個(gè)標(biāo)記的存在進(jìn)行分選， 其中標(biāo)記的存在指示相應(yīng)的第二捕捉分子的結(jié)合性以及相應(yīng)的被激活受體的存在。
一俟檢測完激活態(tài)特異性捕捉分子和對(duì)照捕捉分子的熒光后，就可以比較它們的 熒光。此處除非上下文表明另有含義，術(shù)語“相關(guān)聯(lián)”或“比較”或其語義等效表述可互換使 用。相關(guān)聯(lián)/比較意味著以任何一種方式對(duì)第一個(gè)分析的表現(xiàn)和/或結(jié)果與第二個(gè)分析的 表現(xiàn)和/或結(jié)果進(jìn)行比較。例如，正如下文詳細(xì)敘述的，經(jīng)受MAPK抑制劑處理的樣品中的 MAPK活性水平與未經(jīng)受同一抑制劑處理的另一樣品中的MAPK水平不同。通過確定特定的 活性水平，MAPK蛋白的活性可以作為特定疾狀況狀的指示劑或者預(yù)后的預(yù)報(bào)器，從而使活 性和疾病狀況狀態(tài)“相關(guān)聯(lián)”。在本文其它部分討論的疾病和病況中，疾病或病況可以表征 為當(dāng)暴露于泛激酶激活劑時(shí)激活應(yīng)答的缺失。相似地，本文其它部分描述了疾病或病況對(duì) 治療的響應(yīng)性可以通過評(píng)估不同捕捉分子的熒光以判定泛激酶激活應(yīng)答的重現(xiàn)性而確定。在另一個(gè)實(shí)施方式中，激 活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的熒光可以比照未激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑蛋白的熒光來評(píng)估。這樣的評(píng)估的目的在于可以分清激活的與未激活的樣品、或者激 活的樣品與標(biāo)準(zhǔn)化的參比樣品產(chǎn)生的熒光之間存在的差異。通常，這些評(píng)估包含二級(jí)關(guān)聯(lián) 步驟。在至少一些實(shí)施方式中，未激活的參比樣品是所用樣品的第二個(gè)等分試樣。在一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化參比樣品是未激活樣品在高度可重復(fù)條件下處理后的 預(yù)期熒光的生產(chǎn)商設(shè)定值。這些類型的標(biāo)準(zhǔn)化參比值預(yù)期用作數(shù)值的替代物，所述數(shù)值是 終端用戶運(yùn)行平行的未激活樣品所能得到的數(shù)值。這些標(biāo)準(zhǔn)化參比值的一個(gè)目的是，為終 端用戶實(shí)現(xiàn)勞動(dòng)效率，終端用戶不再需要運(yùn)行平行樣品并節(jié)約與運(yùn)行該平行樣品相關(guān)的勞 力和試劑成本。診斷試劑盒的生產(chǎn)商，如貝克曼考爾特公司，在對(duì)其試劑及試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化 參比值的制定上有豐富的經(jīng)驗(yàn)。本發(fā)明的免疫分析法提供了與本領(lǐng)域現(xiàn)有的測定法相比更高的特異性。特異性通 過有力的對(duì)照而實(shí)現(xiàn)。具體來講，在已有技術(shù)中，在特定細(xì)胞中進(jìn)行特定標(biāo)記物陽性細(xì)胞百 分比的測量。通常，細(xì)胞用一種抗體同型對(duì)照進(jìn)行染色。然后測量MAPK通路蛋白的信號(hào)并 將活性減去背景信號(hào)來報(bào)告活性。由于很多信號(hào)的強(qiáng)度很弱，且本性非常短暫，背景的高水 平使得這些分析方法無法用于臨床測試。本發(fā)明中，蛋白的胞內(nèi)表位通過清潔劑和醇處理 被解掩蔽。從而，內(nèi)標(biāo)以及不同活性的復(fù)合分布可確保特異性。在一個(gè)實(shí)施方式中，流式細(xì) 胞術(shù)采用側(cè)向和前向散射光與細(xì)胞表面標(biāo)記CD14的表達(dá)相結(jié)合來識(shí)別單核細(xì)胞。在進(jìn)一 步的實(shí)施方式中，測量未刺激和LPS刺激下MAPK蛋白的活性。該活性可以被報(bào)告為被刺激 的細(xì)胞與未被刺激的細(xì)胞的活性比例，或者信噪(S/N)比。這一比例提供了真實(shí)的基線測 量，并且?guī)椭鷾p少現(xiàn)有技術(shù)分析方法中不受歡迎的高背景水平。正如此前指出的，通過采用本發(fā)明所述方法，可以取得信噪比大于10。在其它實(shí)施 方式中，通過使用本處所述的方法能取得信噪比大于20、大于30、甚至大于50。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的多數(shù)實(shí)施方式中，信噪比可能根據(jù)所評(píng)估的信號(hào)通路蛋白的 不同而變化。因此，有些信號(hào)通路蛋白固有地會(huì)比其它蛋白產(chǎn)生較高的噪音。因此，在某些 實(shí)施方式中，一個(gè)一級(jí)信號(hào)通路蛋白取得例如信噪比約為10，而二級(jí)信號(hào)通路蛋白取得例 如信噪比約為20。正如上文舉例說明的，某些癌癥或者疾病以信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑信號(hào)蛋白的系統(tǒng)性激活 為特征。當(dāng)這些異常樣品用本發(fā)明所述方法表征時(shí)，該分析方法并不能分清未處理樣品和 泛激酶激活劑激活過的樣品。事實(shí)上，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑信號(hào)蛋白已經(jīng)處于激活狀態(tài)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及監(jiān)測給藥于患者的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白抑制劑的活性的方法。當(dāng)這些患者接受信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白抑制劑時(shí)，該抑制劑關(guān)閉或者減少活化狀態(tài) 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白。通常，測量來自患者或者測試樣品中的這些抑制劑的滴度，并繼續(xù)給 藥以維持其效力/效價(jià)。在再度給藥抑制劑前一刻，可以獲取患者樣品(或細(xì)胞樣品，用于 組織培養(yǎng)分析)，并且用本發(fā)明所述分析方法測試樣品中的白細(xì)胞。如果抑制劑對(duì)于疾病或 者病況的治療有效，那么該分析將顯示在正常的，即非帶病的樣品中觀察到的泛激酶響應(yīng) 的再現(xiàn)性。因此，本發(fā)明，至少其一種實(shí)施方式，提供了一個(gè)高效、靈敏的血液分析方法來監(jiān) 控以異常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白激活為特征的疾病或狀況的臨床治療的進(jìn)展。應(yīng)當(dāng)理解，特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)疾病或者狀況包括發(fā)炎、發(fā)熱、膿毒、癌癥、糖尿 病、和心力衰竭。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述狀況為膿毒癥。當(dāng)患者有膿毒癥時(shí)，導(dǎo)致膿毒情況的細(xì)菌所分泌的內(nèi)毒素會(huì)導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的 過度激活。這一過度激活在一些情況下導(dǎo)致患者死亡。在本發(fā)明的與膿毒檢測和/或監(jiān)測 有關(guān)的實(shí)施方式中，在按照本發(fā)明通常描述的方法處理后，膿毒患者的樣品對(duì)泛激酶激活 劑并不響應(yīng)。