專利名稱：抗真菌蛋白及其編碼dna和摻入此dna的宿主的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可以作為抗真菌蛋白的新型氧化酶及其編碼DNA和摻入此DNA的宿主，以及通過使所述真菌病原體與所述蛋白接觸以抵抗真菌病原體的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及摻入和表達(dá)編碼抗真菌蛋白的DNA的植物和因此表現(xiàn)對(duì)真菌病原體易感性降低的植物。
背景技術(shù)：
在整個(gè)農(nóng)作物栽培歷史中，農(nóng)作物植株的真菌疾病是農(nóng)作物損失的主要因素之一。農(nóng)作物的單種栽培促進(jìn)了真菌病原體強(qiáng)毒種類的增殖并且新的各種植物變得在急劇增加的侵襲植物的進(jìn)化病原體強(qiáng)毒株大范圍危險(xiǎn)中生長(zhǎng)。由于攜帶病原體植物材料的國(guó)際運(yùn)輸，使疾病的發(fā)生明顯惡化，使沒有機(jī)會(huì)產(chǎn)生對(duì)病原體抗性的植物與病原體接觸。因此由于人為的干預(yù)，宿主和病原體之間的天然平衡遭到破壞，在許多情況下帶來災(zāi)難性的影響。這樣的情況導(dǎo)致了諸如19世紀(jì)期間出現(xiàn)在愛爾蘭的由馬鈴薯晚疫病真菌(致病疫霉)引起的災(zāi)難性損失甚至饑荒。真菌病也可能使一些農(nóng)作物在大面積范圍內(nèi)完全不能生長(zhǎng)，如萎焉鐮孢毀滅生長(zhǎng)在美國(guó)東部的大面積番茄時(shí)或霜霉病(葡萄生單軸霉)真菌摧毀生長(zhǎng)在歐洲部分區(qū)域的藤本植物時(shí)就是這種情況。真菌疾病的爆發(fā)也可能如荷蘭榆樹疾病(Ceratocystis ulmi)破壞整個(gè)英國(guó)榆樹(Ulmus procera)種群時(shí)發(fā)生的那樣對(duì)環(huán)境有嚴(yán)重的影響。除了在農(nóng)作物生長(zhǎng)期間導(dǎo)致的損失，真菌疾病可能產(chǎn)生進(jìn)一步的收獲后損失。例如，各種軟腐病如灰葡萄孢尤其在軟水果中存在問題。真菌黃曲霉盡管不是真的引起疾病的真菌，但尤其在熱帶國(guó)家導(dǎo)致儲(chǔ)藏花生和玉米收獲后的腐病，并且是最嚴(yán)重的，因?yàn)樗a(chǎn)生對(duì)人類非常有毒的毒素-黃曲霉毒素。
與真菌病相關(guān)的主要經(jīng)濟(jì)問題存在于世界上更濕潤(rùn)的部分，主要是歐洲西部和濕熱帶。各種農(nóng)作物管理技術(shù)如輪作和避免機(jī)械上土壤傳播等可用于防止真菌病嚴(yán)重侵染的形成和傳播。植物育種已在增加許多農(nóng)作物對(duì)重要疾病抗性方面取得顯著效果。例如，農(nóng)作物育種者成功地將有效抵抗番茄尖鐮孢的抗性基因1和1-2導(dǎo)入番茄。然而，特別是當(dāng)種特異抗性由于快速進(jìn)化的病原體新種類而減弱時(shí)，問題仍然存在。在番茄中，尖鐮孢的另一個(gè)強(qiáng)毒株已經(jīng)出現(xiàn)并且育種者正在尋求第三個(gè)有用的抗性基因。最近在生長(zhǎng)在西部歐洲部分的谷類中黃銹病(條形柄銹菌)強(qiáng)毒株的爆發(fā)導(dǎo)致對(duì)具有對(duì)其它真菌抗性的品種使用的殺真菌劑快速增加。在這些特定情況下，如對(duì)育種者來說沒有天然來源的抗性可用的情況下，化學(xué)品廣泛地用于控制真菌病。
在世界的許多地方化學(xué)殺真菌劑仍然是農(nóng)作物生產(chǎn)成本中的主要投入。據(jù)統(tǒng)計(jì)1990年21％的農(nóng)業(yè)化學(xué)品銷售是用于殺真菌劑(5、54億美元)。農(nóng)場(chǎng)主和種植者有強(qiáng)烈的降低它們投入成本的愿望。與經(jīng)濟(jì)原因相提并論的是逐漸增強(qiáng)的環(huán)境因素。在更先進(jìn)的經(jīng)濟(jì)中，尤其是在北美和西歐，來自政治家和消費(fèi)者的關(guān)于較少依靠化學(xué)品投入的農(nóng)業(yè)的壓力逐漸增加。對(duì)于這樣的要求的理由可能缺乏公認(rèn)的原理或科學(xué)的證據(jù)，但是對(duì)一些關(guān)于殘留在飲用水中或檢測(cè)到的殺蟲劑的量超過了食品殘留物所能接受的最小量的報(bào)道的恐懼正在增加。例如在荷蘭，有在2000年前將殺蟲劑的總用量降低50％的強(qiáng)制要求。
致病疫霉屬于稱為卵菌綱的真菌類。致病疫霉感染茄科的各個(gè)成員如馬鈴薯、番茄和一些觀賞植物。它引起馬鈴薯和番茄的晚疫病并影響除了根部以外的所有部分。此真菌在地理上廣泛分布并可以在所有生產(chǎn)馬鈴薯的國(guó)家中發(fā)現(xiàn)。馬鈴薯的晚疫病在經(jīng)濟(jì)上非常重要的，因?yàn)樵诠?jié)令的早期侵染會(huì)嚴(yán)重降低農(nóng)作物產(chǎn)量。目前通過定期噴灑化學(xué)殺真菌劑(二硫代氨基甲酸鹽類如代森錳鋅、代森錳和代森鋅)控制病害。從環(huán)境和經(jīng)濟(jì)的觀點(diǎn)考慮，對(duì)由致病疫霉引起的病害的生物學(xué)控制比使用化學(xué)殺真菌劑更有利。
腐霉也屬于稱為卵菌綱的真菌類。腐霉屬不同于相關(guān)的疫霉屬，因?yàn)樾纬上鄬?duì)不分化的孢子囊。此真菌在地理上廣泛分布于所有陸地。由腐霉屬種類引起的第一種主要病害類型是由于對(duì)大田或苗圃中幼苗侵襲的突然和快速的發(fā)展而導(dǎo)致的枯萎。腐霉屬種類引起第二種類型的病害即根壞死并導(dǎo)致植物生長(zhǎng)總體減慢(例如小麥和玉米)和產(chǎn)量損失。在歐洲由腐霉引起的主要損失是針對(duì)大田農(nóng)作物如甜菜。損失基本上趨向于全或無。相似地，苗圃種植的觀賞植物和森林樹木也可能遭到完全破壞。(有關(guān)卵菌綱的綜述，參見歐洲植物病害手冊(cè)，由I.M.Smith等編輯，1988,Blackwell Scientific Publications，第8章)。
另一種真菌是葡萄孢，尤其灰葡萄孢，屬于半知菌類，它導(dǎo)致灰霉疫病或芽和花的疫病，它普遍存在于收獲后的軟熟水果上，但它也可能在收獲前出現(xiàn)。它也可以影響各種蔬菜如萵苣、豆類和番茄。葡萄孢的其它種類普遍存在于花卉如百合、唐菖蒲和郁金香上。
從TMV誘導(dǎo)的煙草葉中分離的具有抗真菌活性的蛋白公開于WO91/18984，該蛋白能引起致病疫霉的發(fā)芽孢子和菌絲尖裂解并使菌絲體以降低的速率生長(zhǎng)。該蛋白具有約24千道爾頓的表觀分子量并命名為AP24。將由AP24基因的核酸序列推測(cè)的其完整氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中的已知蛋白比較，揭示了此蛋白是滲透蛋白樣蛋白。
盡管在抵抗真菌病原體如致病疫霉方面已取得初步成功，但是仍然需要鑒定能夠合成具有抗此真菌病原體活性的抗真菌蛋白的遺傳工程植株并分離具有抵抗此真菌的抗真菌活性的其它蛋白。
發(fā)明概述本發(fā)明提供可從植物來源獲得的具有針對(duì)卵菌綱優(yōu)選地針對(duì)疫霉和/或腐霉的最有效的抗真菌活性并通過SDS(十二烷基磺酸鈉)-PAGE(聚丙烯酰凝膠)電泳測(cè)定分子量為約55-65千道爾頓的分離的蛋白。優(yōu)選的蛋白是那些可從向日葵或萵苣植株獲得的蛋白。甚至更優(yōu)選的蛋白是可從用水楊酸鈉誘導(dǎo)的向日葵或萵苣葉子獲得的蛋白。更優(yōu)選的分離蛋白的特征在于選自含有選自SEQ ID NO:1,2或6,16,20,49,50,51,58,71,73或75中所示的氨基酸序列并具有抗真菌活性，特別是抗疫霉和/或抗腐霉活性的蛋白的群體及其突變蛋白。根據(jù)本發(fā)明所述的進(jìn)一步優(yōu)選的蛋白的特征在于它包括含有由SEQ ID NO:16,20,58,71,73或75代表的氨基酸序列或諸如由SEQ ID NO:6代表的部分序列的蛋白。
本發(fā)明也提供新型酶，其酶活性是碳水化合物的氧化。
本發(fā)明也包括包含能編碼根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的開放閱讀框架的分離DNA序列以及能在嚴(yán)格條件下與其雜交的DNA，優(yōu)選地特征在于該開放閱讀框架能編碼根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白。
本發(fā)明也提供根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA序列，進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域和選擇性地轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域，它們與所述的開放閱讀框架連接使嵌合DNA在存在于存活宿主細(xì)胞中時(shí)能在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生含所述開放閱讀框架的RNA。根據(jù)本發(fā)明所述的優(yōu)選的嵌合DNA序列是其包含開放閱讀框架的RNA能在存在于所述宿主細(xì)胞中時(shí)在宿主細(xì)胞中翻譯為蛋白從而合成所述蛋白的嵌合DNA序列。尤其優(yōu)選的是包含如SEQ ID NO:15,19,57,70,72或74所示序列的DNA序列。
本發(fā)明也包括包含根據(jù)本發(fā)明所述的DNA序列的嵌合DNA序列，它可以選自復(fù)制子如細(xì)菌克隆質(zhì)粒和載體如細(xì)菌表達(dá)載體、(非整合型)植物病毒載體、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體如雙元載體等；以及包含根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)制子或載體并且一旦所述復(fù)制子存在其中時(shí)能維持該復(fù)制子的宿主細(xì)胞。根據(jù)實(shí)施方案優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞，所述的載體是非整合型病毒載體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA序列穩(wěn)定摻入其基因組的宿主細(xì)胞如植物細(xì)胞以及包含所述細(xì)胞或基本上由所述細(xì)胞組成的多細(xì)胞宿主如植物。尤其優(yōu)選的是其特征在于根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA至少在許多植物細(xì)胞中表達(dá)以引起其中合成所述抗真菌蛋白的植物。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了制備具有碳水化合物氧化酶活性的蛋白的方法，其特征在于根據(jù)本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞在允許所述宿主細(xì)胞合成所述蛋白的條件下生長(zhǎng)，選擇性地隨后進(jìn)行從宿主細(xì)胞回收蛋白的步驟。
本發(fā)明的另一部分是涉及具有碳水化合物氧化酶活性的蛋白的抗真菌用途。
