菘藍(lán)松脂醇還原酶蛋白編碼序列及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種核苷酸序列及其應(yīng)用，本發(fā)明還涉及一種蛋白質(zhì)的序列，屬于生 物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 菘藍(lán)為十字花科植物，其根入藥，即為常用中藥板藍(lán)根，有清熱解毒，涼血利咽等 功效，應(yīng)用十分廣泛，主要制劑有板藍(lán)根顆粒、板藍(lán)根含片等，臨床用于流行性感冒、流行性 乙型腦炎、流行性腮腺炎、急慢性肝炎、帶狀皰疹等?；瘜W(xué)成分及藥理活性研究表明落葉松 脂素是菘藍(lán)發(fā)揮抗病毒功效的重要活性物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，提高落葉松脂素的含量是獲得抗 病毒活性高的優(yōu)良菘藍(lán)品系的關(guān)鍵，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 植物次生代謝工程是利用基因工程和分子生物學(xué)方法闡明植物次生代謝產(chǎn)物生 物合成的機(jī)制，了解清楚代謝途徑和相關(guān)酶的信息，對控制生物合成路徑的基因進(jìn)行調(diào)控， 從而達(dá)到在分子水平上改造代謝途徑，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的定向合成，提高植物中特定化合物 產(chǎn)量的目的。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，位于落葉松脂素合成途徑最后一個(gè)步驟的松脂醇還原酶 (PLR)對落葉松脂素的生物合成起到了非常重要的調(diào)控作用，是木脂素代謝工程的重要靶 點(diǎn)。因此，從菘藍(lán)中分離獲得松脂醇還原酶并利用其進(jìn)行代謝調(diào)控，將打破落葉松脂素生物 合成限速瓶頸，獲得落葉松脂素高產(chǎn)的高品質(zhì)菘藍(lán)株系。目前尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明所提及的 菘藍(lán)松脂醇還原酶蛋白及應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種編碼具有菘藍(lán)松脂醇還原酶活性的蛋白的核苷酸序列，其特征在 于：核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0005] 另外，本發(fā)明還提供一種具有菘藍(lán)松脂醇還原酶活性的蛋白氨基酸序列，其特征 在于：其序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0006] 另外，本發(fā)明還提供一種編碼具有菘藍(lán)松脂醇還原酶活性的蛋白的核苷酸序列在 增強(qiáng)植物表達(dá)菘藍(lán)松脂醇還原酶中的應(yīng)用。
[0007] 另外，本發(fā)明還具有這樣的特征：采用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1作為轉(zhuǎn)化載體。
[0008] 另外，本發(fā)明還提供了一種以菘藍(lán)總RNA為模板克隆核苷序列所需的引物，其特 征在于：
[0009] 以寡核苷酸Rl: 5' -ATGAGAGAGAATAATAGCGG-3'為正向引物，以寡核苷酸R2 : 5' -CTAGAGGAATAITTTCAAATA-3' 為反向引物。
[0010] 另外，本發(fā)明還提供了一種通過轉(zhuǎn)菘藍(lán)松脂醇還原酶編碼基因提高落葉松脂素的 含量的應(yīng)用。
[0011] 發(fā)明作用與效果
[0012] 本發(fā)明提供了一種具有編碼具有菘藍(lán)松脂醇還原酶活性的蛋白的核苷酸序列，以 及相應(yīng)的氨基酸序列，并且提供了核苷酸序列在提高菘藍(lán)中落葉松脂素的含量中的應(yīng)用， 具有重要的實(shí)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0013] 圖1是I iPLR和擬南芥PLR蛋白的比對；
[0014] 圖2是IiPLR重組蛋白在大腸桿菌E. coliBL21 (DE3)中原核表達(dá)的SDS-PAGE電 泳圖；
[0015] 圖3是IiPLR轉(zhuǎn)基因發(fā)根的分子檢測圖；
[0016] 圖4是IiPLR轉(zhuǎn)基因菘藍(lán)發(fā)根中IiPLR表達(dá)的RT-PCR分析圖；以及 [0017] 圖5是IiPLR轉(zhuǎn)基因菘藍(lán)發(fā)根中落葉松脂素的含量圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下結(jié)合附圖描述本發(fā)明實(shí)施例的【具體實(shí)施方式】
[0019] 〈實(shí)施例一〉菘藍(lán)松脂醇還原酶基因的克隆
[0020] 1.組織分離
[0021] 菘藍(lán)（I. indigotica)葉片采集自第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院植物園，采取材料后，立即 置于液氮中冷凍保存。
[0022] 2. mRNA 的分離
[0023] 取部分組織，用研缽研碎，加入盛有加入盛有TRIzoI裂解液（TRIzol Reagents，Gibco, NY，USA)的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml 新管，抽提總RNA。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。
[0024] 3.基因的全長克隆
[0025] 根據(jù)已報(bào)導(dǎo)的其它植物中松脂醇還原酶保守序列，設(shè)計(jì)簡并引物，利用同源性基 因克隆原理，采用RACE方法（即通過PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù))，使用商品化的 Gibco BRL試劑盒。
[0026] 進(jìn)行cDNA全長克隆，分三個(gè)階段進(jìn)行：
[0027] (1)3'-RACE