因此，在本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方式中，通過監(jiān)測對(duì)泛激酶激活劑的無響應(yīng)性 可以測出膿毒癥。膿毒癥通常通過對(duì)膿毒患者給藥抗生素制劑進(jìn)行治療。作為監(jiān)控膿毒患者臨床進(jìn) 展的一種方法，本發(fā)明所述分析方法可以被用來監(jiān)測泛激酶激活響應(yīng)的再次發(fā)生。因而，對(duì) 于膿毒癥患者，之前不顯示顯著的由泛激酶激活劑引發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白激活，應(yīng)當(dāng)理 解，當(dāng)患者的樣品開始顯示泛激酶引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白激活時(shí)，表明抗生素療法開始 對(duì)膿毒發(fā)揮作用了。在至少某些實(shí)施方式中，所述方法包括通過使用多個(gè)抗體，這些抗體可與多個(gè)受 體元件的活性的、磷酸化的同工型特異性結(jié)合，來同時(shí)測定多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的激活 型同工型的存在。本發(fā)明還提供了測定激酶激活的附加的方法。已知底物可被蛋白激酶特異性識(shí)別 并借此進(jìn)行磷酸化?？膳c這些磷酸化底物特異性結(jié)合而不與未磷酸化底物結(jié)合的抗體(磷 酸-底物抗體)可用于測定樣品中已激活的激酶的存在。通過使用本發(fā)明的某些實(shí)施方式，可以把信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的活性水平的變化與 很多疾病或狀況的預(yù)后相關(guān)聯(lián)，所述疾病或狀況包括但不局限于過敏、發(fā)炎、自體免疫或 瘤形成。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于測定單細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白激活狀 態(tài)分布型的方法。所述方法包括通過流式細(xì)胞術(shù)基于至少兩個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的激活狀 態(tài)進(jìn)行細(xì)胞分檢。激活態(tài)特異性抗體被用于基于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的激活狀態(tài)來細(xì)胞分 選。在特定的實(shí)施方式中，提供了用于測定單細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白激活狀態(tài)分布 的方法。所述方法包括提供一個(gè)細(xì)胞群并通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)該細(xì)胞群進(jìn)行分選。在特定的 實(shí)施方式中，細(xì)胞按照至少2個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的激活狀態(tài)進(jìn)行分離。在特定的實(shí)施方 式中，使用了多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的激活態(tài)抗體，以便同時(shí)測定多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白 的激活狀態(tài)。在特定的實(shí)施方式中，通過流式細(xì)胞術(shù)基于至少兩個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的激活狀 態(tài)進(jìn)行的細(xì)胞分選可和其它流式細(xì)胞術(shù)的可讀輸出值的確定相結(jié)合，其中所述輸出值是諸如表面標(biāo)記的存在、粒度、細(xì)胞大小等，從而提供多個(gè)受體元件的激活與單細(xì)胞的其它流式 細(xì)胞可讀性質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)。在某些實(shí)施方式中，利用細(xì)胞表面標(biāo)記CD14的存在來識(shí)別單核 細(xì)胞群體。本發(fā)明還可用來基于復(fù)合細(xì)胞混合物如外周血單核細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的受體元件激活， 來確定細(xì)胞子集的存在。這些子集可以代表不同的分化或者激活狀態(tài)，或者不同的細(xì)胞系 或者亞系。還應(yīng)認(rèn)識(shí)到，需要均一的細(xì)胞群用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究，以便細(xì)胞間的信號(hào)變化并 不定性和定量地掩蔽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生。單個(gè)細(xì)胞是均一系統(tǒng)的終極形式。本發(fā)明提供了用于 分析單個(gè)細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，其中涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體元件的激活態(tài)能抗原性地區(qū)別 于未激活態(tài)。這些方法還可用于在復(fù)合細(xì)胞群體比如外周血單核細(xì)胞或未處理的淋巴細(xì)胞和 記憶性淋巴細(xì)胞中，在人工和刺激條件下，不同信號(hào)層級(jí)的鑒定。在此提供的方法還可能涉及特定受體元件的特異性抑制劑的用途。在此提供的方 法還可能涉及信號(hào)通路的其它藥理學(xué)抑制劑的用途。這些抑制劑可以被用作對(duì)照，以確保 抗體特異性地結(jié)合受體元件的激活同工型。例如，已知可磷酸化并激活激酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑蛋白的抑制劑可被用于抑制所述激酶的磷酸化，并檢查抗體是否特異性識(shí)別該激酶的磷 酸化同工型。可替代地，所述抑制劑也能用于進(jìn)一步探查信號(hào)通路及蛋白活性的相關(guān)性，特 別是在單細(xì)胞中。在特定的實(shí)施方式中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的活性用兩種以上激活態(tài)特異性抗體來 測定。在使用兩種以上抗體的實(shí)施方式中，所用抗體被獨(dú)特地標(biāo)記，意味著識(shí)別第一個(gè)信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的第一個(gè)激活態(tài)抗體含有第一種標(biāo)記，而識(shí)別第二個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的第 二個(gè)激活態(tài)抗體含有第二種標(biāo)記，其中第一種和第二種標(biāo)記都可測得并可區(qū)分，造成第一 抗體和第二抗體被獨(dú)特標(biāo)記。第二個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的使用起到內(nèi)標(biāo)的作用，以確認(rèn)測 得活性的特異性。在某些實(shí)施方式中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的活性用3種以上激活態(tài)特異性捕捉分子 尤其是包括單克隆抗體進(jìn)行測定。