本發(fā)明也提供了根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的用途，即用于抑制真菌，優(yōu)選地卵菌綱，并且更優(yōu)選地疫霉和腐霉的生長(zhǎng)。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，抑制真菌的生長(zhǎng)通過在植物上或植物鄰近處施用能合成蛋白的微生物或通過從微生物宿主收集蛋白并以農(nóng)業(yè)化學(xué)制劑施用蛋白來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明也提供了用于獲得對(duì)真菌尤其是對(duì)疫霉和/或腐霉具有降低的易感性的植物的方法，包括以下步驟(a)將嵌合DNA序列導(dǎo)入易于再生出完整植株的祖細(xì)胞，-所述嵌合DNA序列包含能編碼根據(jù)權(quán)利要求1-12中的任意一項(xiàng)所述的蛋白的開放閱讀框架，所述開放閱讀框架可操作性地與轉(zhuǎn)錄和翻譯區(qū)域及選擇性地轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域連接，以使對(duì)所述真菌侵染易感的植物細(xì)胞中合成所述的蛋白，并且-所述嵌合DNA序列能編碼植物選擇性標(biāo)記，以允許選擇所述選擇性標(biāo)記存在其中的轉(zhuǎn)化祖細(xì)胞，并且(b)在有利于具有所述選擇性標(biāo)記的祖細(xì)胞的條件下使所述祖細(xì)胞再生為植株，并且(c)鑒定合成根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白的植物，由此降低所述植物對(duì)所述真菌侵染的易感性。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是特征在于步驟(a)使用能將T-DNA轉(zhuǎn)移入植物細(xì)胞并攜帶克隆入雙元載體pMOG800的所述嵌合DNA的根瘤農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行的方法；另一個(gè)優(yōu)選的方法是步驟(b)在存在抗生素從而有利于含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞的情況下進(jìn)行的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供抗真菌組合物，包含根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白和適當(dāng)?shù)妮d體。
本發(fā)明也提供能與根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白N端片段，優(yōu)選地與由SEQ ID NO:6,16,20,58,71,73或75代表的肽反應(yīng)的抗體。該抗體適用于檢測(cè)能合成根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的宿主細(xì)胞和多細(xì)胞宿主，優(yōu)選地檢測(cè)植物中根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA的表達(dá)水平。
本發(fā)明也提供可從編碼根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的基因獲得的核酸序列，所述的核酸序列在植物中具有組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。本發(fā)明特別提供可從所述基因翻譯起始位點(diǎn)上游區(qū)域獲得的核酸序列，優(yōu)選地所述基因翻譯起始位點(diǎn)緊鄰的上游區(qū)域的至少500個(gè)核苷酸。
附圖描述

圖1向日葵蛋白MS59不同純化步驟的SDS-PAGE(12.5％)。MW=分子量標(biāo)記物；1=凝膠過濾(G25)后粗制的向日葵蛋白提取物；2=結(jié)合到陽離子交換層析(S-瓊脂糖)上的蛋白組分；3=陽離子交換層析(Mono S)后的活性組分；4=經(jīng)疏水相互作用層析(苯基superose)的流出物；5=凝膠過濾后的活性組分。
圖2凝膠過濾(SD75)柱的不同組分(序號(hào)6-16)的SDS-PAGE(12.5％)。以3個(gè)稀釋度測(cè)試組分10-15對(duì)致病疫霉(A板)和終極腐霉(B板)的生長(zhǎng)抑制。
圖3從天然PAGE的9個(gè)凝膠塊洗脫的組分的SDS-PAGE(12.5％)(泳道1-9)，在天然PAGE中，含有MS59的SD75組分(SD75組分13)得到分離。右板SD75組分13(L)和洗脫實(shí)驗(yàn)的2個(gè)組分，組分2(含有MS59)和組分5(含有約30千道爾頓蛋白)的SDS-PAGE(12.5％)。底部板用洗脫組分1-6測(cè)試對(duì)致病疫霉生長(zhǎng)的抑制，每孔加入5微升和1微升。
圖4在向PDA培養(yǎng)基加入致病疫霉游動(dòng)孢子囊之后24小時(shí)對(duì)體外真菌抑制實(shí)驗(yàn)的顯微分析。左板對(duì)照培養(yǎng)，僅加入MES緩沖液。右板向培養(yǎng)物中加入在MES緩沖液中的大腸桿菌合成的MS59。
圖6:(A)WL64的SD75凝膠過濾。WL64在組分13,14,15洗脫。在圖頂部的箭頭表示分子量標(biāo)記物。X軸組分序號(hào)。Y軸A280。
(B)SD75凝膠過濾曲線的組分11-17的12.5％SDS-PAGE凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色。分子量標(biāo)記物在右邊以千道爾頓表示。箭頭之間表示與抗真菌活性相關(guān)的蛋白條帶。
(C)體外抗真菌測(cè)試。10微升相應(yīng)組分(500微升總體積)用于篩選立枯絲核菌菌絲的生長(zhǎng)抑制。
圖7:WL64純化的12.5％SDS-PAGE凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色。泳道1萵苣提取物；泳道2:HIC峰；泳道3:Source S峰；泳道4:MonoS峰；泳道5:SD75峰；泳道6:Mono P峰。分子量標(biāo)記物在圖的兩側(cè)以千道爾頓表示。
圖8:(A)以葡萄糖為底物測(cè)定的MS59(空心菱形)、WL64(實(shí)心圓圈)和GOX(空心方形)的氧化酶活性的Lineweaver-Burk圖。對(duì)于MS59、WL64和GOX，每次測(cè)試的蛋白量分別是17,29和45納克。
(B)以真菌細(xì)胞壁為底物測(cè)定的MS59(空心菱形)、WL64(實(shí)心圓圈)和GOX(空心方形)的氧化酶活性的Lineweaver-Burk圖。對(duì)于MS59、WL64和GOX每次測(cè)試的蛋白量分別是17,29和225納克。
圖9:MS59(點(diǎn)形柱)、WL64(斜條紋柱)和GOX(實(shí)心柱)的氧化酶活性的底物特異性。
圖10本發(fā)明的蛋白MS59、WL64與來自擬南芥的兩個(gè)同系物At26(SEQ ID NO:71)和At27(SEQ ID NO:75)[含有已知的黃連素橋酶(berberine bridge enzyme)(EcBBE和PsBBe)]的匹配。保守的變化以灰色表示，而相同的區(qū)域(6個(gè)氨基酸中有3個(gè)相同)以黑色表示。
發(fā)明詳述為了舉例說明，已在體外分析中證明了本發(fā)明的蛋白對(duì)下列真菌的抗真菌效應(yīng)致病疫霉，惡疫霉，煙草疫霉，大雄疫霉，終極腐霉，Pythium sylvaticum，堇菜腐霉，側(cè)雄腐霉，立枯絲核菌，Tanatephoruscucumeris，紫卷擔(dān)菌，白腐小核菌，巴斯德畢赤酵母和灰葡萄孢。顯然，根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白或其編碼DNA在抵抗真菌的方法中的用途不限于針對(duì)上述真菌。沒有理由假定根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白不具有抵抗比本文測(cè)試的更寬范圍的真菌，尤其是卵菌綱真菌的活性。
盡管以轉(zhuǎn)基因番茄、煙草、胡蘿卜、馬鈴薯和歐洲油菜(Brassicanapus)植物為例詳細(xì)地舉例說明了本發(fā)明，但是應(yīng)該理解可以將一種或多種植物可表達(dá)的基因構(gòu)建體提供給任何容易受某些形式的真菌侵襲尤其受上述真菌侵襲的植物種類，該構(gòu)建體表達(dá)時(shí)在所述植物中過量合成根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白以降低侵染比例和/或這樣的侵襲的影響。本發(fā)明甚至可以在目前不易于轉(zhuǎn)化的植物種類中實(shí)施，因?yàn)檫@樣的種類的易受性僅僅是時(shí)間問題而且轉(zhuǎn)化本身與構(gòu)成本發(fā)明的原理無關(guān)。因此，適用于本說明書的目的的植物應(yīng)包括被子植物和裸子植物，單子葉植物和雙子葉植物，它們可用于飼料、食物或工業(yè)加工的目的；也包括用于任何農(nóng)業(yè)或園藝目的，包括林業(yè)和花卉培養(yǎng)，以及家庭花園或室內(nèi)花園，或其它裝飾目的的植物。
根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白可以通過從任何含有該蛋白的適當(dāng)植物來源材料分離得到。特別適當(dāng)?shù)膩碓窗蛉湛?Helianthus)的葉子和萵苣(萵苣Lollo bionda變種)的葉子。通過從植物種類制備植物提取物并使用如本文所述的體外抗真菌測(cè)試法測(cè)試這些提取物中抗真菌活性的存在，可以很容易地測(cè)定任何植物種類的植物來源材料中根據(jù)本發(fā)明所述的抗真菌蛋白的存在，通過適當(dāng)?shù)牡鞍追旨?jí)分離技術(shù)與體外測(cè)試結(jié)合進(jìn)一步分級(jí)分離所得的樣品直至得到包含約55-65千道爾頓蛋白的抗真菌組分，內(nèi)部命名為MS59或其同系物WL64，其分離的形式表現(xiàn)抗真菌活性。尤其是可以在卵菌綱如疫霉或終極腐霉等或其它真菌如擔(dān)子菌亞綱、子囊菌亞綱和接合菌類或其它綱或亞綱上測(cè)試該組分的抗真菌活性。
選擇性地，通過克隆包含能編碼所述蛋白或其前體的開放閱讀框架的DNA并將其中所述的開放閱讀框架與轉(zhuǎn)錄區(qū)域和選擇性地翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域連接，將所述DNA插入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞并使所述的宿主合成所述蛋白，可以獲得根據(jù)本發(fā)明所述的抗真菌蛋白。隨后，可以優(yōu)選地在所述宿主細(xì)胞將該蛋白分泌到培養(yǎng)基中之后，從所述宿主細(xì)胞回收蛋白。選擇性地，可以直接將所述宿主細(xì)胞作為可接受的殺蟲劑組合物用于根據(jù)本發(fā)明所述的抵抗真菌病原體的方法。
在獲得根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的方法中適用的宿主細(xì)胞可以選自原核微生物宿主如細(xì)菌如農(nóng)桿菌、芽孢桿菌、藍(lán)細(xì)菌、大腸桿菌、假單胞菌等，以及真核宿主包括酵母如釀酒酵母、真菌如木霉和植物細(xì)胞，包括原生質(zhì)體。
在植物葉子上或植物葉子附近抑制真菌生長(zhǎng)的方法中，宿主細(xì)胞可以適當(dāng)?shù)剡x自常規(guī)用作生物殺真菌劑的種類。
蛋白也可以由微生物合成、得到收集并以農(nóng)業(yè)化學(xué)制劑形式施用。
術(shù)語蛋白是指通過肽鍵連接的氨基酸序列。多肽或肽也應(yīng)認(rèn)為是蛋白。根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的突變蛋白可以通過替換、添加和/或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸從序列表中所示的蛋白得到，而仍保持其抗真菌活性。采用體內(nèi)蛋白質(zhì)工程如通過改變能編碼抗真菌蛋白的開放閱讀框架從而影響氨基酸序列也可以容易地制備這樣的突變蛋白。只要氨基酸序列的改變不完全破壞抗真菌活性，這樣的突變蛋白也包含在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明提供包含能編碼根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的開放閱讀框架的嵌合DNA序列。表達(dá)嵌合DNA序列是指包括含有不在自然界天然存在的DNA序列的任何DNA序列。例如，嵌合DNA應(yīng)該指包括在植物基因組非天然位置包含所述開放閱讀框架的DNA，盡管所述植物基因組一般在其天然染色體位置含有開放閱讀框架的拷貝。相似地，所述的開放閱讀框架可以摻入到其非天然存在的植物基因組或非天然存在的復(fù)制子或載體如細(xì)菌質(zhì)?；虿《据d體中。嵌合DNA將不限于可在宿主中復(fù)制的DNA分子，也包括能連接入復(fù)制子的DNA，如通過特定的接頭序列與根據(jù)本發(fā)明所述的開放閱讀框架連接的DNA。該開放閱讀框架可以或可以不與其天然的上游和下游調(diào)控元件連接。
