重組ulp1激酶的編碼序列、編碼蛋白、含有該編碼序列的質(zhì)粒、及重組ulp1激酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組ULP1激酶的編碼序列、編碼 蛋白、含有該編碼序列的質(zhì)粒、及重組ULP1激酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多肽或者蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的融合表達是非常常見的技術(shù)，但是為了將目的多 肽或者蛋白從融合蛋白中釋放出來，往往需要使用價格不菲的蛋白激酶或者利用內(nèi)含肽的 自斷裂。內(nèi)含肽的自斷裂對目的多肽的N端或C端的第一個氨基酸有偏好性，且斷裂效果 不穩(wěn)定，因此目前主要是使用各類蛋白激酶來切割融合蛋白，從而釋放出目的多肽（蛋白 質(zhì)）。
[0003] 目前常見的切割融合蛋白的蛋白激酶有凝血酶，因子10蛋白，腸激酶，TEV激酶， PreScission激酶，TAGZyme激酶，HRV3C激酶，ULP1激酶。不過考慮到切割產(chǎn)物是否會產(chǎn)生 多余氨基酸、切割效率、以及切割位點的特異性這三方面因素，我們發(fā)現(xiàn)只有腸激酶與ULP1 激酶符合該條件。腸激酶是識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys結(jié)構(gòu)，而ULP1激酶卻是識別100個 氨基酸的SUM0標(biāo)簽形成的二級結(jié)構(gòu)，因此ULP1激酶具有更好的切割特異性。同時SUM0標(biāo) 簽除了作為ULP1激酶的切割識別位點，也可以做為助溶標(biāo)簽使用，可以減小整個融合蛋白 的長度。綜合以上的結(jié)論，我們認(rèn)為ULP1激酶是目前為止最優(yōu)的蛋白切割酶類，具有最好 的切割活性以及切割位點的特異性。通過調(diào)研國內(nèi)相關(guān)專利，我們發(fā)現(xiàn)國內(nèi)還沒有ULP1激 酶制備的相關(guān)專利。國外相關(guān)文獻中，雖然有相關(guān)報道，但是其制備工藝較為復(fù)雜而且純度 較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組ULP1激酶的編碼序列、編碼蛋 白、含有該編碼序列的質(zhì)粒、及重組ULP1激酶的制備方法。
[0005] 為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0006] 所述重組ULP1激酶的編碼序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 所述質(zhì)粒含有SEQ ID NO. 1所示的編碼序列，優(yōu)選地，所述質(zhì)粒為p⑶-ULP1，其全 序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0008] 所述蛋白序列如SEQIDNO. 3所示。
[0009] 所述重組ULP1激酶的制備方法包括如下步驟：
[0010] (1)根據(jù)大腸桿菌密碼子使用偏好，對ulpi(4〇3 621)這部分蛋白所對應(yīng)的編碼基因 進行優(yōu)化，優(yōu)化設(shè)計并合成后的編碼序列如SEQIDNO. 1所示；將SEQIDNO. 1所示的序列 通過酶切方式接入表達載體pCold-II，得到質(zhì)粒pCD-ULPl;
[0011] 通過分析國內(nèi)外文獻，我們發(fā)現(xiàn)來自于釀酒酵母的ULP1激酶一共含有621個氨基 酸，但是只需要保留403-621這一區(qū)域的氨基酸，即可保留該激酶對SUM0標(biāo)簽的特異性識 別與切割活性，本發(fā)明所涉及的ULP1激酶制備均是指403-621這部分活性區(qū)域的制備；
[0012] (2)將質(zhì)粒pCD-ULPl轉(zhuǎn)入大腸桿菌，37°C倒置培養(yǎng)過夜；
[0013] (3)挑取單菌落至505培養(yǎng)基，于37°C條件下進行種子培養(yǎng)7-9h;
[0014] (4)將種子培養(yǎng)基接入5052培養(yǎng)基，接種量為(λ08-L2%，于16-37°C誘導(dǎo)培 養(yǎng)16 - 72h后離心收集菌體；
[0015] (5)將收集的菌體超聲破碎后過鎳柱純化：首先過PBS平衡鎳柱，然后用咪唑洗脫 重組的ULP1激酶，再將洗脫出的重組ULP1激酶脫鹽并收集保存。
[0016]優(yōu)選地，步驟（2)所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)，也可以為其他本領(lǐng)域常用 的其他菌種。