在使用三種以上捕捉分子的實(shí)施方式中，所用抗體被獨(dú) 特地標(biāo)記，意味著識(shí)別第一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的第一個(gè)激活態(tài)捕捉分子含有第一種標(biāo) 記，識(shí)別第二個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的第二個(gè)激活態(tài)抗體含有第二種標(biāo)記，而識(shí)別第三個(gè)信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的第三個(gè)激活態(tài)捕捉分子含有第三種標(biāo)記，其中第一、二、三種標(biāo)記都可測 得并可相互區(qū)分，形成被獨(dú)特標(biāo)記的第一捕捉分子、第二捕捉分子和第三捕捉分子。應(yīng)當(dāng)理解，在評(píng)估多于一個(gè)、優(yōu)選多于兩個(gè)、一些實(shí)施方式多于三個(gè)的不同信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)途徑蛋白中，本發(fā)明所述方法提供了細(xì)胞對(duì)泛激酶激活劑的激活應(yīng)答的更高靈敏度。細(xì) 胞信號(hào)通路是復(fù)合系統(tǒng)，使用多種捕捉分子來捕捉多個(gè)通路蛋白的激活態(tài)，允許使用者能 設(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)來對(duì)這些信號(hào)通路進(jìn)行精確的測量和監(jiān)測。特別是包括它們對(duì)設(shè)計(jì)得旨在 控制信號(hào)蛋白激活狀態(tài)的治療劑的響應(yīng)。例如在下文所描述的LPS激活實(shí)驗(yàn)中，某些信號(hào) 蛋白對(duì)LPS激活隨時(shí)間進(jìn)程有著不同的響應(yīng)。因此，通過對(duì)一系列激活態(tài)蛋白的監(jiān)測，該系 統(tǒng)可以可靠地評(píng)估細(xì)胞在應(yīng)答疾病或者狀況下的激活狀態(tài)、以及因此這些接受所述疾病或 者狀況治療的細(xì)胞的激活狀態(tài)。盡管此處舉例涉及胞內(nèi)的磷酸一蛋白/表位，本發(fā)明所述方法同樣也可用于制備樣品用于測量其它轉(zhuǎn)錄后修飾例如泛素化、糖基化、甲基化、?；⒆貦磅；?、或蛋 白-蛋白相互作用。因此，本發(fā)明能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的無磷酸表位的測定，進(jìn)一步擴(kuò)展 所述方法的用途。帶標(biāo)記的結(jié)合試劑可以基于所研究的特定細(xì)胞活動(dòng)來作選擇。本發(fā)明提 供的方法允許檢測此前不能完成的細(xì)胞通路的詳細(xì)時(shí)間進(jìn)程以及通路特異性模式研究。雖 然可選擇不同的胞內(nèi)表位用于流式細(xì)胞分析，應(yīng)當(dāng)理解，使用者都能在綜合考慮所研究的 特定表位的各種相關(guān)因素，包括例如位置、構(gòu)型/結(jié)構(gòu)、抗體的存在、表位的穩(wěn)定性等等，來 優(yōu)化和調(diào)整此處提供的方法。在此提供的方法可通用于多顏色、多參數(shù)的細(xì)胞儀分析。在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)照細(xì)胞未經(jīng)LPS刺激。這些未刺激的細(xì)胞被用來提供刺 激的和未刺激的細(xì)胞之間信號(hào)水平的比值。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述比值是LPS激活與未 激活的細(xì)胞之間平均熒光強(qiáng)度的差異。另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)照細(xì)胞為未激活的單核細(xì)胞。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述比值為LPS激活的單核細(xì)胞與未激活的單核細(xì)胞之間平均熒光 強(qiáng)度的差異。通過使用有力的內(nèi)標(biāo)，MAPK蛋白活性的差異可以容易地直觀呈現(xiàn)，其允許使 活性與特定疾狀況狀之間相關(guān)聯(lián)。測試化合物候選試劑從很寬范圍的途徑獲得，正如本領(lǐng)域人員所了解的那樣，包括合成的或 天然的化合物文庫。正如本領(lǐng)域人員所了解的，本發(fā)明提供了一個(gè)快速簡便的方法，用來篩 選任何候選調(diào)節(jié)劑文庫，包括很寬范圍的已知組合化學(xué)文庫。在特定的實(shí)施方式中，提供了一種篩選能夠抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白活性的生物活 性試劑的方法，包括將細(xì)胞與推定的生物活性試劑接觸，并通過流式細(xì)胞術(shù)測定所述細(xì)胞 中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的激活。術(shù)語“推定的試劑”、“推定的抑制劑”、“推定的治療劑”或“推定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 抑制劑”是指任何分子，例如蛋白質(zhì)、小的有機(jī)分子、碳水化合物(包括多糖)、聚核苷酸、脂 質(zhì)、等等，它們可被評(píng)估以供判斷其在影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的信號(hào)上的能力。通常多個(gè)分析混合物可以采用不同的試劑濃度來平行進(jìn)行，以此獲得應(yīng)對(duì)不同濃 度的區(qū)別應(yīng)答。典型地，所述濃度中的一個(gè)用作陰性對(duì)照，即濃度為零或者低于檢測水平。 此外，還能用陽性對(duì)照。在至少一個(gè)實(shí)施方式中，推定的激酶抑制劑的效力通過將含有白細(xì)胞的樣品暴露 于推定的激酶抑制劑，以激活所述含白細(xì)胞樣品中至少一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中當(dāng)該樣品暴露 于泛激酶激活劑時(shí)可激活的蛋白，保存血樣，再將樣品中保存的白細(xì)胞的胞內(nèi)表位解掩蔽。 再通過把樣品中保存白細(xì)胞的解掩蔽胞內(nèi)表位與多個(gè)可檢測的帶標(biāo)記捕捉分子接觸，來檢 測樣品中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的激活態(tài)，所述多個(gè)捕捉分子包括至少兩個(gè)不同的能與血樣中 保存的、激活白細(xì)胞中兩個(gè)不同解掩蔽胞內(nèi)表位相結(jié)合的捕捉分子。在這一實(shí)施方式中，保 存的激活白細(xì)胞通過使用前文所述的免疫分析方式中的一種來檢測。在某些實(shí)施方式中， 熒光檢測可測定與激活態(tài)解掩蔽胞內(nèi)表位相結(jié)合的帶標(biāo)記的捕捉分子。保存的白細(xì)胞也相 似地被測定。因此，在某些實(shí)施方式中，免疫分析可檢測由于結(jié)合了對(duì)照捕捉分子而被捕捉 的保存的白細(xì)胞的熒光。在這一實(shí)施方式中，通常，有一個(gè)平行樣品在相同條件下被處理，但沒有暴露于推 定的激酶抑制劑。從被暴露于推定激酶抑制劑的細(xì)胞測得的熒光可以接著與從未處理樣品，即未暴 露于推定的激酶抑制劑的樣品，所測得的熒光進(jìn)行比較。在未處理樣品的情形中，泛激酶激活劑將激活可利用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，并且熒光的位移將被觀察到。然而，由于推定的抑制劑 有效地影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白激活，與對(duì)照樣品相比，熒光的位移或者觀察不到，或者位移 較不顯著。