開放閱讀框架可以來自基因組文庫。對(duì)于后者，它可以包含一個(gè)或多個(gè)分隔構(gòu)成編碼根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的開放閱讀框架的外顯子的內(nèi)含子。開放閱讀框架也可以由不間斷的外顯子或由合成編碼根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的mRNA的cDNA編碼。根據(jù)本發(fā)明所述的開放閱讀框架也包含其中已人工除去或加入一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子的開放閱讀框架。本發(fā)明也包含所有這些變體。
編碼抗真菌蛋白的嵌合DNA序列也是本發(fā)明的一部分，所述的DNA序列包括SEQ ID NO:21-48中所示的一個(gè)或多個(gè)EST序列。如可以從序列表中得到的，這些至今未知功能的EST與編碼從Helianthus和Lactuca分離的蛋白的DNA序列有相當(dāng)?shù)耐葱浴?br> 本發(fā)明的另一部分由根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的固有活性形成。已發(fā)現(xiàn)它們是碳水化合物氧化酶，能氧化許多不同的單糖和二糖。底物特異性與己糖氧化酶(EC1.1.3.5)，也已知為D-己糖氧1-氧化還原酶的特異性相似。已證明它們能氧化真菌(來自絲核菌)細(xì)胞壁成分的純化混合物。據(jù)信此氧化能力賦予蛋白抗真菌特性。在文獻(xiàn)中，有一個(gè)抗真菌氧化酶的例子，即來自真菌曲霉(WO95/14784)的葡萄糖氧化酶。然而本發(fā)明的蛋白表現(xiàn)類似于己糖氧化酶的底物廣譜性并且對(duì)于底物具有更低的Km。
已從同源性研究發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的氨基酸序列的某些部分是較保守的并且與常見于氧化酶的序列相關(guān)。已發(fā)現(xiàn)與網(wǎng)狀番荔枝堿氧化酶有最高的同源性，該酶已知來源于罌粟科(Facchini,P.J.等，植物生理學(xué)，112,1669-1677,1996)。
為了能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)，根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA通常提供使之能被宿主生物化學(xué)機(jī)制識(shí)別并使開放閱讀框架在宿主中轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的調(diào)控元件。調(diào)控元件通常包括可以適當(dāng)?shù)貜哪茉谒x的宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何基因衍生的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域以及用于核糖體識(shí)別和結(jié)合的翻譯起始區(qū)域。在真核細(xì)胞中，表達(dá)盒通常還包含位于所述開放閱讀框架下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域，使轉(zhuǎn)錄終止并出現(xiàn)初始轉(zhuǎn)錄物的多聚腺苷化。另外，可以將密碼子用法調(diào)整為所選宿主接受的密碼子用法。控制嵌合DNA構(gòu)建體在選定宿主細(xì)胞中表達(dá)的原理為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知，并且現(xiàn)在對(duì)于任何種類的宿主細(xì)胞，原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，可表達(dá)的嵌合DNA構(gòu)建體的構(gòu)建是常規(guī)技術(shù)。
為了在宿主細(xì)胞中維持開放閱讀框架，開放閱讀框架通常以包含與被選定的宿主細(xì)胞識(shí)別和復(fù)制的DNA連接的根據(jù)本發(fā)明所述的開放閱讀框架的復(fù)制子形式提供。因此，復(fù)制子的選擇主要根據(jù)所選的宿主細(xì)胞決定。指導(dǎo)選擇對(duì)于特定的所選細(xì)胞適合的復(fù)制子的原理為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。
特定類型的復(fù)制子是其本身或其部分能轉(zhuǎn)移到另一宿主細(xì)胞如植物細(xì)胞中從而將根據(jù)本發(fā)明所述的開放閱讀框架共轉(zhuǎn)移到所述的植物細(xì)胞中的復(fù)制子。具有這樣的能力的復(fù)制子在本文中稱為載體。所述載體的一個(gè)例子是Ti質(zhì)粒載體，該載體存在于適當(dāng)宿主如根瘤農(nóng)桿菌中時(shí)能轉(zhuǎn)移其本身的一部分，所謂的T-區(qū)域到植物細(xì)胞中。目前有不同類型的Ti質(zhì)粒載體(參見EP0116718B1)常規(guī)地用于將嵌合DNA序列轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞或原生質(zhì)體中，從中可以再生其中所述嵌合DNA穩(wěn)定摻入其基因組的新植株。Ti質(zhì)粒載體特別優(yōu)選的形式是如EP0120516B1和US4,940,838中要求保護(hù)的所謂雙元載體。可用于將根據(jù)本發(fā)明所述的DNA導(dǎo)入植物宿主的其它適當(dāng)載體可以選自病毒載體如非整合型植物病毒載體，如源自雙鏈植物病毒(例如CaMV)和單鏈病毒、雙生病毒等的載體。這樣的載體的使用尤其是當(dāng)難于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物宿主時(shí)有利。對(duì)于木本種類，尤其是樹和藤可能是這種情況。
術(shù)語“在其基因組中摻入根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA序列的宿主細(xì)胞”是指包括其基因組穩(wěn)定摻入了所述嵌合DNA從而維持該嵌合DNA并優(yōu)選地通過有絲分裂或減數(shù)分裂將這樣的嵌合DNA的拷貝轉(zhuǎn)移到子代細(xì)胞中的細(xì)胞以及包含這樣的細(xì)胞或基本上由這樣的細(xì)胞組成的多細(xì)胞生物。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，提供基本上由其基因組摻入了一個(gè)或多個(gè)拷貝的所述嵌合DNA的細(xì)胞組成并能優(yōu)選地以孟德爾方式將一個(gè)或多個(gè)拷貝傳給其子代的植物。通過根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA在一些或所有植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生抗真菌蛋白的那些細(xì)胞將表現(xiàn)對(duì)真菌侵染尤其對(duì)致病疫霉侵染增強(qiáng)的抗性。盡管不是完全了解如上所述的指導(dǎo)DNA在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的原理，但是目前能夠以基本上組成型方式，即基本上在植物的大多數(shù)細(xì)胞類型中和基本上沒有嚴(yán)格時(shí)間和/或發(fā)育限制表達(dá)的嵌合DNA的制備是常規(guī)技術(shù)。用于此目的的常規(guī)使用的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域是可從花椰菜花葉病毒得到的啟動(dòng)子，尤其是35S RNA和19S RNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和根瘤農(nóng)桿菌的所謂的T-DNA啟動(dòng)子，特別值得提及的是胭脂堿合成酶啟動(dòng)子、章魚堿合成酶啟動(dòng)子(如EP 0122791 B1中公開的)和甘露堿合成酶啟動(dòng)子。另外可以使用植物啟動(dòng)子，它可以是基本上組成型的如水稻肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子或例如器官特異性的如根特異性啟動(dòng)子。選擇性地，可以使用可由病原體誘導(dǎo)的啟動(dòng)子如可從馬鈴薯得到的PRP1啟動(dòng)子(也稱為gst1啟動(dòng)子)[Martini N.等(1993),Mol.Gen.Genet.,263,179-186]。啟動(dòng)子的選擇不是主要的，盡管有必要說明組成型高水平啟動(dòng)子是略微優(yōu)選的。進(jìn)一步已知一些元件，所謂的增強(qiáng)子的重復(fù)可以大大增強(qiáng)在其控制下的DNA的表達(dá)水平[參見例如Kay等，(1987)，科學(xué)，236:1299-1302:CaMV啟動(dòng)子的-343和-90之間的序列的重復(fù)增強(qiáng)該啟動(dòng)子的活性]。除了個(gè)別的或雙重加強(qiáng)的35S啟動(dòng)子，高水平啟動(dòng)子的例子是光誘導(dǎo)的核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcSSU)啟動(dòng)子和葉綠素a/b結(jié)合蛋白(Cab)啟動(dòng)子。本發(fā)明也涉及包含物理連接的不同啟動(dòng)子區(qū)域元件的雜交啟動(dòng)子。眾所周知的例子是所謂的CaMV加強(qiáng)的甘露堿合成酶啟動(dòng)子(美國(guó)專利5,106,739)，它包含與CaMV增強(qiáng)子連接的甘露堿合成酶啟動(dòng)子。
至于轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域的必要性，通常認(rèn)為這樣的區(qū)域加強(qiáng)了植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的可靠性和效率。因此它的使用在本發(fā)明內(nèi)容中是非常優(yōu)選的。
至于本發(fā)明在不同植物種類中的適用性，不得不提到雖然僅用轉(zhuǎn)基因番茄和煙草植物作為例子來說明本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但是事實(shí)上，實(shí)際的適應(yīng)性不限于這些植物種類。任何易于受某些形式的真菌侵襲特別是受卵菌綱如致病疫霉侵襲的植物種類都可以用根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白處理或優(yōu)選地提供根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA序列使蛋白在一些或所有植物細(xì)胞中合成。
盡管例如因?yàn)橐恍┲参锓N類至今仍難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，所以本發(fā)明的一些實(shí)施方案可能目前不能實(shí)施，但是本發(fā)明在這樣的植物種類中的實(shí)施僅僅是時(shí)間問題而不是原則問題，因?yàn)檫z傳轉(zhuǎn)化本身的易受性與構(gòu)成本發(fā)明實(shí)施方案的原理無關(guān)。
