一種提高白樺抗逆性的轉錄因子及其編碼的蛋白的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可提高白樺抗性的基因及其編碼的蛋白。
【背景技術】
[0002] 白樺（Betula platyphylla Suk.)為樺木科樺屬植物，為落葉喬木，生長速度快、 是東北地區(qū)次生林的先鋒樹種，耐寒能力強，喜酸性土壤，在膠合板、單板的家具制造以及 紙漿材等方面有廣泛的應用。由于其重要的生態(tài)、觀賞和實用經濟價值，歷來被列為國家科 技計劃研宄的重要樹種之一。對白樺品種改良的范圍也在不斷擴大，其主要目標是培育速 生、優(yōu)質和高抗的林木新白樺品種。但是傳統(tǒng)的品種改良手段存在效果不明顯，周期長，成 功率低的問題。利用基因工程技術進行遺傳改良可以解決上述問題，但首先需要找到在白 樺中能夠提升白樺性能的基因。
[0003] 轉錄因子也稱反式作用因子，是一類能識別真核生物基因啟動子區(qū)域中的順式作 用元件，并與之發(fā)生特異性結合的蛋白質。通過轉基因技術使一個特定轉錄因子在植物體 內過量表達，就可通過該轉錄因子促使多個功能基因發(fā)揮作用，從而達到植物性狀獲得綜 合改良的效果。與過量表達個別功能基因相比，在植物體內過量表達一個轉錄因子是提高 植物抗逆性更為有效的方法和途徑。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種提高白樺抗逆性的轉錄因子及其編碼的蛋白，通過轉基 因技術為將來培育和改良高抗逆性白樺品種奠定物質基礎。
[0005] 本發(fā)明提高白樺抗逆性的轉錄因子的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0006] 本發(fā)明提高白樺抗逆性的轉錄因子所編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所 不O
[0007] 本發(fā)明提高白樺抗逆性的轉錄因子全長為1281bp，編碼的蛋白分子由426個 氨基酸組成（SEQ ID NO :2)，等電點（PI)為6. 16,分子量（MW)為47. 98KD，負電荷殘基 (Asp+Glu)為 52,正電荷殘基（Arg+Lys)為 44,分子式為 C2tl93H3226N598O661S 2tl，不穩(wěn)定系數(shù)（II) 為54. 23,平均疏水性（GRAVY)為-0. 688,脂肪系數(shù)（Al)為62. 96。
[0008] 本發(fā)明提高白樺抗逆性的轉錄因子被命名為BpWNDl基因，實驗表明本發(fā)明提高 白樺抗逆性的轉錄因子BpWNDl基因導入白樺后受干旱和鹽脅迫而明顯誘導表達，證明本 發(fā)明BpWNDl基因參與白樺的抗旱耐鹽脅迫應答反應。
[0009] 在非脅迫條件下本發(fā)明BpWNDl基因的轉基因白樺株系的生長狀況與野生型白樺 基本一致，說明該基因的大量表達不影響植物的生長；而在NaCl、ABA以及Mannitol的脅迫 條件下，BpWNDl過表達株系的白樺長勢明顯優(yōu)于野生型白樺。
[0010] 用本發(fā)明BpWNDl基因構建植物過表達載體，然后通過農桿菌介導法轉入野生型 白樺中，發(fā)現(xiàn)在非脅迫條件下過表達BpWNDl的轉基因白樺的生長狀況與野生型白樺基本 一致，說明該基因的大量表達不影響植物的生長；而過表達BpWNDl的轉基因白樺受NaCl、 ABA和Mannitol脅迫后白樺的長勢優(yōu)于對照組野生型白樺。在非生物脅迫下過表達BpWNDl 的轉基因白樺株能夠降低體內過氧化氫和活性氧的積累，細胞損傷程度較低，表現(xiàn)出較強 的抗逆能力。
【附圖說明】
[0011] 圖1是【具體實施方式】二中在非脅迫條件（Control)下和在NaCl、ABA、Mannitol的 脅迫條件下陽性轉基因白樺株系植株（0E3和0E8)與野生型白樺植株（WT)的生長狀況圖。
[0012] 圖2是【具體實施方式】二中DAB染色試驗的染色結果圖。
[0013] 圖3是【具體實施方式】二中NBT染色試驗的染色結果圖。
[0014] 圖4是【具體實施方式】二中Evans blue染色試驗的染色結果圖。
[0015] 圖5是【具體實施方式】二中DCFH-DA染色試驗的染色結果圖。
[0016] 圖6是【具體實施方式】二中PI染色試驗的染色結果圖。
[0017] 圖7是【具體實施方式】二中SOD活性測定試驗的活性檢測結果圖。
[0018] 圖8是【具體實施方式】二中POD活性測定試驗的活性檢測結果圖。
[0019] 圖9是【具體實施方式】二中脯氨酸（proline)含量測定試驗的活性檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0020] 本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