熒光位移被關(guān)閉或者減弱的程度與推定抑制劑的效率相關(guān)聯(lián)。應(yīng)當(dāng)理解，前面剛敘述的實(shí)施方式中，平行對(duì)照樣品的使用是可選的。推定的激酶 抑制劑的活性可以在同管分析方式中使用合適的對(duì)照來監(jiān)測。在至少一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了識(shí)別能影響核糖體S6通路激活的推定抑 制劑的方法。如實(shí)施例1所示，核糖體S6通路的激活需要同時(shí)抑制ERK和PI3K信號(hào)蛋白。 因此，當(dāng)鑒于所述分析旨在測試推定的ERK抑制劑時(shí)，將樣品暴露于推定的抑制劑和一個(gè) 已知的PI3K抑制劑，如LY294002。當(dāng)觀察到核糖體S6蛋白的激活受到影響時(shí)，推定的抑制 劑在影響ERK信號(hào)上是有效的。類似地，當(dāng)所述分析旨在測試推定的PI3K抑制劑時(shí)，將樣 品暴露于推定的抑制劑和一個(gè)已知的ERK抑制劑，如U0126。當(dāng)觀察到核糖體S6蛋白的激 活受到影響時(shí)，推定的抑制劑在影響PI3K信號(hào)上是有效的。顯然可以理解，核糖體S6通路并不是唯一的為了將整個(gè)通路關(guān)閉需要抑制多個(gè) 通路成員的通路。其它類似例子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，它們皆應(yīng)包含在本發(fā)明保護(hù)范 圍內(nèi)。推定的試劑包括大量化合物種類。在特定的實(shí)施方式中，候選試劑為小分子。在 另一個(gè)實(shí)施方式中，候選試劑為有機(jī)分子，特別是小有機(jī)分子，包含有為與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu) 相互作用所需的官能團(tuán)，特別是氫鍵，典型地至少包括氨基、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選為至少 2個(gè)化學(xué)官能團(tuán)。候選試劑經(jīng)常包括環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或被一個(gè)或多個(gè)化學(xué)官能團(tuán)取 代的芳香或聚芳香結(jié)構(gòu)。在特定的實(shí)施方式中，推定的試劑為合成化合物，如上所述，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白 相連。本方法的一個(gè)優(yōu)勢在于，無需在分析之前對(duì)候選試劑進(jìn)行表征。通過使用本發(fā)明所 述方法，任何候選試劑都能被篩選其調(diào)節(jié)(例如增強(qiáng)或減弱)可激活蛋白活性的能力?？商娲?，特定的實(shí)施方式使用天然化合物文庫作為推定的試劑，其形式有可購 買的或者方便制得的細(xì)菌的、真菌的、植物的和動(dòng)物的提取物。此外，天然或者合成方法制 備的候選庫和化合物可以方便地通過傳統(tǒng)化學(xué)、物理、生物化學(xué)方法被修飾。已知的藥理學(xué) 試劑可經(jīng)受定向的或者隨機(jī)的化學(xué)修飾包括酶法修飾，來制成結(jié)構(gòu)類似物。在特定的實(shí)施方式中，推定的試劑是由約2個(gè)到約50個(gè)、優(yōu)選約5個(gè)到約30個(gè)、 更優(yōu)選約8個(gè)到約20個(gè)氨基酸組成的肽。這些肽可以是如前所述的天然蛋白的消化物、隨 機(jī)肽、或“有偏的”隨機(jī)肽鏈。術(shù)語“隨機(jī)”是指每個(gè)核酸以及肽都分別由基本隨機(jī)的核苷 酸和氨基酸構(gòu)成。由于這些隨機(jī)肽(或者核酸)通常為化學(xué)合成，它們能在任意位置并入 任何核苷酸或者氨基酸。合成方法可設(shè)計(jì)成產(chǎn)生隨機(jī)的蛋白質(zhì)或者核酸，以允許形成序列 長度中所有或者大多數(shù)可能的組合，從而生成隨機(jī)化的候選生物活性蛋白類制劑庫。這樣的庫能提供一個(gè)隨機(jī)試劑的集合，其在結(jié)構(gòu)上的多樣性足以產(chǎn)生一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義上充分的多樣性范圍，以允許與特定的可激活蛋白相互作用。相應(yīng)地，一個(gè)相互作用文 庫必須足夠大，以使至少一個(gè)成員會(huì)具有這樣一個(gè)結(jié)構(gòu)該結(jié)構(gòu)能與可激活蛋白、或者涉及 該可激活蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中其它特定成分相互作用。盡管很難估量一個(gè)相互作用庫所 需要的絕對(duì)規(guī)模，大自然中提供的免疫應(yīng)答的啟示是多達(dá)IO7至IO8種不同抗體的多樣性 提供了至少一種組合能以充分的親和性與一個(gè)生物可能遭遇的大多數(shù)抗原進(jìn)行相互作用。已發(fā)表的各種體外篩選技術(shù)也顯示，庫的規(guī)模到IO7至IO8就足以找到對(duì)目標(biāo)具有親和性的 結(jié)構(gòu)。一個(gè)長度具有7到20個(gè)氨基酸的肽的所有組合的文庫，正如此處大體提出的，可以 達(dá)到207 (109)到202°個(gè)。因此，使用IO7到IO8個(gè)不同分子的文庫，現(xiàn)有方法允許從長度為 7個(gè)氨基酸的庫中得到理論上完整的相互作用庫中的一個(gè)“工作”子集，為202°的庫形式的 子集。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在所述方法中同時(shí)分析至少106、優(yōu)選至少107、更優(yōu)選至 少108、并且最優(yōu)選至少IO9個(gè)不同的序列。優(yōu)選的方法可將庫的規(guī)模及其多樣性最大化。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述庫被完全隨機(jī)化，沒有序列偏好或者任何位置的恒定。在 特定的實(shí)施方式中，所述庫是有偏的。也就是說，序列中的一些位置或者保持恒定、或者從 有限數(shù)量的可能性中選擇。例如，在特定的實(shí)施方式中，核苷酸或者氨基酸殘基在一個(gè)限定 的種類內(nèi)被隨機(jī)化，例如疏水性殘基、親水性殘基、空間偏向性(或大或小)殘基、傾向形成 半胱氨酸、方便交聯(lián)、用于SH-3結(jié)構(gòu)域的脯氨酸、用于磷酸化位點(diǎn)的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨 酸或者組氨酸等等，或者嘌呤等等。在特定的實(shí)施方式中，所述有偏向是指傾向于和已知類別的分子相互作用的肽或 者核酸。例如，當(dāng)候選試劑為肽時(shí)，已知很多胞內(nèi)信號(hào)發(fā)出由蛋白質(zhì)上的短區(qū)域與其它蛋白 質(zhì)通過小的肽結(jié)構(gòu)域相互作用來進(jìn)行。例如有研究顯示，HIV-I包膜胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域上的一個(gè) 短區(qū)域阻斷了細(xì)胞鈣調(diào)蛋白的作用。Fas的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域，該域顯示與黃蜂的黃蜂 毒素有同源性，可被限制于一小段肽區(qū)域，該肽區(qū)域具有誘導(dǎo)死亡的細(xì)胞凋亡或者G蛋白 誘導(dǎo)功能。蛙皮素，一種來自于非洲蟾蜍的天然肽，可能具有抗腫瘤、抗微生物的活性。蛋 白激酶C同工酶(β PKC)的短肽片段已顯示能阻斷非洲蟾蜍卵細(xì)胞受刺激后β PKC的核轉(zhuǎn) 位。而且，短的SH-3目標(biāo)肽已被用作SH-3蛋白特異性結(jié)合的偽底物。