目前對(duì)于許多植物種類，包括雙子葉和單子葉植物綱，植物種類的轉(zhuǎn)化是常規(guī)技術(shù)。原則上，只要細(xì)胞能夠再生為完整植株，任何轉(zhuǎn)化方法都可用于將根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA導(dǎo)入適當(dāng)?shù)淖婕?xì)胞。轉(zhuǎn)化方法可以適當(dāng)選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Klens,EA.等，1982，自然，296,72-74；Negrutiu I.等，1987年6月，植物分子生物學(xué)，8,363-373)，原生質(zhì)體的電穿孔(Shillito R.D.等，1985，生物/技術(shù)，3,1099-1102)，向植物材料顯微注射(Crossway A.等，1986,Mol.Gen.Genet.,202,179-185)，對(duì)各種植物材料的(DNA或RNA包裹的)微粒轟擊(Klein T.M.等，1987，自然，327,70)，用(非整合型)病毒侵染等。根據(jù)本發(fā)明所述的優(yōu)選的方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。尤其優(yōu)選的是使用如EP A120516和美國(guó)專利4940838中公開的所謂雙元載體技術(shù)。番茄的轉(zhuǎn)化優(yōu)選地基本上按照Van Roekel等所述的方法進(jìn)行[Van Roekel,J.S.C.,Damm,B.,Melchers,L.S.,Koekema,A.(1993)，影響番茄(Lycopersicon esculentum)轉(zhuǎn)化效率的因子，植物細(xì)胞報(bào)道，12,644-647]。馬鈴薯的轉(zhuǎn)化優(yōu)選地基本上按照Koekema等所述的方法進(jìn)行[Koekema,A.,Huisman,M.J.,Molendijk,L.,van den Elzen,P.J.M.和Cornelissen,B.J.C.(1989)，兩種商業(yè)馬鈴薯栽培品種馬鈴薯X病毒抗性的遺傳工程，生物/技術(shù)，7,273-278]。
通常，選擇存在一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或細(xì)胞群體，其中所述的標(biāo)記物由與編碼根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的核酸序列共轉(zhuǎn)化的植物可表達(dá)基因編碼，此后使轉(zhuǎn)化材料再生為完整植株。
盡管有時(shí)認(rèn)為單子葉植物更難于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，但是有些單子葉植物易于轉(zhuǎn)化，并且可以從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或胚、或其它植物材料再生可育的轉(zhuǎn)基因植株。目前，優(yōu)選的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是對(duì)胚、外植體或懸浮細(xì)胞進(jìn)行微粒轟擊和直接DNA攝入或電穿孔(Shimamoto等，1989，自然，338,274-276)。已通過微粒轟擊將編碼膦絲菌素?；D(zhuǎn)移酶(使除草劑膦蘇菌素失活的酶)的吸水鏈霉菌bar基因?qū)胗衩讘腋∨囵B(yǎng)物的成胚細(xì)胞得到轉(zhuǎn)基因玉米植物(Gordon-Kamm,1990，植物細(xì)胞，2,603-618)。已有報(bào)道將遺傳材料導(dǎo)入到其它單子葉農(nóng)作物如小麥和大麥的糊粉原生質(zhì)體(Lee,1989，植物分子生物學(xué)，13,21-30)。已通過選擇老化致密和結(jié)節(jié)的成胚愈傷組織來建立成胚懸浮培養(yǎng)物并從成胚懸浮培養(yǎng)物再生小麥植株(Vasil,1990，生物/技術(shù)，8,429-434)。與用于這些農(nóng)作物的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)結(jié)合可使本發(fā)明應(yīng)用于單子葉植物。
包括商業(yè)上重要的農(nóng)作物如水稻和玉米的單子葉植物也易于通過農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)移[參見WO94/00977；EP0159418 B1；GouldJ,Michael D,Hasegawa O,Ulian EC,Peterson G,Smith RH,(1991)植物生理學(xué)，95,426-434]。
在DNA轉(zhuǎn)移和再生后，例如可以利用Southern分析評(píng)估假設(shè)轉(zhuǎn)化的植株中根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA的存在、拷貝數(shù)和/或基因組構(gòu)成。另外，選擇性地可以使用具有本領(lǐng)域普通技術(shù)的人員熟知的Northern和/或Western分析檢測(cè)新導(dǎo)入DNA的表達(dá)水平。選擇性地，在最初分析之后，對(duì)表現(xiàn)新導(dǎo)入的根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA的所需拷貝數(shù)和表達(dá)水平的轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行抵抗對(duì)根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白敏感的病原體如致病疫霉的抗性水平的檢測(cè)。選擇性地，可以對(duì)選擇的植株進(jìn)行另一輪轉(zhuǎn)化，例如導(dǎo)入其它基因如編碼幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、滲透蛋白，爪蟾抗菌肽等的基因以便加強(qiáng)抗性水平或增加對(duì)如此處所述的體外測(cè)試中沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白易感的其它真菌的抗性。
其它評(píng)估可以包括大田條件下的抗真菌抗性測(cè)試，檢測(cè)可育性、產(chǎn)量和其它特性。這樣的測(cè)試對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是常規(guī)操作。
在這樣的評(píng)估之后，可以直接培養(yǎng)轉(zhuǎn)化植株，但是通常它們可在新品種育種或制備雜種等情況時(shí)用作親本株系。
許多植物蛋白表現(xiàn)抗真菌活性，然而有一些蛋白本身沒有抗真菌活性，但是如果與其它植物蛋白結(jié)合使用就產(chǎn)生顯著的協(xié)同抗真菌效應(yīng)。在歐洲專利申請(qǐng)440,304 A1中公開了植物可表達(dá)的葡聚糖酶基因與來自馬鈴薯的堿性幾丁質(zhì)酶在轉(zhuǎn)基因植物中同時(shí)過量表達(dá)導(dǎo)致比僅表達(dá)植物可表達(dá)的Ⅰ類幾丁質(zhì)酶的植物更高水平的抗性。
幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、滲透蛋白、爪蟾抗菌膚和根據(jù)本發(fā)明所述的新型抗真菌蛋白基于不相容的病原體-植物相互作用在侵染的植物組織中積累。根據(jù)此觀察結(jié)果和發(fā)現(xiàn)幾種蛋白互相增強(qiáng)抗真菌效應(yīng)的事實(shí)，我們預(yù)測(cè)根據(jù)本發(fā)明所述的抗真菌蛋白可以適當(dāng)?shù)赜糜诤团c病原體抗性相關(guān)的其它蛋白結(jié)合。
可以用于與根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白結(jié)合的蛋白的例子包括但不限于從大麥(Swegle M.等，1989，植物分子生物學(xué)，12,403-412；BalanceG.M.等，1976，加拿大植物科學(xué)雜志，56,459-466；Hoj P.B.等，1988,FEBS Lett.,230,67-71；Hoj P.B.等，1989，植物分子生物學(xué)，13,31-421989)，大豆(Boller T.等，1983,Planta,157,22-31；Broglie K.E.等，1986,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，83,6820-6824；Vogeli U.等，1988,Planta,174,364-372；Mauch F.& Staehelin L.A.,1989，植物細(xì)胞，1,447-457)；黃瓜(Motraux J.P.& Boller T.,1986,Physiol.Mol.Plant Pathol.,28,161-169)；韭蔥(Spanu P.等，1989,Planta,177,447-455)；玉米(Nasser W.等，1988，植物分子生物學(xué)，11,529-538)；燕麥(Fink W.等，1988，植物生理學(xué)，88,270-275)，豌豆(Mauch F.等，1984，植物生理學(xué)，76,607-611；Mauch F.等，1988，植物生理學(xué)，87,325-333)，白楊(Parsons,T.J.等，1989，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，86,7895-7899)，馬鈴薯(Gaynor J.J.,1988，核酸研究，16,5210；Kombrink E.等，1988，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，85,782-786；Laflamme D.和Roxby R.,1989，植物分子生物學(xué)，13,249-250)，煙草(例如Legrand M.等，1987，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，84,89-93)，番茄(Joosten M.H.A.& De Wit P.J.G.M.1989，植物生理學(xué)，89,945-951)，小麥(Molano J.等，1979，生物化學(xué)雜志，254,4901-4907)等獲得的β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶。
為了獲得能夠組成型表達(dá)一個(gè)以上嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物，有許多可供選擇的方法可以使用，包含下列方法A．使用諸如雙元質(zhì)粒上的T-DNA的DNA和與選擇性標(biāo)記基因物理連接的多個(gè)修飾基因。此方法的優(yōu)點(diǎn)是嵌合基因是物理連接的，因此作為單個(gè)孟德爾基因座遷移。
B．每個(gè)已經(jīng)能夠表達(dá)優(yōu)選地與選擇性標(biāo)記基因偶聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物與來自含有與另一個(gè)選擇性標(biāo)記基因偶聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)嵌合基因的轉(zhuǎn)基因基因的花粉進(jìn)行交叉授粉。之后基于兩個(gè)選擇性標(biāo)記基因的存在或基于嵌合基因本身的存在來選擇通過這種雜交獲得的種子。之后來自選擇的種子的植物可以用于進(jìn)一步雜交。原則上，嵌合基因不只在單個(gè)基因座上，因此基因可以作為獨(dú)立的基因座分離。
C．使用許多各含有一個(gè)或多個(gè)嵌合基因和選擇性標(biāo)記的多個(gè)嵌合DNA分子如質(zhì)粒。如果共轉(zhuǎn)化頻率高，那么僅基于一個(gè)標(biāo)記物的選擇是足夠的。在其它情況下，基于一個(gè)以上標(biāo)記物的選擇是優(yōu)選的。
D．用選擇性地包含選擇性標(biāo)記基因的新的嵌合DNA連續(xù)轉(zhuǎn)化已經(jīng)含有第一、第二等嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物。如方法B，原則上嵌合基因不是在單個(gè)基因座上，因此嵌合基因可以作為獨(dú)立的基因座分離。
E．上述方案的結(jié)合實(shí)際策略可取決于可能易于決定的幾種考慮如親本株系的目的(直接生長(zhǎng)，用于育種計(jì)劃，用于產(chǎn)生雜種)，但是對(duì)于所述發(fā)明不是關(guān)鍵。