[0028] PCR(引物為 AP+TNX001)得到序列 2001TNX3(514bp)，回收，連接到 T-Easy 載體 上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記（Big-Dye，Perkin-Elm er，USA)的方 法，在ABI377測序儀（Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包（Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫（Genebank+EMBL)，知其核酸序列 及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥（Arabidopsis thaliana)的松脂醇還原酶基因 的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)松脂醇還原酶基因。
[0029] (2) 5, -RACE
[0030] 第一輪 PCR (AAP+TNX02)
[0031] 第二輪 PCR(AUAP+TNXR03)得到 2001TNX5'（723bp)(過程同⑴）
[0032] (3)PCR 擴(kuò)增 2001TNX 編碼區(qū)（TNX01+R1)得到 2001TNX 編碼區(qū)（770bp)(過程同 ⑴）。
[0033] BLAST的結(jié)果證明從菘藍(lán)中新得到的基因確為一個(gè)松脂醇還原酶 基因。通過組合使用上述三個(gè)步驟，獲得了候選的菘藍(lán)松脂醇還原酶基因的 全長編碼序列。在拼接得到全長（至少包含完整的開放讀框）的基礎(chǔ)上，進(jìn) 一步設(shè)計(jì)引物Rl:5'-ATGAGAGAGAATAATAGCGG-3'為正向引物，寡核苷酸R2 : 5' -CTAGAGGAATATTTTCAAATA-3'為反向引物，以菘藍(lán)總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，Rl/ R2的PCR條件為94°C、5分鐘，隨之以94°C、45秒；58°C、45秒；72°C、1分鐘的反應(yīng)過程進(jìn) 行35個(gè)循環(huán)，最后在72°C下延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為 1062bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序，獲得所示的序列，見SEQ ID NO. 1 的信息。
[0034] 〈實(shí)施例二〉菘藍(lán)IiPLR基因的序列信息與同源性分析
[0035] 蔣藍(lán) IiPLR 全長 cDNA 的長度為 1062bp (Genbank accessionNo. JF264893)，包括 951bp的開放閱讀框（0RF)，3bp的終止密碼子（tag)。該ORF編碼了一個(gè)317個(gè)氨基酸的肽 鏈。還有一個(gè)長33bp的5'引導(dǎo)序列和一個(gè)長75bp的3'非翻譯區(qū)。等電點(diǎn)（pi)為5. 64， 分子量大小約為35. 6kDa。
[0036] BLAST結(jié)果顯示，如圖1所示IiPLR與同科植物擬南芥PLRs具有極高的相似性， 相似度均達(dá)到80%以上(見表1)。由此可見，IiPLR基因與模式植物擬南芥松脂醇還原酶 (PLR)基因存在較高的同源性，可以認(rèn)為兩者在功能上也有很高相似性。
[0037] 圖1是IiPLR和擬南芥PLR蛋白的比對。一致的序列用白字黑底表示，大塊的相 似序列用黑字淺灰底表示，不相似的殘基用黑字白底表示。比對所用的PLRs序列見表1。
[0038] 表1氨基酸比對分析中用到的PLRs序列
[0039]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種編碼具有菘藍(lán)松脂醇還原酶活性的蛋白的核苷酸序列，其特征在于： 所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -種具有菘藍(lán)松脂醇還原酶活性的蛋白氨基酸序列，其特征在于： 其序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -種編碼具有菘藍(lán)松脂醇還原酶活性的蛋白的核苷酸序列在增強(qiáng)植物表達(dá)菘藍(lán)松 脂醇還原酶中的應(yīng)用。
4. 一種菘藍(lán)IiPLR的成熟蛋白的轉(zhuǎn)化載體，其特征在于： 采用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1作為轉(zhuǎn)化載體。
5. -種以菘藍(lán)總RNA為模板克隆如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列所需的引物，其特征 在于： 以寡核苷酸Rl:5' -ATGAGAGAGAATAATAGCGG-3'為正向引物，以寡核苷酸R2 : 5' -CTAGAGGAATAITITCAAATA-3' 為反向引物。
6. -種通過轉(zhuǎn)菘藍(lán)松脂醇還原酶編碼基因提高落葉松脂素的含量的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種編碼具有菘藍(lán)落葉松脂素還原酶活性的蛋白的核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供一種具有菘藍(lán)落葉松脂素還原酶活性的蛋白氨基酸序列，其特征在于：其序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明還提供了一種編碼具有菘藍(lán)落葉松脂素還原酶活性的蛋白的核苷酸序列在增強(qiáng)植物表達(dá)菘藍(lán)落葉松脂素還原酶中的應(yīng)用。本發(fā)明有利于在植物中高表達(dá)菘藍(lán)落葉松脂素還原酶從而提高落葉松脂素的產(chǎn)量。
【IPC分類】C12N15-11, C12N15-53, C12N9-02, C12N15-82, A01H5-00
【公開號(hào)】CN104805097
【申請?zhí)枴緾N201410030473
【發(fā)明人】肖瑩, 楊穎博, 宣洪嬌, 李卿, 陳萬生, 張磊
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2014年1月23日