這里當(dāng)然僅羅列已 有的具備生物活性的肽中的幾個(gè)，這方面有大量文獻(xiàn)。因而，對(duì)于小分子肽在胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián) 中有活性的潛力已有很多先例。此外，也能使用任意數(shù)量分子的拮抗劑來作為候選抑制劑 的有偏隨機(jī)化的基礎(chǔ)。因此，許多分子或者蛋白結(jié)構(gòu)域適用于作為產(chǎn)生有偏隨機(jī)候選抑制劑的起點(diǎn)。已 知有大量小分子結(jié)構(gòu)域可賦予常見的功能、結(jié)構(gòu)或者親和性。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知， 氨基酸同源性弱的區(qū)域可以有強(qiáng)的結(jié)構(gòu)同源性。許多這些分子、結(jié)構(gòu)域、和/或相應(yīng)的一致 性序列是已知的，包括但不局限于SH-2結(jié)構(gòu)域、SH-3結(jié)構(gòu)域、普列克底物蛋白、死亡結(jié)構(gòu) 域、蛋白酶裂解/識(shí)別位點(diǎn)、酶抑制劑、酶底物、以及Traf。在特定的實(shí)施方式中，所述推定的抑制劑是一種多肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述 多肽是含有至少4-20個(gè)氨基酸的環(huán)狀肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽是一種催化惰性 的多肽。催化惰性的多肽實(shí)例有，包括但不局限于催化惰性的可激活蛋白，和，更具體的， 催化惰性的激酶(例如PI3K)或者胱天蛋白酶。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述候選的調(diào) 節(jié)劑是一個(gè)可激活蛋白的肽片段，其中所述肽片段包含的氨基酸序列為該可激活蛋白的全 長氨基酸序列中的部分序列。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，可以在同一時(shí)間進(jìn)行多個(gè)類型候選試劑的篩選，例如通過在本發(fā)明 所述方法中進(jìn)行各候選試劑的組合。從而，推定試劑的庫可以包含僅一種類型的試劑(即 肽)、或者多種類型(肽和有機(jī)試劑)。所述組合是指在能提升活性的條件下，在體外反應(yīng)混合物中或者體內(nèi)細(xì)胞中組合 各種不同組分，其中所述的活性應(yīng)當(dāng)能用已知方法或者本發(fā)明提供的方法(例如，抗體與相應(yīng)抗原或者可激活蛋白的同工型或者可激活蛋白的激活態(tài)相結(jié)合)測出。本分析方法為 非限定的應(yīng)當(dāng)理解，在此提出的分析方法的順序可以改變。但是，也應(yīng)當(dāng)理解，盡管此處給 出了不同的選擇(對(duì)于化合物、選定的性質(zhì)或者步驟的順序)，所述選擇都是單獨(dú)給出的， 并且每一個(gè)都可以獨(dú)立于此處提供的其它選擇而進(jìn)行。而且，本領(lǐng)域顯而易見的且已知的 能夠提高分析靈敏度的步驟也應(yīng)當(dāng)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可以有附加的清洗步驟、封閉
步馬聚等ο在特定的實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物或者細(xì)胞被置于96孔板或其它市售的多孔板 的加樣孔中。在可替代的實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物或細(xì)胞加至流式細(xì)胞儀。本發(fā)明可使用 的其它多孔板包括但不局限于384孔板和1536孔板。本發(fā)明當(dāng)然也可使用其它容器盛放 反應(yīng)混合物或者樣品。在為測定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的激活狀態(tài)或者活性、或者此類激活狀態(tài)或活性的抑 制而進(jìn)行的分析中，組分的添加可以在適合于待分析的活性的條件下，依次或者按照預(yù)先 確定的順序或者分組進(jìn)行。所述條件在此已有敘述，并為本領(lǐng)域所已知。在特定的實(shí)施方式中，發(fā)明所述方法包括液體處理組件的使用。液體處理系統(tǒng)可 包括含有任何數(shù)量構(gòu)件的自動(dòng)機(jī)械系統(tǒng)。此外，此處列出的任何或者所有步驟均可自動(dòng)化， 因此，舉例來講，系統(tǒng)可以完全或者部分自動(dòng)化。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，有很寬泛的組件品種可以使用，包括但不局限于一個(gè)或多個(gè)機(jī)械 臂；布置平板所用的平板管理器；用來從無交叉污染的平板的加樣孔上將封蓋移除或歸位 的自動(dòng)蓋或帽處理器；用一次性吸頭進(jìn)行樣品分配的吸頭裝置；用于樣品分配的可清洗吸 頭裝置；96孔加樣模塊；冷卻試劑架；微孔板加液器定位(可帶冷卻功能)；平板和吸頭的 疊置塔；以及計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。全自動(dòng)機(jī)械或者微流系統(tǒng)包括帶有高通量移液的自動(dòng)液體、顆粒、細(xì)胞以及生物 處理系統(tǒng)，可完成篩選應(yīng)用中的所有步驟。該系統(tǒng)包括液體、顆粒、細(xì)胞以及生物的操作比 如吸取、分配、混合、稀釋、清洗、精確的體積傳輸；移液器吸頭的取得和丟棄；以及由單次 樣品吸取進(jìn)行多次相同體積的重復(fù)吸取以供多次給液。這些操作均為無交叉感染的液體、 顆粒、細(xì)胞或者生物傳輸。在特定的實(shí)施方式中，使用對(duì)分析組分具有特異性的化學(xué)衍生的顆粒、平板、柱套 (cartridge)、小管、磁性粒子、或者其它固相基質(zhì)。微孔板、小管或者任何固相基質(zhì)的結(jié)合 表面包括非極性表面、高極性表面、改性葡聚糖涂布以提高共價(jià)結(jié)合性、抗體涂布、用于結(jié) 合融合蛋白或者肽的親和性介質(zhì)、表面固定的蛋白質(zhì)如重組蛋白A或G、核苷樹脂或涂層、 以及對(duì)本發(fā)明有用的其它基質(zhì)。在特定的實(shí)施方式中，在可升級(jí)的模塊化平臺(tái)上裝有對(duì)應(yīng)多孔板、多管、固定器、 柱套、迷你試管、深孔板、微量離心管、凍干管、方孔板、過濾器、芯片、光纖、珠子、及其它固 相基質(zhì)的平臺(tái)或者具有不同體積的平臺(tái)以提供額外的處理能力。該模塊化平臺(tái)包括一個(gè)變 速軌道振動(dòng)器、提供樣品來源的多位置工作臺(tái)、樣品和試劑稀釋、分析平板、樣品和試劑貯 液器、移液器吸頭、以及一個(gè)活動(dòng)的清洗站。在特定的實(shí)施方式中，帶有一個(gè)或多個(gè)磁性探針、親和性探針的可互換移液器頭 (單道或者多道)或者吸液管可自動(dòng)地操作液體、顆粒、細(xì)胞、以及生物。多孔或者多管磁性分離機(jī)或者平臺(tái)以一個(gè)或者多個(gè)樣品的形式來操作液體、顆粒、細(xì)胞、以及生物。用所公開的分析方法識(shí)別的化合物有潛力用于治療多種疾病狀態(tài)，包括過敏、自 體免疫以及瘤形成。此類化合物的用量應(yīng)當(dāng)是能對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白產(chǎn)生期望的抑制程度 的用量，通常在0.001和10000 μ M之間。試劑盒為方便使用，本發(fā)明所述方法可以以試劑盒的方式提供。這樣的試劑盒是包裝好 的組合，包括的基本要件有(a) —種泛激酶激活劑；(b)可與至少一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白 相結(jié)合的至少一種捕捉分子；以及(c)關(guān)于如何使用這些試劑進(jìn)行本發(fā)明方法的說明。