[0017] 步驟（3)種子培養(yǎng)時的搖床轉(zhuǎn)速為220rpm。
[0018] 步驟⑷所述離心條件是4°C、5000rpm、離心30min。
[0019] 所述步驟（5)是將收集的菌體用PBS懸浮，然后將懸浮的菌體在功率30%、開5s 停12s條件下超聲破碎30min，再將破碎后的菌體于4°C、15000rpm條件下離心30min后過 鎳柱純化。所述咪唑洗脫是用50mM咪唑和200mM咪唑各洗脫一次后再用400mM咪唑洗脫； 然后將洗脫液加入超濾管中，于4°C、5000rpm條件下離心30min進行脫鹽。
[0020] 上述 505 與 5052 培養(yǎng)基配方參見ProteinExprPurif41，207-234. (2005)。
[0021] 本發(fā)明中所涉及的其他各種實驗操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)操作技術(shù)，文中沒有特 別說明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請日之前的各種常用工具書、科 技文獻或相關(guān)的說明書、手冊等加以實施。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0023] 通過使用自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基與含有cspA啟動子的表達載體相結(jié)合的異源表達方 法，實現(xiàn)對UPL1蛋白的高活性的重組表達以及高純度的富集。該方法在誘導(dǎo)UPL1基因表 達時，無需監(jiān)測〇D6。。（常規(guī)技術(shù)中，一般是菌生長到0D值在0. 6附近時加入IPTG進行誘導(dǎo)。 而本發(fā)明由于使用自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基，既不需要檢測誘導(dǎo)時間，也不需要人工在特定時間點 加入誘導(dǎo)物），最后能夠通過一步法獲得純度在90%以上的UPL1蛋白。同時該方法在16度 至37度這個溫度范圍內(nèi)對ULP1蛋白均有穩(wěn)定的表達效果，且最終產(chǎn)量均在15mg/L以上。 純化的ULP1蛋白具有高活性：lul酶在30°C條件下能夠切割5ug底物，能夠在比較寬泛的 條件下有效的將底物切割。
【附圖說明】
[0024] 圖1為質(zhì)粒pCD-ULPl結(jié)構(gòu)示意圖；
[0025] 圖2為不同溫度下重組ULP1激酶的表達分析；其中，圖A為ULP1在37度下進行 誘導(dǎo)表達；M，表示的是蛋白marker;泳道1，505培養(yǎng)基的菌體（未誘導(dǎo)組）；泳道2, 5052培 養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌體（誘導(dǎo)組）；泳道3,超聲破碎后離心得到的上清；泳道4,超聲破碎后 離心得到的沉淀；泳道5,流穿鎳柱后得到的濾液；泳道6, 200mM咪唑沖洗鎳柱所洗脫的蛋 白；泳道7, 200mM咪唑沖洗后再用400mM咪唑洗脫得到的蛋白樣品；圖B為ULP1在16度 下進行誘導(dǎo)表達;M，表示的是蛋白marker;泳道1，505培養(yǎng)基的菌體（未誘導(dǎo)組）；泳道2， 5052培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌體（誘導(dǎo)組）；泳道3,超聲破碎后離心得到的上清；泳道4,超聲 破碎后離心得到的沉淀；泳道5,流穿鎳柱后得到的濾液；泳道6, 200mM咪唑沖洗鎳柱所洗 脫的蛋白；泳道7,200mM咪唑沖洗后再用400mM咪唑洗脫得到的蛋白樣品；箭頭所指示的 位置為重組ULP1激酶；
[0026] 圖3為重組ULP1激酶在不同環(huán)境下的切割效率；其中，Μ為蛋白marker;泳道1 為陰性對照，只有5μg底物，無重組ULP1激酶；泳道2-10,均含有5μg底物，1μ1重組 ULP1激酶；泳道1-7均是采用標(biāo)準(zhǔn)的酶切緩沖液；泳道8-10采用的酶切緩沖體系分別是 Tris-HCl，PBS，去離子水；泳道1，2,8,9,10是標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體積，即總反應(yīng)體積是50μ1 ;泳道 3,4, 5,6, 7 的反應(yīng)體積分別是 100, 200,400,600, 800μ1。
【具體實施方式】
[0027] 實施例1重組ULP1激酶的制備流程
[0028] 1、根據(jù)大腸桿菌密碼子使用偏好，對ULP1(4()3 621)這部分蛋白所