在本文中，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)已經(jīng)含有能編碼抗真菌蛋白的嵌合DNA的植物可以形成適于導(dǎo)入根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA的遺傳背景以增強(qiáng)抗性水平或擴(kuò)大抗性。對(duì)應(yīng)于可以適當(dāng)?shù)赜糜谂cDNA結(jié)合的蛋白的其它基因的克隆和能相對(duì)過量表達(dá)所述蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的獲得以及其在植物中對(duì)病原體抗性效應(yīng)的評(píng)估目前在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。
得到能夠表達(dá)或相對(duì)過量表達(dá)根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的轉(zhuǎn)基因植物是用于阻止由真菌例如諸如致病疫霉的卵菌綱導(dǎo)致的破壞的優(yōu)選方法，這一點(diǎn)在上面描述中是非常清楚的。但是，本發(fā)明不限于此。本發(fā)明也清楚地預(yù)想到根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白本身，優(yōu)選地以抗真菌組合物形式的用途。殺真菌組合物包括那些其中以蛋白本身配制的組合物，但也以能合成蛋白從而導(dǎo)致病原體與蛋白接觸的宿主細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞形式存在。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞例如可以選自無害的細(xì)菌和真菌，優(yōu)選地那些能在植物根部和/或葉部形成菌落的菌。可用于根據(jù)本發(fā)明所述的方法的細(xì)菌宿主的例子是農(nóng)桿菌屬、節(jié)桿菌屬、固氮螺菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬等菌株，選擇性地在使它們適于該目的之后使用。
含有根據(jù)本發(fā)明所述的抗真菌蛋白的組合物另外包含如WO91/18984中所述的滲透蛋白樣蛋白。本發(fā)明獨(dú)立地提供進(jìn)一步包含抑制劑如經(jīng)典的真菌抗生素，SAFP和化學(xué)殺真菌劑如多氧菌素、三國(guó)霉素、羧酰胺、芳香碳水化合物、萎銹靈、嗎啉、固醇生物合成抑制劑、有機(jī)磷混合物、酶如葡聚糖酶，幾丁質(zhì)酶，溶菌酶等的抗真菌組合物。本發(fā)明的抗真菌蛋白本身或者與其它活性組分結(jié)合的施用濃度在1納克/毫升和1毫克/毫升之間，優(yōu)選地2納克/毫升和0.1毫克/毫升之間，pH在3.0到9.0范圍內(nèi)。一般希望使用緩沖制劑，例如濃度在1mM和1M之間，優(yōu)選地10mM和100mM之間，特別是15和50mM之間的磷酸緩沖液，因此對(duì)于低緩沖液濃度的情況，需要加入鹽以增加離子強(qiáng)度，優(yōu)選的是濃度在1mM和1M之間，優(yōu)選地10mM和100mM之間的氯化鈉。
具有針對(duì)真菌病，尤其是針對(duì)由諸如疫霉和腐霉的卵菌綱引起的病害增強(qiáng)的抗性的相對(duì)過量表達(dá)根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的植物或其部分，包括植物變種可以在大田、溫室中生長(zhǎng)或在室內(nèi)或其它地方生長(zhǎng)。植物或其可食用的部分可以用作動(dòng)物飼料或人類消費(fèi)品或加工成為食品、飼料或用于其它任何形式的農(nóng)業(yè)或工業(yè)目的。農(nóng)業(yè)應(yīng)該是指包括園藝、樹木栽培、花卉栽培等。可從根據(jù)本發(fā)明所述的植物材料獲利的工業(yè)包含但不限于醫(yī)藥工業(yè)、紙和紙漿制造工業(yè)、制糖工業(yè)、飼料和食品工業(yè)、酶制備工業(yè)等。根據(jù)本發(fā)明所述的植物或其部分的優(yōu)點(diǎn)是減少對(duì)殺真菌劑處理的需求，因此降低材料、勞力的成本和環(huán)境污染或延長(zhǎng)這樣的植物產(chǎn)品(例如水果，種子等)的儲(chǔ)存期。用于本發(fā)明目的的植物應(yīng)該是指能夠光合作用的并對(duì)一些形式的真菌病易感的多細(xì)胞生物體。它們應(yīng)該至少包括裸子植物和被子植物，單子葉和雙子葉植物。
術(shù)語“相對(duì)過量表達(dá)蛋白的植物”應(yīng)該是指含有表達(dá)轉(zhuǎn)化基因編碼的蛋白的細(xì)胞的植物，其中蛋白在所述植物中不是天然存在的或者如果它由于編碼相同蛋白的內(nèi)源基因而存在，但不以相同量或不在植物的同一細(xì)胞、細(xì)胞腔隙、組織或器官中存在。例如已知可以將正常在細(xì)胞內(nèi)積累的蛋白導(dǎo)向質(zhì)外體空間。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，編碼本發(fā)明的抗真菌蛋白的植物基因的調(diào)控區(qū)域可以用于在其控制下表達(dá)其它異源序列。使用緊接基因編碼區(qū)域上游的至少1000堿基對(duì)的調(diào)控元件足以獲得任何異源序列的表達(dá)。
在這方面的異源序列是指與所述調(diào)控區(qū)域天然不結(jié)合的基因區(qū)域，并且它們包含不同的基因編碼區(qū)域和反義基因區(qū)域?？梢杂欣卦诰S管組織中表達(dá)的異源編碼區(qū)域包括編碼抗病原體蛋白如殺昆蟲、殺細(xì)菌、殺真菌和殺線蟲蛋白的那些區(qū)域。在這樣的策略中，可以證明選擇具有抵抗偏好韌皮部作為營(yíng)養(yǎng)物(例如蚜蟲)或作為侵襲植物入口的病原體或害蟲的活性的蛋白非常有利。這樣的例子是抗蚜蟲的伸展蛋白、植物凝集素或脂肪氧合酶(參見WO93/04177)。假設(shè)根據(jù)本發(fā)明所述的調(diào)控區(qū)域在木質(zhì)部有活性，在所述調(diào)控區(qū)域的控制下可以表達(dá)抗真菌蛋白以抵抗鐮刀菌屬、輪枝孢屬、鏈格孢屬和長(zhǎng)緣殼屬種類。
根據(jù)本發(fā)明所述的調(diào)控區(qū)域也可有利地用于調(diào)節(jié)或控制韌皮部的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，易于認(rèn)識(shí)到許多其它的應(yīng)用。
內(nèi)源基因的一部分以反義方向的表達(dá)(例如在EP0233399A中公開的)可以有效地負(fù)調(diào)節(jié)所述內(nèi)源基因的表達(dá)從而具有有利的應(yīng)用。而且編碼根據(jù)本發(fā)明所述的抗真菌蛋白基因本身可以使用反義方法得到負(fù)調(diào)節(jié)，反義方法可以幫助建立此蛋白的性質(zhì)和功能?？梢岳肎US標(biāo)記以類似于本文所述方法的方式進(jìn)一步闡明負(fù)責(zé)組織特異性表達(dá)的區(qū)域。
可以考慮以下現(xiàn)有技術(shù)特別地作為本發(fā)明涉及的本領(lǐng)域一般技術(shù)水平EP-A392225A2；EP-A440304A1；EP-A460753A2；WO90/07001A1；美國(guó)專利4940840。
本發(fā)明的另一方面是針對(duì)新型氧化酶的生產(chǎn)，由于它的低Km，此酶能在低濃度時(shí)氧化碳水化合物。更具體地說，己糖是此酶催化活性的底物，盡管其它糖也在較低程度上受影響。此酶可以從其天然存在的來源分離(根據(jù)本發(fā)明中所述的方法)或從用編碼該蛋白的可表達(dá)的基因轉(zhuǎn)化的植物或其它有機(jī)體分離。這些氧化酶可在工業(yè)過程中用于氧化碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、纖維二糖、麥芽糖和乳糖。轉(zhuǎn)基因植物的評(píng)估隨后評(píng)估轉(zhuǎn)基因植物所需特性的存在和/或表達(dá)所需特征的程度。最初的評(píng)估可以包括新導(dǎo)入基因的表達(dá)水平、轉(zhuǎn)化植物對(duì)真菌的抗性水平、所需特征的穩(wěn)定遺傳性、大田實(shí)驗(yàn)等。
另外，如果需要，可以將轉(zhuǎn)化植物與其它品種如有較高商業(yè)價(jià)值的品種或已經(jīng)導(dǎo)入其它所需特性的品種雜交育種或用于制備雜交種子或進(jìn)行另一輪轉(zhuǎn)化等。協(xié)同作用預(yù)期根據(jù)本發(fā)明所述的抗真菌蛋白之一與植物或微生物來源的其它抗真菌蛋白的結(jié)合會(huì)表現(xiàn)強(qiáng)烈的協(xié)同抗真菌效應(yīng)。如果將抗真菌CBPs或CHi-V與來自其它植物來源的β-1,3-葡聚糖酶或幾丁質(zhì)酶結(jié)合，表現(xiàn)相似的協(xié)同抗真菌效應(yīng)。
顯然，病原體誘導(dǎo)的蛋白的結(jié)合的協(xié)同作用是較普遍的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象對(duì)于真菌抗性植物的遺傳工程有重要價(jià)值。
具有針對(duì)植物病原真菌的增強(qiáng)抗性的具商業(yè)利益的植物或其部分可以在大田中或溫室中生長(zhǎng)，并且隨后用作動(dòng)物飼料、直接的人類消費(fèi)品，用于延長(zhǎng)儲(chǔ)藏期，用于食品或其它工業(yè)加工等。根據(jù)本發(fā)明所述的植物或其部分的優(yōu)點(diǎn)是降低了對(duì)殺真菌劑處理的需求，因此降低了物質(zhì)、勞力的成本和環(huán)境污染或延長(zhǎng)了這樣的植物產(chǎn)品(例如水果，種子等)的儲(chǔ)存期。
實(shí)驗(yàn)部分用于DNA分離、操作和擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方法以及用于重組DNA復(fù)制的適當(dāng)載體、適當(dāng)細(xì)菌菌株、選擇性標(biāo)記、培養(yǎng)基等例如在Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版；DNA克?、窈廷蚓?D.N.Glover編，1985)和從基因到克隆(E.L.Winnacker編，1987)中描述。體外抗真菌測(cè)試所有真菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Difco)上于25℃培養(yǎng)，除了灰葡萄孢和黑脛莖點(diǎn)霉在燕麥粉瓊脂(Difco)上于25℃生長(zhǎng)，致病疫霉在黑麥瓊脂上于18℃在黑暗中生長(zhǎng)(Caten和Jinks,1968)，灰葡萄孢和黑脛莖點(diǎn)霉在UV照射下培養(yǎng)。通過用水淹沒瓊脂平板收集形成孢子的真菌的孢子。將孢子的濃度調(diào)節(jié)到10000孢子/毫升。以立枯絲核菌和終極腐霉為例，在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中于25℃培養(yǎng)液體振蕩培養(yǎng)物。收集菌絲體并振蕩1分鐘以從這些振蕩培養(yǎng)物制備接種物。在通過細(xì)篩后，將接種物的濃度調(diào)節(jié)到每毫升2500-5000個(gè)片段，每個(gè)片段各含1-3個(gè)細(xì)胞。
對(duì)于形成孢子的真菌，所有真菌都在施用蛋白樣品之前有和沒有預(yù)先形成孢子的情況下進(jìn)行測(cè)試。對(duì)于不形成孢子的真菌，使用菌絲片段。
在純化期間，在根據(jù)Woloshuk等，1991所述使用真菌致病疫霉和終極腐霉或以相似的方法使用其它真菌的微量滴定板分析中監(jiān)測(cè)抗真菌活性。在24孔微量滴定板的每個(gè)孔中，用吸管加入250微升馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)。將對(duì)于例如致病疫霉的真菌孢子和例如對(duì)于終極腐霉的菌絲片段重新懸浮于水中，并向加樣孔加入50毫升400-600孢子或200片段。隨后加入100微升過濾滅菌(0.22微米)的蛋白溶液(在50mMMES中，pH6.0)。用Parafilm包住微量滴定板并在室溫下培養(yǎng)。在開始保溫之后的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，顯微監(jiān)測(cè)加入蛋白對(duì)真菌的影響。2-3天后，在加樣孔中生長(zhǎng)的真菌菌絲體用乳酚棉藍(lán)染色并評(píng)估生長(zhǎng)程度。