【具體實施方式】 [0021] 一：本實施方式提高白樺抗逆性的轉錄因子BpWNDl基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO :1所示。
[0022] 本實施方式提高白樺抗逆性的轉錄因子BpWNDl基因所編碼蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO : 2 所示。
[0023] 本實施方式BpWNDl基因全長為128Ibp，編碼的蛋白分子由426個氨基酸組成（SEQ ID N0:2)，等電點（PI)為6. 16,分子量（MW)為47. 98KD，負電荷殘基（Asp+Glu)為52,正 電荷殘基（Arg+Lys)為44,分子式為C2tl93H 3226N598O661S2tl，不穩(wěn)定系數(shù)（II)為54. 23,平均疏 水性（GRAVY)為-0. 688,脂肪系數(shù)（Al)為62. 96。
【具體實施方式】 [0024] 二：本實施方式對提高白樺抗逆性的轉錄因子BpWNDl基因進行試 驗：
[0025] 一、在轉錄因子BpWNDl基因上、下游分別引入酶切位點，設計合成帶有酶切位點 的BpWNDl基因序列及引物；
[0026] 二、對轉錄因子BpWNDl基因進行PCR擴增，PCR反應程序為94°C預變性2min ;94°C 變性3〇8、58°0退火3〇8、72°0延伸211^11，循環(huán)30次；最后在72°0延伸71^11;
[0027] 三、收集到的DNA片段純化后與經酶切的pR0K2載體連接，再轉化大腸桿菌ToplO 菌株；
[0028] 四、PCR驗證和測序鑒定正確的重組質粒（pR0K2-BpWNDl)用電導法轉入根癌農桿 菌EHA105菌株中，得到陽性重組菌；
[0029] 五、步驟四獲得的陽性重組菌采用根癌農桿菌介導法轉化野生型白樺，并在含有 卡那霉素（kan)的1/2MS培養(yǎng)基上進行篩選，壯苗后取2?3片葉子提取白樺DNA進行PCR 檢測，含有BpWNDl基因的為陽性轉基因白樺株系；
[0030] 六、將步驟五獲得的陽性轉基因白樺株系和野生型白樺的組培苗轉移到正常的 1/2MS培養(yǎng)基，或含有80mmol/L NaCl的1/2MS固體培養(yǎng)基中，或含有l(wèi)OOmmol/L Mannitol 的1/2MS固體培養(yǎng)基中，或含有50ymol/L ABA的1/2MS固體培養(yǎng)基中，在人工氣候室中培 養(yǎng)20d，觀察各植株的長勢情況，結果如圖1所示。
[0031] 本實施方式步驟四中正確的重組質粒pR0K2-BpWNDl經PCR擴增可得到與BpWNDl 基因大小一致的條帶（基因片段），再經過測序，該片段與BpWNDl基因的核苷酸序列相同。
[0032] 本實施方式步驟五中壯苗后在苗高6?7cm時取2?3片葉子提取白樺DNA。
[0033] 本實施方式步驟五獲得16個陽性轉基因白樺株系，本實施方式步驟六選用其中 的兩個陽性轉基因白樺株系0E3和0E8的組培苗轉移到培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。在非脅迫條件 (Control)下陽性轉基因白樺株系植株（0E3和0E8)的生長狀況與野生型白樺植株（WT)基 本保持一致；而在NaCl、ABA以及Mannitol的非生物脅迫條件下陽性轉基因白樺株系植株 (0E3和0E8)的白樺長勢優(yōu)于野生型白樺植株（WT)。實驗結果如圖1所示，實驗表明BpWNDl 基因在白樺中可成功表達，不影響植物的生長，并使陽性轉基因白樺的抗逆性大幅提升。
[0034] 以培養(yǎng)4周的土培苗為材料，分別用水、濃度為200mmol/L的NaCl溶液、300mmol/ L的甘露醇溶液和100 μ mol/L的脫落酸（ΑΒΑ)溶液處理陽性轉基因白樺株系植株（OE)和 野生型白樺植株，在人工氣候室中處理6h和12h后，取植株葉片分別進行DAB、NBT、Evans blue等染色，結果如圖2?6所示。
[0035] 1)DAB 染色：
[0036] 分別取各脅迫處理0、6、12h的陽性轉基因白樺株系植株（OE)和野生型白樺植株 (WT)葉片，置于離心管中，加入DAB染色液，室溫染色過夜。染色結束后，用75%乙醇與5% 甘油煮沸脫色。
[0037] 2) NBT 染色
[0038] 分別取各脅迫處理0、6、12h的陽性轉基因白樺株系植株（OE)和野生型白樺植株 (WT)葉片，置于離心管中，加入NBT染色液，室溫染色過夜。染色結束后，用75%乙醇+5% 甘油沸水浴脫色。
[0039] 3) Evans blue 染色
[0040] 分別取各脅迫處理0、6、12h的陽性轉基因白樺株系植株（OE)和野生型白樺植株 (WT)葉片，置于離心管中，加入Evans blue染色液，真空干燥15min，保持真空6h。染色結 束后，用96%乙醇沸水浴脫色。
[0041] 4) DCFH-DA 染色：
[0042] 分別撕取未脅迫處理和脅迫處理Ih的陽性轉基因白樺株系植株（0E3和0E8) 和野生型白樺植株（WT)葉片的下表皮，放入誘導氣孔開放液中2h，然后用