在 特定的實(shí)施方式中，所述試劑盒包含能與至少兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白結(jié)合的至少兩種捕捉 分子。在特定的實(shí)施方式中，所述試劑盒包括能與至少三種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白結(jié)合的至少 三種捕捉分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒能進(jìn)一步地提供信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白的抑制劑。這 些抑制劑可用于確認(rèn)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白抑制劑對(duì)于目標(biāo)蛋白的特異性，并且并不普遍地 抑制細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)功能。在特定的實(shí)施方式中，所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑是MAPK通路蛋白 抑制劑。多個(gè)MAPK通路蛋白抑制劑已有市售，包括但不局限于U0126、Ly294002、AZD6244、 PD0325901、XL518、寄端霉素、炭疽致死因子、RAF265、PLX4032、XL281、Bay 43-9006、和 ZarnestrBo在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包括用于捕捉分子的固相支持物，該支 持物可以單獨(dú)提供，也可以呈捕捉分子已固定化于其上的元件形式提供。因此，試劑盒中的 捕捉分子或者可以已經(jīng)固定化在固相支持物上，或者可以變得固定化到試劑盒中所包含的 支持物上、或者從試劑盒外單獨(dú)提供的固定物上。所述捕捉分子可標(biāo)記有酶，所述試劑盒通 常包括該酶所需要的底物和輔因子，標(biāo)記可以是熒光團(tuán)、提供可檢測發(fā)色團(tuán)的染料前體，標(biāo) 記也可以是單獨(dú)的或者共軛于發(fā)色團(tuán)的生物素、親和素例如親和素、鏈霉親和素。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括一份說明書，描述如何用試劑盒進(jìn)行分析。實(shí)施例實(shí) 施例1 全血樣品中LPS激活MAPK信號(hào)的方案將100 μ 1的血樣加入12X75mm的試管的地步。用棉簽除去試管壁上的血以消除 可能由未固定細(xì)胞導(dǎo)致的潛在的樣品污染。在激活管中加入IOOng脂多糖(LPS)(向?qū)φ?管中加入相同體積的磷酸鹽緩沖液(PBS))，并把試管放入37°C水浴。經(jīng)過不同的孵育時(shí)間后(例如1分鐘到60分鐘)，從孵育箱中取出第一管，向管中 加入65μ1的10%甲醛?；旌显嚬埽⒎诺皆嚬芗苌?，室溫孵育。經(jīng)過精確的10分鐘甲醛 孵育后，向各管中加入Iml溶解/透化緩沖液(500ml PBS中加入585 μ ITriton Χ-100的 10%母液，成為0. 1165%的Triton Χ-100溶液，室溫暗處存放，使用前預(yù)熱至37°C )，劇烈 震蕩后放回試管架。室溫孵育15分鐘。向各管中加入2ml冷的清洗緩沖液(加有4% FBS的含或不含Ca++/Mg++的PBS， 0.22 4!11過濾器無菌過濾，4°0。各管在500X g下離心4分鐘。從離心機(jī)中取出各管，抽 出上清液。向各管中加入Iml冷的(4°C)50%甲醇并震蕩。所有試管在冰浴中放置10分 鐘。然后將各管在500X g下離心4分鐘，抽出上清液。向各管中加入2ml冷(4°C )的 清洗緩沖液。各管在500X g下離心4分鐘。從離心機(jī)中取出各管，抽出上清液。加入抗體和冷的清洗緩沖液至終體積為100 μ 1，室溫孵育30分鐘。加入2ml冷(4°C )的清洗緩沖液，混合后離心。將細(xì)胞重懸浮于Iml的清洗緩沖液，震蕩并在流式細(xì)胞 儀上進(jìn)行分析。使用上述技術(shù)，發(fā)現(xiàn)未被刺激的全血以基礎(chǔ)水平表達(dá)MAPK通路的幾個(gè)成員，包括 p38、SAPK/JNK、以及ERK(圖2)。當(dāng)相似樣品經(jīng)過LPS孵育時(shí)，與未刺激的對(duì)照相比，MAPK 通路的激活相當(dāng)顯著(圖3)。使用本發(fā)明所述方法，追蹤了 LPS刺激隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué) (圖4-6)。在此，ERK于LPS在37°C刺激2分鐘后顯示了最早的激活，早于JNK或者p38的 激活(圖4)。受LPS在37 °C刺激6分鐘后，初始的ERK活性出現(xiàn)減弱(圖5)。在此后的時(shí) 間點(diǎn)(約10分鐘)，p38、JNK和ERK增加。在LPS激活60分鐘后，所有3個(gè)MAPK通路的活 性都已減弱，但未回到基線水平(圖6)。如果添加補(bǔ)充的LPS，不同的MAP激酶顯示特殊的 標(biāo)志性應(yīng)答模式。LPS刺激還顯示了抑制核糖體S6蛋白磷酸化的模式(圖7)。核糖體S6蛋白的磷 酸化發(fā)生在氨基酸Ser235、Ser240、Ser244、以及Ser247上。磷酸化的抑制在同時(shí)添加ERK 通路抑制劑(例如U0126)和PI3K抑制劑(例如LY294002)后能觀察到，表明必須同時(shí)抑 制ERK和Akt通路才能避免LPS誘導(dǎo)的核糖體S6蛋白激活(圖8)。這些實(shí)驗(yàn)顯示，全血的 LPS刺激能提供一個(gè)快速、實(shí)用的技術(shù)來監(jiān)測所有3個(gè)MAPK通路，以及PI3K (Akt)和NF κ B 的激活。詳細(xì)來說，本方法提供了一種測量用藥物(例如分子靶向性信號(hào)通路抑制劑)在 體內(nèi)和體外對(duì)這些通路進(jìn)行抑制的手段，并提供了一種方法來監(jiān)控接受特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 抑制劑的體內(nèi)治療的患者中單核細(xì)胞(作為替代目標(biāo))的功能活性。實(shí)施例2:基于流式 細(xì)胞術(shù)的膿毒分析本研究中，同時(shí)測量了 4個(gè)不同的信號(hào)磷酸一表位包括P-ERK、P_p38 MAP激酶、 P-SAPK(應(yīng)激激活性蛋白激酶)、以及P-S6核糖體蛋白(新的多肽合成的一種度量)。本分 析方法在“未處理的”全血和先行暴露于LPS激活(“重激活”)的全血樣品中采用了 LPS激 活的時(shí)間過程測量。本分析還使用了前面所述的固定和透化方法來測量細(xì)胞表面(以CD14 識(shí)別單核細(xì)胞)和胞質(zhì)的或者核內(nèi)的磷酸_表位(P-ERK、P-p38、P-SAPK和P-S6。本分析 還使用了內(nèi)部陰性對(duì)照來分析數(shù)據(jù)，依賴于群體，而非同型對(duì)照，并且測量MFI (平均熒光 強(qiáng)度)的變化而不是陽性的百分比。下面為本研究的獲得的各單獨(dú)標(biāo)記的結(jié)果，還有對(duì)本研究中標(biāo)記的使用和所用分 析方法的改良。P-ERK 如圖9所示，在正常樣品(未先行暴露于LPS)中，LPS誘導(dǎo)了 ERKMAP激酶 的快速激活，特征為一個(gè)早期峰，P-ERK的降低，和LPS刺激10-15分鐘后的第二峰。P-ERK 第二峰的出現(xiàn)與P-P38和P-SAPK達(dá)到最高水平的時(shí)間相同?？梢韵嘈?，第一個(gè)P-ERK峰是 由PI3激酶推動(dòng)，而第二峰則可能通過經(jīng)典的由TLR4引起的MAPKKK > MAPKK > MAPK通路 推動(dòng)。