GI生長(zhǎng)抑制；使用0-4的評(píng)分，0=沒有可見的抑制，1=弱抑制(0-30％的抑制)，2=中度(30-60％)抑制，3=強(qiáng)(60-90％)抑制，4=非常強(qiáng)(100％)的抑制。實(shí)施例1從用水楊酸誘導(dǎo)的向日葵純化的抗真菌蛋白MS59
用10mM水楊酸鈉每天噴灑7-8周齡的向日葵(向日葵zenulon栽培品種)植株的葉子，共5次。3小時(shí)后，用水充分沖洗植物以除去水楊酸鈉。在最后噴灑3天后，將葉子(400克)收集到液氮中并使用Waring攪拌器在500毫升0.5M醋酸鈉(pH5.2)和4克活性炭中于4℃勻漿。將勻漿液在4層奶酪布(cheese cloth)上過濾并隨后將濾液于4℃，20000g離心50分鐘。將上清液通過S-Sephadex(Fast-flow,Pharmacia)柱，柱長(zhǎng)5厘米、直徑5厘米，用40mM醋酸鈉(pH5.2)平衡。用上述緩沖液(流速400-500毫升/小時(shí))洗柱直到OD280下降到0。結(jié)合的蛋白用含400毫摩爾氯化鈉的200毫升上述緩沖液洗脫。
在逆著50毫摩爾MES(pH6.0)透析之后，分析洗脫液的抗真菌活性。使用真菌致病疫霉和終極腐霉在微量滴定板分析中監(jiān)測(cè)抗真菌活性。參見上述關(guān)于體外測(cè)試的細(xì)節(jié)。隨后，再次使用陽離子交換層析，于是將洗脫液通過FPLC Mono-S HP5/5(Pharmacia)并用0-400毫摩爾的氯化鈉線性梯度洗脫。所有組分通過使用含有十二烷基硫酸鈉(SDS)的12.5％聚丙烯酰胺凝膠電泳[laemmli(1970)，自然，227:680-685]進(jìn)行分析，使用預(yù)染色的分子量標(biāo)記物(15-105千道爾頓)作為參考。另外，監(jiān)測(cè)所有組分針對(duì)致病疫霉和終極腐霉的抗真菌活性?？拐婢钚栽?5-60毫摩爾NaCl之間從柱中洗脫并且在所有活性組分中可見到59千道爾頓的條帶。將含有抗真菌活性的組分合并，并逆著含有1M硫酸銨的50毫摩爾磷酸鉀(pH7.0)透析。將合并液進(jìn)行疏水相互作用層析，于是將樣品上樣到以相同緩沖液平衡的FPLC苯基Superose HR5/5(Pharmacia)中并用含于50毫摩爾磷酸鉀(pH7.0)中的逐漸降低的1-0M硫酸銨線性梯度洗脫。如上所述再將所有組分在SDS-PAGE上分析并監(jiān)測(cè)抗真菌活性。也對(duì)不能與此柱結(jié)合的蛋白合并組分(FlowThrough,FT)在本文所選的條件下進(jìn)行這樣的分析。抗真菌活性最豐富地存在于FT中，其次也在0.76到0.45mM硫酸銨之間洗脫的組分中。對(duì)于這兩種情況，在SDS-PAGE中可見59千道爾頓的蛋白。將FT和梯度組分逆著50毫摩爾MES、0.2M氯化鈉透析并分別在用相同緩沖液平衡的FPLC Superdex75HR10/30柱上(Pharmacia)層析。根據(jù)分子量大小從該柱洗脫蛋白。另外對(duì)于這兩種情況，59千道爾頓蛋白的存在與如由SDS-PAGE和體外抗真菌測(cè)試判斷的針對(duì)致病疫霉和終極腐霉的抗真菌活性一致。在疏水相互作用柱的FT中存在的59千道爾頓蛋白是最豐富的，稱為MS59，其純化在圖1中可見。其在凝膠過濾柱上分離的結(jié)果和隨后在SDS-PAGE中和對(duì)致病疫霉的分析結(jié)果在圖2中表示。梯度蛋白和M59的幾個(gè)特征(抗真菌活性，層析特性，分子量)表明這兩個(gè)蛋白非常相似。
為了進(jìn)一步鑒定MS59，部分測(cè)定其氨基酸序列。因此，在上槽緩沖液含有0.1mM巰基乙酸鹽(thioglycolate)和12.5％聚丙烯酰胺凝膠上含有SDS的情況下分離MS59，該聚丙烯酰胺凝膠在上槽緩沖液含有0.05mM谷胱甘肽的情況下于50伏預(yù)電泳2小時(shí)。用含于45％(體積/體積)甲醇和10％乙酸中的5％(體積/體積)Serva Blue G對(duì)凝膠染色30分鐘并且在20％(體積/體積)醋酸中脫色30分鐘，切下59千道爾頓條帶并在Applied Biosystems477A蛋白測(cè)序儀上根據(jù)由制造商提供的方法利用埃德曼降解測(cè)序。MS59的N-末端氨基酸測(cè)序表明N-末端被封閉。為了獲得內(nèi)部序列，用胰蛋白酶消化MS59。胰蛋白酶在精氨酸和賴氨酸殘基處裂解蛋白。消化產(chǎn)物在反相柱上分離并通過埃德曼降解分析。對(duì)兩個(gè)胰蛋白酶裂解的片段進(jìn)行了測(cè)序Pep1和Pep2。Pep1的25個(gè)氨基酸殘基得到鑒定S-I-N-V-D-I-E-Q-E-T-A-W-V-Q-A-G-A-T-L-G-E-V-Y-Y-R(SEQ ID NO:1)。
氨基酸序列使用單字母符號(hào)給出。Pep2的25個(gè)氨基酸殘基進(jìn)一步得到鑒定D-P-S-F-P-I-T-G-E-V-Y-T-P-G-(？)-S-S-F-P-T-V-L-Q-N-Y(SEQ ID NO:2)。
括號(hào)內(nèi)的氨基酸殘基沒有得到明確鑒定。實(shí)施例2從天然PAGE洗脫抗真菌蛋白和隨后的測(cè)試從圖1和2明顯可以看到MS59不是完全純的。為了進(jìn)一步確定59千道爾頓蛋白確實(shí)對(duì)觀察到的抗真菌活性負(fù)責(zé)，使用與如上所述相同的系統(tǒng)，但是不含SDS并在上樣之前不煮沸樣品，使含有59千道爾頓峰值的組分在天然凝膠上電泳。將凝膠泳道切割成0.5厘米水平方向的小塊，每小塊單獨(dú)在50毫摩爾Mes(pH6)中洗脫48小時(shí)。離心后，所得上清在SDS-PAGE上進(jìn)行分析并分析其體外抗真菌活性。結(jié)果在圖3中表示。只在含有MS59的組分中觀察到針對(duì)致病疫霉和終極腐霉的抗真菌活性。實(shí)施例3針對(duì)非卵菌綱的體外抗真菌活性測(cè)試如在總實(shí)驗(yàn)部分中所述的進(jìn)行體外抗真菌活性測(cè)試。測(cè)試致病疫霉作為陽性對(duì)照。MS59峰定位于組分4。結(jié)果在表1表示。表1來自Mono-S(pH6)的含有MS59的組分的抗真菌效應(yīng)

*)孢子=未預(yù)先萌發(fā)，萌發(fā)=萌發(fā)至萌發(fā)管為孢子長(zhǎng)度的3-5倍，菌絲=菌絲片段用作起始接種物。
GI生長(zhǎng)抑制；使用0-4的評(píng)分，0=無可見的生長(zhǎng)抑制，1=弱(0-30％)抑制，2=中度(30-60％)抑制，3=強(qiáng)(60-90％)抑制，4=非常強(qiáng)(100％)的抑制。
可以看出，腐霉屬和疫霉屬種類看來對(duì)MS59非常敏感。實(shí)施例4從用水楊酸誘導(dǎo)的萵苣純化抗真菌蛋白WL64用10mM水楊酸鈉每天噴灑7-8周齡的萵苣植物(萵苣Lollobionda栽培品種)的葉子，共4天。2小時(shí)后，用水充分地沖洗植物以除去水楊酸鈉。在第5天，將葉子收集到液氮中并儲(chǔ)藏在-80℃直到進(jìn)一步使用。
將萵苣葉子凍融并使用Waring攪拌器在0.5M醋酸鈉(pH5.2)、0.1％β-巰基乙醇[萵苣∶緩沖液=1∶1.5(重量/體積)]和10克活性炭/每千克葉子中于4℃勻漿。將勻漿液于4℃，9000g離心60分鐘。隨后將上清液在10層奶酪布上過濾，用硫酸銨使濾液達(dá)到40％飽和度，于9000g離心30分鐘。對(duì)含有85％的蛋白和相對(duì)于粗勻漿液大于95％的抗真菌活性的所得上清進(jìn)行疏水相互作用層析。
將上清液用濾紙過濾并上樣到苯基Superose6FF High sub柱(Pharmacia，在Pharmacia XK50/20柱中的100毫升柱床體積)上，該柱用含于50毫摩爾磷酸鉀緩沖液(pH6.0中的40％(1.45M)硫酸銨(稱為緩沖液A)以10毫升/分鐘或更低的流速預(yù)平衡。用至少10倍柱體積的緩沖液A洗柱，之后在40分鐘期間用從100％緩沖液A到20％緩沖液A[50毫摩爾磷酸鉀(pH6.0)稱為緩沖液B]的降低的鹽梯度以10毫升/分鐘的流速，接著在30分鐘期間用從20％緩沖液A到0％緩沖液A(=100％B)的降低的線性梯度以相同的流速洗脫結(jié)合的蛋白。用緩沖液B洗滌該柱另一個(gè)45分鐘，之后洗脫結(jié)束。收集一分鐘級(jí)分組分(10毫升/分鐘)。組分40-75(稱為HIC峰)含有抗真菌活性。
將收集的組分濃縮[利用攪拌流動(dòng)器和YM30千道爾頓膜(Amicon)]并隨后用25mM醋酸鈉(pH4.5)稀釋15倍。以10毫升/分鐘的流速將該溶液上樣到預(yù)先安裝的Source S柱(16/20,Pharmacia)上。在用5倍柱體積的所述緩沖液洗柱之后，在60分鐘期間用逐漸增加的氯化鈉梯度[含于25mM醋酸鈉(pH4.5)中的0-0.4氯化鈉]以2.5毫升/分鐘從該柱洗脫蛋白，收集1分鐘級(jí)分組分。將組分收集到250微升的1M磷酸鉀(pH7.0)中以中和相對(duì)酸性的醋酸鈉緩沖液。將含有抗真菌活性的組分[組分25-45(0.2-0.3M氯化鈉)]合并并稱為Source S峰。
將Source S峰濃縮并且緩沖液換為25mM醋酸鈉(pH4.5)得到約10毫升的組分，并進(jìn)行使用Mono S柱(5/5,Pharmacia)的陽離子交換層析。用下面的氯化鈉梯度[含于25mM醋酸鈉(pH4.5)中的氯化鈉]洗脫0-5分鐘，0-0.1M氯化鈉；5-20分鐘，0.1-0.16M氯化鈉；20-21分鐘，0.16-0.25M氯化鈉；21-31分鐘，0.25M氯化鈉；31-32分鐘，0.25-1.0M氯化鈉；隨后用1.0M氯化鈉洗脫10分鐘，之后洗脫結(jié)束。抗真菌活性在0.25M氯化鈉步驟(通常組分22-30；Mono S峰)期間從該柱洗脫。以1毫升/分鐘的流速，將1毫升組分收集到100微升1M磷酸鉀(pH 7.0)中。
將Mono S峰濃縮至約0.5-1.0毫升并進(jìn)行用含于50mM磷酸鉀(pH7.0)中的200mM氯化鈉作為電泳緩沖液的凝膠過濾層析(Superdex75,10/30,Pharmacia)。樣品體積是200微升；流速是0.5毫升/分鐘；0.5毫升/級(jí)分組分。從柱中洗脫的抗真菌活性在66千道爾頓標(biāo)記物的位置。將活性組分(SD75峰)與SDS-PAGE上的蛋白模式比較，表明64千道爾頓蛋白是萵苣抗真菌蛋白最有可能的候選者(圖6A-C)。該蛋白稱為WL64。
將SD75峰緩沖液變換為pH9.5，并根據(jù)制造商的說明在Mono P柱(Pharmacia)上進(jìn)行層析聚焦(chromatophocusing)。盡管有一些分離(在流出物中有3個(gè)重疊峰)，但所有活性都在柱的流出物中發(fā)現(xiàn)(甚至對(duì)于將該柱平衡到pH11.0的情況)。流速是0.5毫升/分鐘；0.5毫升/級(jí)分組分。將含有抗真菌活性的組分合并，并且將緩沖液變換為50mMMES(pH6.0)。在SDS-PAGE之后對(duì)最高純化的蛋白組分進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，表明約6個(gè)蛋白條帶是最顯著的，其中兩個(gè)條帶為64千道爾頓和55千道爾頓，(圖7)。推測(cè)的兩個(gè)蛋白在最終組分中的相對(duì)量是64千道爾頓蛋白為1/6-1/8,55千道爾頓蛋白為1/2-1/3。雖然在凝膠上表明此柱明顯地對(duì)64千道爾頓蛋白進(jìn)行了純化，但是合并的組分中的比活以及蛋白的回收率下降了很多(參見表2)。