當(dāng)再暴露于LPS時(shí)(圖10)，P-ERK的MFI與0時(shí)刻的對(duì)照相比，直至LPS再刺激90 分鐘內(nèi)都沒有顯著的變化。P-p38 在來自正常供體的未刺激全血樣品中約有10-15%的單核細(xì)胞(⑶14+)表 達(dá)P-p38(圖11，左上)。經(jīng)過初始LPS刺激后，全部單核細(xì)胞群體(約100% )顯示了 MFI 的顯著增強(qiáng)，應(yīng)答在LPS刺激15分鐘后達(dá)到MFI的最高值。P-p38的水平并不返回基準(zhǔn)水 平，甚至持續(xù)到120分鐘后，顯示出了圖11左下圖所示的雙峰分布。約有50%的單核細(xì)胞 保持了與初始應(yīng)答15分鐘后所見相同的MFI，而其余則顯示了在未刺激樣品中多數(shù)細(xì)胞的MFI，導(dǎo)致在陽性和陰性群體之間合計(jì)的MFI。LPS再度刺激后，MFI值增加，在刺激15-20分 鐘后達(dá)到峰值，此后又回歸到在初始LPS應(yīng)答90-120分鐘后所看到的雙峰群。PzSg 在正常個(gè)體中，未刺激單核細(xì)胞中P-S6處于低水平，約10%的單核細(xì)胞顯 示出不同種類的陽性P-S6表達(dá)(圖12，左上)。LPS刺激15-30分鐘后，P-S6水平達(dá)到峰 值，與其作為P-ERK激活的次級(jí)下游激活相一致。不同于P-ERK和P-p38，P-S6水平在LPS 刺激后持續(xù)了超過120分鐘(圖12，左下)。LPS再度激活后，P-S6群體的MFI幾乎沒有變 化，而MFI緩慢減弱，如圖12右下圖所示。P-SAPK =P-SAPK的水平在初始LPS激活后會(huì)提高，15分鐘后達(dá)到峰值。與P_p38 的水平相似，直至刺激120分鐘后，P-SAPK水平仍未回到基準(zhǔn)水平，顯示出還有30-40%的 P-SAPK陽性單核細(xì)胞，合計(jì)的MFI反應(yīng)了陰性和陽性群體的百分值和熒光強(qiáng)度的綜合值。前文描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)理解，這些僅為提供的實(shí)施例，而不是用 于進(jìn)行限制。相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯然在不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，就可以對(duì) 這些方式進(jìn)行各種形式上和細(xì)節(jié)上的改變。因此，本發(fā)明的廣度和范圍不應(yīng)當(dāng)限定于上面 描述的示范性實(shí)施方式，而應(yīng)當(dāng)根據(jù)下列權(quán)利要求及其相同意義來確定。
權(quán)利要求
1.一種測定在含有白細(xì)胞的樣品中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑信號(hào)蛋白的激活狀態(tài)的方法，包括a)將含有白細(xì)胞的樣品暴露于泛激酶激活劑，以激活該樣品的白細(xì)胞中的至少一種信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的可激活蛋白；b)用保存劑保存激活后的樣品；c)將所述樣品中被保存白細(xì)胞的胞內(nèi)表位解掩蔽；d)使被保存的白細(xì)胞中解掩蔽的胞內(nèi)表位與多個(gè)經(jīng)熒光標(biāo)記的捕捉分子相接觸，所述 多個(gè)捕捉分子包括至少兩種不同的捕捉分子和至少一種對(duì)照捕捉分子，所述至少兩種不同 的捕捉分子能結(jié)合至所述樣品中被保存、被激活的白細(xì)胞中至少兩個(gè)不同的解掩蔽的胞內(nèi) 表位的激活態(tài)，其中所述對(duì)照捕捉分子可結(jié)合至位于被保存的白細(xì)胞上未被泛激酶激活劑 激活的表位上；e)檢測由于所述捕捉分子結(jié)合至解掩蔽胞內(nèi)表位的激活態(tài)而捕捉到的被保存、被激活 的白細(xì)胞的熒光性；f)檢測因所述對(duì)照捕捉分子結(jié)合而捕捉到的被保存的白細(xì)胞的熒光性；以及g)比較由所述捕捉分子捕捉的被保存、被激活的白細(xì)胞所檢測到的熒光性和由所述對(duì) 照捕捉分子捕捉的被保存的白細(xì)胞所檢測到的熒光性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括h)將步驟g)中測得的熒光比較相對(duì)于在未激活的參比樣品中測得的熒光比較進(jìn)行評(píng)估。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述未激活的參比樣品是所述樣品的第 二個(gè)等分試樣。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述未激活的參比樣品是標(biāo)準(zhǔn)化的參比樣品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述激活持續(xù)進(jìn)行約1分鐘到約10分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述激活至少持續(xù)約30分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述樣品來自患者，當(dāng)激活的和未激活的 樣品的熒光性大致相當(dāng)時(shí)，對(duì)熒光性的評(píng)估指示所述患者患有與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的疾病或者 狀況。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的疾病或者狀況為 炎癥、自體免疫、過敏、發(fā)熱、膿毒、癌癥、糖尿病、或者心力衰竭。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)疾病或狀況為膿毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括對(duì)取自已經(jīng)接受過治療劑以 治療炎癥、發(fā)熱、膿毒、癌癥、糖尿病、或者心力衰竭的患者的樣品重復(fù)所述步驟a)到g)，并 通過監(jiān)控在激活的與未激活的樣品之間所檢測到的熒光的變化來監(jiān)測所述治療劑的效力。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述樣品來自于接受激酶抑制劑的患者。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，當(dāng)確定被檢測的激活與未激活樣品之 間的熒光性有變化時(shí)，所述熒光比較的評(píng)估指示所述激酶抑制劑對(duì)于治療與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān) 的疾病或者狀況是有效的。