典型的純化步驟概括于表2中。表2 WL64的純化樣品或柱蛋白活性比活 純化回收率(毫克) (GI單位) (GI單位/mg) (X-倍)(％)萵苣(1.54毫克)提取物 685硫酸銨上清 584 101250 173 1 100HIC 17444000 253 1.46 43Source S 38.732400 837 4.84 32Mono S 2.3 8960 3896 22.5 8.8SD-75 0.452 8200 18142105 8.1Mono P 0.137 1752 12788 74 1.7活性以生長(zhǎng)抑制單位(GI單位)表示。4個(gè)GI單位代表在如實(shí)施例的常規(guī)部分所述的體外測(cè)試中導(dǎo)致100％的生長(zhǎng)抑制的蛋白量。實(shí)施例5從天然PAGE洗脫WL64和隨后的測(cè)試因?yàn)閃L64不是完全純的，所以需進(jìn)一步研究64千道爾頓蛋白是否確實(shí)對(duì)觀察到的抗真菌活性負(fù)責(zé)，在沒有SDS和β-巰基乙醇并且不煮沸樣品的情況下，將含有抗真菌活性峰值的Mono P組分于酸性條件下在天然的10％聚丙烯凝膠上電泳。將兩個(gè)鄰近的凝膠泳道切割成0.3厘米水平方向的小塊，一部分直接用于抗真菌測(cè)試，另一部分在變性條件下進(jìn)行SDS-PAGE。生長(zhǎng)抑制明顯與64千道爾頓蛋白相關(guān)，而不與55千道爾頓蛋白相關(guān)。實(shí)施例6WL64的糖基化按照說明通過與伴刀豆球蛋白A結(jié)合和采用洋地黃毒苷-葡聚糖檢測(cè)試劑盒(Boehringer)將WL64k以及55千道爾頓蛋白糖基化。兩種蛋白對(duì)糖肽酶-F處理不敏感，說明糖基化作用可能是O-連接的。實(shí)施例7WL64的氨基酸測(cè)序?yàn)榱诉M(jìn)行N-末端氨基酸序列測(cè)定，將21微克用量的純化蛋白(代表約4微克WL64)在7.5％聚丙烯酰胺凝膠上分離，并隨后吸印到PVDF膜上。用含于45％(體積/體積)甲醇，10％乙酸中的0.1％Serva Blue G在室溫下對(duì)膜染色5分鐘并且用45％甲醇，10％醋酸脫色。將64千道爾頓條帶切下并在Applied Biosystems477A蛋白測(cè)序儀上根據(jù)由制造商提供的方法利用埃德曼降解測(cè)序。
為了進(jìn)行內(nèi)部蛋白測(cè)序，將105微克純化蛋白(代表約20微克WL64)在7.5％SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離，隨后用含于20％甲醇和0.5％乙酸中的0.2％Serva Blue G在室溫下對(duì)凝膠染色20分鐘并用30％甲醇在室溫下脫色約1小時(shí)。將64千道爾頓條帶切下，隨后用胰蛋白酶消化蛋白。消化產(chǎn)物在反相柱上分離并通過埃德曼降解分析。
除了N-末端的序列(SEQ ID NO:49)，還對(duì)兩個(gè)胰蛋白酶裂解的片段進(jìn)行了測(cè)序(SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51)。
SEQ ID NO:49:Thr-Ser-Thr-Ser-Ile-Ile-Asp-Arg-Phe-Thr-Gln-(Cys/Ser)-Leu-Asn-Asn-Arg-Ala-Asp-Pro-(Ser)-(Phe)-SEQ ID NO:50:(Ser)-Ile-(？？？)-Val-(Ser)-Ile-Glu-Asp-Glu-Thr-Ala-(Trp)-Val-Gln-Ala-Gly-Ala-Thr-Leu-Gly-Glu-Val-Tyr-(Tyr)-SEQ ID NO:51:Ala-Asp-Pro-Ser-Phe-Pro-Leu-Ser-Gly-Gln-Leu-Tyr-Thr-Pro-括號(hào)內(nèi)的氨基酸殘基沒有得到明確鑒定。實(shí)施例8MS59和WL64的抗真菌活性根據(jù)MS59和WL64之間的序列同源性，兩個(gè)蛋白看來是互相非常相關(guān)的。這一點(diǎn)對(duì)于它們的抗真菌活性以及針對(duì)相應(yīng)真菌的比活可能是正確的。對(duì)此推測(cè)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果概括于表3中。表3MS59和WL64的抗真菌活性1病原體完全抑制(GI4)所需 完全抑制(GI4)所需的的WL64量 MS59量(ng/分析)(ng/分析)致病疫霉 105終極腐霉 105立枯絲核菌20 10Tanatephorus cucumeris20 未測(cè)試紫卷擔(dān)菌 15 7.5蔥核盤菌 40 20巴斯德畢赤酵母 未測(cè)試 5灰葡萄孢 200 101抗真菌測(cè)試按照總的實(shí)驗(yàn)部分中所述的進(jìn)行。
注意蛋白量通過在SDS-PAGE凝膠上的考馬斯亮藍(lán)染色估計(jì)，意味著此處所示的蛋白量是指示性的，而不是絕對(duì)的。實(shí)施例9氧化酶活性在冰上充分地對(duì)50毫升馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中的立枯絲核菌培養(yǎng)物進(jìn)行超聲處理，隨后在4℃以3000g離心20分鐘。然后將獲得的上清液以25000g離心1小時(shí)。沉淀用去離子水洗2次并重新懸浮于含有1.0％Triton X-100的1毫升水中。以這種方式獲得真菌細(xì)胞壁懸浮液。
根據(jù)Gallo,1981的方法(Gallo，酶學(xué)方法，71:665-668,1981)，使用試劑4-氨基-安替比林(4-AAP)測(cè)定氧化酶的活性。500微升的反應(yīng)體積中含有50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)，0.25微摩爾FAD,10毫摩爾NaN3,0.01％Triton X-100,6mM2,4,6-三溴羥基苯甲酸，2mM4-AAP和10個(gè)單位的辣根過氧化物酶。在510nm處測(cè)定過氧化氫的合成。包括已知量的過氧化氫作為標(biāo)準(zhǔn)。
WL64以及MS59利用真菌細(xì)胞壁懸浮液作為底物發(fā)揮氧化酶活性。隨后盡可能以不同的底物如一些碳水化合物和氨基酸(參見實(shí)施例10)進(jìn)行測(cè)試。發(fā)現(xiàn)葡萄糖和其它碳水化合物可作為WL64以及MS59的氧化酶活性底物。
因?yàn)閃L64和MS59表現(xiàn)碳水化合物氧化酶和特別地葡萄糖氧化酶活性，所以需要調(diào)查真菌細(xì)胞壁懸浮液是否可作為來自黑曲霉(Sigma,G2133)的葡萄糖氧化酶(GOX)的底物。的確是這種情況。如通過Lineweaver-Bruk圖所示的(圖8A)，動(dòng)力學(xué)研究表明葡萄糖用作底物時(shí)MS59、WL64和GOX表現(xiàn)Mochaelis-Menten動(dòng)力學(xué)。MS59和WL64的Km值比GOX的值低一個(gè)以上數(shù)量級(jí)對(duì)于WL64和MS59分別是19.5μM和23.3μM，對(duì)于GOX為359μM。這意味著MS59和WL64與葡萄糖的親和性高于GOX。然而WL64、MS59和GOX的Vmax值是相似的，分別為5.7,16.8,9.7μmol過氧化氫/分鐘/mg蛋白。
如圖8B所示，利用真菌細(xì)胞壁懸浮液作為底物的動(dòng)力學(xué)研究表明，對(duì)于MS59和WL64表現(xiàn)Mochaelis-Menten動(dòng)力學(xué)，但是對(duì)于GOX不是。利用上述的懸浮液，MS59和WL64的Km值分別是4.7μl和24.3μl。MS59和WL64的Vmax值分別為22.0和11.2μmol過氧化氫/分鐘/mg蛋白。由于GOX以真菌細(xì)胞壁作為底物的Lineweaver-Burk圖中不表現(xiàn)線性關(guān)系，所示不能從該圖中推斷出Km值和Vmax值。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)概括于表4中。表4MS59,WL64和葡萄糖氧化酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

實(shí)施例10底物特異性盡可能以不同的底物進(jìn)行測(cè)試。在蔗糖、山梨糖、果糖、羧甲基纖維素、β-丙氨酸、天冬氨酸、幾丁質(zhì)、纖維素、谷氨酸鹽，甘氨酸-甘氨酸、昆布糖和葡萄糖之中，只有后者可用作至少WL64的底物。各種底物的濃度可以在5mM和50mM之間變動(dòng)。進(jìn)一步調(diào)查是否對(duì)于MS59和WL64葡萄糖是唯一的底物或者其它碳水化合物也可以被氧化。酶測(cè)試按照實(shí)施例9所述的進(jìn)行，底物濃度是50mM。已證明GOX專一氧化葡萄糖(圖9)。相同的圖也表明MS59和WL64有更寬的底物特異性，即從C4糖到二糖和多糖的范圍。用D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、纖維二糖、麥芽糖和乳糖獲得了最高(和幾乎相同的活性)(圖9)。底物范圍類似于由己糖氧化酶(EC.1.1.3.5)轉(zhuǎn)化的范圍。實(shí)施例11與推測(cè)的MS59核苷酸序列同源的基因的鑒定和定性基于Pep1(SEQ ID NO:1的氨基酸12-22)和Pep2(SEQ ID NO:2的12-22氨基酸)的氨基酸序列，設(shè)計(jì)用于PCR的引物?；蚪MDNA從向日葵zebulon栽培品種分離，PCR引物4(5’AAC TTC TCC IAG IGTIGC ICC IGC TTG IAC CCA3’,SEQ ID NO:3)和5(5’GAT CCI TCTTTC CCI ATT ACT GGI GAG GTT TA3’,SEQ ID NO:4)用于進(jìn)行PCR從向日葵基因組擴(kuò)增354個(gè)堿基對(duì)的DNA片段。克隆相當(dāng)于該片段大小的PCR產(chǎn)物(SEQ ID NO:5)。對(duì)產(chǎn)物的序列分析表明存在未間斷的開放閱讀框架(ORF)(SEQ ID NO:6)，其中氨基酸從頭到尾與SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列一致。測(cè)序的幾個(gè)克隆在PCR片段中含有1-4個(gè)點(diǎn)突變。除了一個(gè)突變外，所有這些突變都是沉默突變(核苷酸57位的T突變?yōu)镃，核苷酸63位的C突變?yōu)锳，核苷酸225位的A突變?yōu)镚)，因此它不改變編碼的氨基酸序列。但是一個(gè)克隆的確含有點(diǎn)突變(核苷酸203位的G突變?yōu)锳)，它改變氨基酸序列，即68位氨基酸從精氨酸變?yōu)橘嚢彼帷?br> 用SEQ ID NO:5探測(cè)向日葵基因組DNA的southern印跡表明基因組中存在大量同源序列。使用SphⅠ，探測(cè)到6個(gè)條帶；EcoRV,5個(gè)條帶；SpeⅠ,3個(gè)條帶而NdeⅠ,4個(gè)條帶。以前用其它酶已觀察到3-4個(gè)條帶。此分析表明存在與MS59序列有(部分)同源性的3個(gè)基因。
根據(jù)原始PCR引物序列之間的不可變區(qū)域設(shè)計(jì)新的PCR引物。引物對(duì)于3’RACE:5’CAG GCA GCT GTG GTT TGT GGC 3’(SEQID NO:7)，對(duì)于5’RACE:5’GTC CAC AAT GAA GAA GGG TTG 3’(SEQID NO:8)，對(duì)于嵌套式3’RACE:5’ACG TAG ATA TCG AAC AAGAAA CCG C3’(SEQ ID NO:9)。
從用10mM水楊酸鈉溶液噴灑5次誘導(dǎo)的向日葵葉子材料分離含多聚腺苷酸化的RNA。制備cDNA并按照MarathonTM試劑盒(Clontech實(shí)驗(yàn)室公司，Palo Alto,CA)說明書中所述的進(jìn)行5’和3’RACE PCR反應(yīng)。通過5’和3’RACE PCR反應(yīng)分離了部分cDNA克隆。序列分析證實(shí)了部分cDNA克隆的相同性。
然后根據(jù)從克隆的5’和3’RACE PCR產(chǎn)物新獲得的序列信息設(shè)計(jì)新的PCR和嵌套式PCR引物。用于5’RACE的引物:5’CTG GGGAAG CCC GTG TAG TAA AGC3’(SEQ ID NO:11),5’CGG GAAGTT GCA GAA GAT TGG GTT G3’(SEQ ID NO:13)，對(duì)于嵌套式5’RACE:5’GAG CAA GAG AAG AAG GAG AC3’(SEQ ID NO:14)，對(duì)于3’RACE:5’GCT TTA CTA CAC GGG CTT CCC CAG3’(SEQID NO:10)，對(duì)于嵌套式3’RACE:5’GGT ACT CCA ACC ACG GCGCTC3’(SEQ ID NO:12)。分離4個(gè)部分cDNA克隆，它們加在一起編碼完整開放閱讀框架，此開放閱讀框架包含推測(cè)的信號(hào)肽，后面接著約59千道爾頓的蛋白及5’和3’UTR(未翻譯區(qū)域)(SEQ ID NO:15)。其ORF(21位至1608位)編碼529個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO:16)的1784個(gè)堿基對(duì)的全長(zhǎng)cDNA克隆可由這4個(gè)部分cDNA克隆和上述的PCR片段(SEQ ID NO:5)裝配起來。