13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述樣品已被暴露于推定的激酶抑制劑，并且所述方法進(jìn)一步包括當(dāng)被激活的樣品不呈現(xiàn)所述至少一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的可激 活蛋白的熒光變化時(shí)，確定所述激酶抑制劑的效力。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述推定的激酶抑制劑為推定的ERK或 者PUK抑制劑，所述方法進(jìn)一步包括監(jiān)測核糖體S6的抑制，其中核糖體S6抑制所需的ERK 和PII的抑制通過下列方式實(shí)現(xiàn)i)將所述樣品暴露于已知的ERK抑制劑和推定的PII抑制劑并監(jiān)測核糖體S6的抑 制；或者 )將所述樣品暴露于已知的PII抑制劑和推定的ERK抑制劑并監(jiān)測核糖體S6的抑制。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括測量至少一個(gè)第二信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 的活性。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述胞內(nèi)表位包括磷酸化表位。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述解掩蔽包括使被固定的細(xì)胞與醇和 清潔劑相接觸。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述醇的添加濃度在約25%到約90% 之間。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述醇選自下組乙醇和甲醇。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述保存劑為甲醛、多聚甲醛、或者福爾 馬林。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述清潔劑的濃度在約0.到約10% 之間。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述清潔劑選自下組=TritonX-100、 Nonidet P-40 (NP-40)以及 Brij-58。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)來完成。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白選自下組PI3K、 核糖體 S6 蛋白、p44/42 MAP 激酶、TYK2、p38 MAP 激酶、PKC、PKA、SAPK、ELK、JNK、cJun、RAS、 Raf、MEK 1/2、MEK 3/6、MEK 4/7、ZAP-70、LAT、SRC、LCK、ERK 1/2、Rsk 1、PI2、SYK、PDKl、 GSK3、FKHR、AFX、PLCg、PLCy, FAK, CREB, α ΠΙ β 3、Fc ε RI、BAD、p70S6K、STATU STAT2、 STAT3、STAT5、STAT6及它們的組合。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白是P38和ERK和 PI3K或核糖體蛋白S6。
26.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其特征在于，所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白是P38、ERK和 核糖體蛋白S6。
27.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其特征在于，其中第一蛋白是JNK，第二蛋白是核糖 體S6。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述泛激酶激活劑是一個(gè)toll樣受體 4(TLR4)激活劑或脂多糖(LPS)。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕捉分子是抗體或其抗原結(jié)合片段。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其特征在于，所述抗體對(duì)于所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白 的磷酸化狀態(tài)具有特異性。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述磷酸化狀態(tài)特異性抗體選自下組 抗-磷酸-p44/42 MAP 激酶(Thr202/Tyr204)、抗-磷酸-TYK2 (Tyrl054/1055)、抗-磷 酸-p38 MAP激酶CThrl80/Tyrl8》、磷酸-PKC-PAN底物抗體、磷酸-PKA-底物抗體、抗-磷 酸-SAPK/JNK(Thrl83/Tyrl85)、抗-磷酸-酪氨酸(P-tyr-100)、抗-p44/42 MAPK、抗-磷 酸-MEK1/2 (Ser217/221)、抗-磷酸-p90RSK (Ser381)、抗-p38 MAPK、抗-JNK/SAPK、抗-磷 酸-Rafl (Ser259)、抗-磷酸-Elk-I (Ser383)、抗-磷酸-CREB (Ser 133)、抗-磷酸-SEKl/ MKK4 (Thr261)、抗-磷酸-Jun (Ser 63)、抗-磷酸-MKK3/MKK6 (Ser 189/207)、抗-AKT、 抗-磷酸-FKHR、抗-FKHR、抗-磷酸 _Gsk3 alp21、抗-pAFX、抗-PARP、抗-BAD、抗-BADser 112、抗-BADser 136、抗-磷酸-BADser 155、抗-p27、抗-p21、抗-cFLIP、抗 MYC、抗-p53、 抗-順1 、抗-11^0、抗-Ilck β、抗-磷酸-酪氨酸以及抗-磷酸-蘇氨酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記選自下組化學(xué)發(fā)光標(biāo)記 和FRET標(biāo)記。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品為全血。
34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品包括從全血樣品中分離出的白 細(xì)胞。
35.一種用以監(jiān)測信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活狀態(tài)的試劑盒，其包括a)泛激酶激活劑；以及b)至少兩種不同的捕捉分子，它們能和至少一個(gè)選自下組的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白相結(jié) 合P38、ERK、PI3K、JNK以及核糖體S6，其中至少一種捕捉分子可與PI3K、JNK相結(jié)合，或者 與核糖體S6相結(jié)合。
36.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，其特征在于，所述泛激酶激活劑是toll樣受體4 激活劑或者LPS。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，其特征在于，至少一個(gè)捕捉分子可與PI3K、JNK或 者P38結(jié)合，而另一個(gè)捕捉分子可與核糖體S6結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于測定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑信號(hào)蛋白的方法和試劑。本領(lǐng)域需要一種能準(zhǔn)確檢測信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑在患者體內(nèi)效率的測試方法，也需要其它檢測和監(jiān)控一些與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑信號(hào)蛋白的異?；罨嘘P(guān)的疾病或紊亂的方法。本發(fā)明提供了一種高靈敏度的分析方法，該方法還可用于難以在其體內(nèi)獲得大量樣品的患者群體例如新生兒。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102144161SQ200980135080
公開日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2009年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月4日
發(fā)明者T·文森特·尚奇, 戴維·赫德利, 蘇珊·喬 申請(qǐng)人:大學(xué)健康網(wǎng)絡(luò), 貝克曼考爾特公司