氨基末端的信號(hào)序列(Von Heijne等，1983和Von Heijne等，1985)很可能不是完整地存在于起始的19個(gè)氨基酸殘基中。預(yù)測(cè)了推測(cè)的裂解位點(diǎn)。
將該cDNA克隆的氨基酸序列用于BLAST同源性研究。該序列表現(xiàn)與來自花菱草(Eschscholtzia californica)(Dittrich和Kutchan,1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)。88,9969-9973)和罌粟(Papaversomniferum)(Facchini等，1996，植物生理學(xué)，112,1669-1677)的黃連素橋酶(BBE)有很高的同源性。
用SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列對(duì)表達(dá)序列標(biāo)簽(dbEST)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST篩選，揭示了擬南芥(SEQ ID NO:21-SEQ IDNO:47)和水稻(SEQ ID NO:48)中MS59蛋白的同系物。
根據(jù)與MS59同源的方向?qū)ST序列以有義方向列出。通過在移碼位置插入一個(gè)或兩個(gè)額外的未知核苷酸(N或NN)來改變EST克隆的序列以獲得與MS59同源的單個(gè)翻譯框架。實(shí)施例12編碼WL64的基因的分離和其核苷酸序列的測(cè)定根據(jù)WL64蛋白氨基末端的氨基酸序列(SEQ ID NO:49,Thr-Ser-Thr-Ser-Ile-Ile-Asp-Arg-Phe-Thr-Gin-(Cys/Ser)-Leu-Asn-Asn-Arg-Ala-Asp-Pro-(Ser)-(Phe)-)，設(shè)計(jì)PCR引物(SEQ ID NO:49的氨基酸1-11)。
N-末端的氨基酸序列(SEQ ID NO:49)表現(xiàn)與MS59蛋白(SEQID NO:16的20-39氨基酸殘基)的相應(yīng)部分有很高的同源性。
從用10mM的水楊酸鈉溶液噴灑5次誘導(dǎo)的萵苣(萵苣LoHobionda變種)葉子分離含有多聚腺苷酸化的RNA，并從此RNA制備cDNA。PCR引物FR-WL64-142(5’ACT TCT ACT TCT ATT ATTGAT AGG TTT ACT CA3’,SEQ ID NO:52)和MS59引物4(5’AACTTC TCC IAG IGT IGC ICC IGC TTG IAC CCA3’,SEQ ID NO:3)用于從萵苣cDNA庫擴(kuò)增405個(gè)堿基對(duì)的片段?？寺?duì)應(yīng)于此PCR片段的PCR產(chǎn)物并測(cè)序(SEQ ID NO:53)，揭示了未間斷的開放閱讀框架(SEQ ID NO:54)。表5表現(xiàn)與MS59有同源性的EST序列將移碼導(dǎo)入以優(yōu)化EST與MS59序列的匹配。在用移碼1和移碼2的欄中，列出了移碼和移動(dòng)(框架--→框架)的位置。(-)標(biāo)記是指沒有移碼存在。

根據(jù)定位于原始PCR引物之間的SEQ ID NO:53的序列設(shè)計(jì)新的PCR引物。用于5’RACE:5’CAC GTT TAT GGA GCG TAA GTTGAA C3’(SEQ ID NO:55)和用于3’RACE:5’CAC CCT TCA CACATT CAA GCA GC3’(SEQ ID NO:56)的引物得到合成并用于按照MarathonTMcDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech實(shí)驗(yàn)室公司，Palo Alto,CA)說明書中所述進(jìn)行5’和3’RACE PCR反應(yīng)。通過5’和3’RACE PCR反應(yīng)擴(kuò)增了兩個(gè)部分cDNA克隆。序列分析證實(shí)了部分cDNA克隆的相同性，它們加在一起編碼完整開放閱讀框架，此開放閱讀框架包含推測(cè)的信號(hào)肽及5’和3’UTR(未翻譯區(qū)域)。1981個(gè)堿基對(duì)的全長(zhǎng)cDNA克隆得到裝配，其ORF(7位至1629位)編碼540個(gè)氨基酸殘基(SEQ IDNO:58)。氨基末端的信號(hào)序列由起始的27個(gè)氨基酸殘基代表。實(shí)施例13來自罌粟和花菱草的黃連素橋酶基因的鑒定和分離從完全發(fā)育的花菱草和罌粟(變種Marianne)植物的葉子制備基因組DNA。
設(shè)計(jì)花菱草基因(EcBBE)的引物，在成熟蛋白的起始處(5’GGTAAT GAT CTC CTT TCT TGT TTG ACC3’,SEQ ID NO:59)和終止密碼子(5’AGA GCG GCC GCT ATA TTA CAA CTT CTC CACCAT CAC TCC TC3’,SEQ ID NO:60)緊接TAG終止密碼子的下游導(dǎo)入NotⅠ限制性位點(diǎn)。
對(duì)于罌粟基因(PsBBE)，以相似的方式設(shè)計(jì)引物，在推測(cè)的成熟蛋白的起始處(5’GGT GAT GTT AAT GAT AAT CTC CTC3’,SEQ IDNO:61)和TAG終止密碼子處(5’AGA GCG GCC ACA ATT CCT TCAACA TGT AAA TTT CCT C3’,SEQ ID NO:62)導(dǎo)入NotⅠ限制性位點(diǎn)。
這些引物用于擴(kuò)增兩個(gè)BBE基因的成熟蛋白部分。
PCR產(chǎn)物用NotⅠ消化并連接入用EcoRⅤ和NotⅠ消化的pET32a載體(Novagen,Madison,WI)中。采用限制性酶分析和DNA測(cè)序證實(shí)片段的正確插入。實(shí)施例14從擬南芥鑒定和分離MS59的同系物在我們的BLAST篩選中，鑒定了與MS59有同源性的26個(gè)EST。在水稻中發(fā)現(xiàn)一種EST，其余的25個(gè)都在擬南芥中發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)同源EST覆蓋了全長(zhǎng)MS59序列。對(duì)擬南芥表達(dá)序列標(biāo)簽的分析發(fā)現(xiàn)在蛋白的5’末端有高度同源性的3個(gè)EST(SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:39和SEQ IDNO:40)，其中SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40是重疊序列。MS59的3’部分表現(xiàn)與7個(gè)EST序列(SEQ ID NO:24,27,32,34,41,43和45)有同源性，其中SEQ ID NO:24與SEQ ID NO:43重疊和SEQ ID NO:32與SEQ ID NO:45重疊。
設(shè)計(jì)與MS59的5’部分(SEQ ID NO:16)同源的兩個(gè)不同EST位于推測(cè)的成熟蛋白部分的起始處的引物(根據(jù)由Von Heijne等，1983和VonHeijne等，1985所述的保守序列推測(cè)可能的裂解位點(diǎn))。
如果與MS59氨基酸序列(SEQ ID NO:16)比較，由SEQ ID NO:21代表的EST序列可能丟失了推測(cè)成熟蛋白部分的開始3個(gè)氨基酸殘基，因此通過在引物的5’末端包含9個(gè)核苷酸來導(dǎo)入SEQ ID NO:16的氨基酸殘基20-22。
位于SEQ ID NO:21的5’端的引物加入了MS59(SEQ ID NO:16)的20-22位殘基5’ACT TCC CGT AGA AAC TCG GAG ACT TTCACA CAA TGC3’(SEQ ID NO:63)。
位于SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的推測(cè)的裂解位點(diǎn)之后的引物5’TCC ATC CAA GAT CAA TTC ATA AAC TGT GTC(SEQ IDNO:64)。
制備與MS59氨基酸序列(SEQ ID NO:16)的3’部分同源的5個(gè)不同EST位于終止密碼子周圍的引物，并且導(dǎo)入了NotⅠ限制性位點(diǎn)以克隆入pET32a大腸桿菌表達(dá)載體。
位于SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:43的引物5’AGA GCGGCC GCT TTC ATG AAC CTA GCT TCT ATG AGG3’(SEQ IDNO:65)。位于SEQ ID NO:27的引物5’AGA GCG GCC GCG AAATGG CCC CCC TTT TAA AAC GGG G3’(SEQ ID NO:66)。位于SEQID NO:32和SEQ ID NO:41的引物5’AGA GCG GCC GCA AATGAT ATC TTC AGG TAA CTT TGT TCA C(SEQ ID NO:67)。位于SEQ ID NO:34的引物5’AGA GCG GCC GCA TAA TCA AAT AAATCA ACT TAT GGT AAC ACA G(SEQ ID NO:68)和位于SEQ IDNO:45的引物5’AGA GCG GCC GCT GGT TTT GTA TTG AGGACT CAA AAC AG3’(SEQ ID NO:69)。
將5’引物和3’引物的所有可能的結(jié)合用于對(duì)從擬南芥哥倫比亞栽培品種分離的基因組DNA進(jìn)行PCR。在使用SEQ ID NO:63和SEQ IDNO:68引物的PCR中，擴(kuò)增到約1800個(gè)堿基對(duì)的條帶。將該條帶克隆，通過DNA測(cè)序證實(shí)PCR產(chǎn)物的相同性。1757個(gè)堿基對(duì)的克隆的PCR產(chǎn)物(SEQ ID NO:70)含有從570位到801位的內(nèi)含子，SEQ ID NO:70的開放閱讀框架由508個(gè)氨基酸殘基組成(SEQ ID NO:71)。
從擬南芥Col-0的在Murashige和Skoog瓊脂上黑暗中生長(zhǎng)的12天齡無菌幼苗，從在液體Murashige和Skoog培養(yǎng)基上和16小時(shí)光周期下生長(zhǎng)的12天齡無菌幼苗，從充分生長(zhǎng)的植物葉、莖、花和長(zhǎng)角果分離總RNA(Newman等，1994，植物生理學(xué)106:1241-1255)。合并來自不同發(fā)育階段的RNA。采用多聚腺苷酸QuickmRNA分離試劑盒(Stratagene,La Jolla,CA)分離多聚腺苷酸化RNA并采用MarathonTMcDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech實(shí)驗(yàn)室公司，Palo Alto,CA)制備cDNA。
用不同的5’引物和3’引物的結(jié)合對(duì)cDNA庫進(jìn)行PCR反應(yīng)。用SEQID NO:63和SEQ ID NO:68引物結(jié)合擴(kuò)增到約1600個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物克隆到在細(xì)菌表達(dá)載體pET32a(Novagen,Madison,WI)的EcoRⅤ和NotⅠ限制性位點(diǎn)之間。PCR產(chǎn)物的序列得到測(cè)定，并揭示了代表508個(gè)氨基酸殘基的蛋白(SEQ ID NO:73)的1527個(gè)堿基對(duì)的未間斷開放閱讀框架(SEQ ID NO:72)。
用SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65引物結(jié)合擴(kuò)增到約1600個(gè)堿基對(duì)的第二個(gè)cDNA克隆。也將此cDNA克隆連接到pET32a載體(Novagen,Madison,WI)的EcoRⅤ和NotⅠ限制性位點(diǎn)之間。此cDNAPCR克隆也通過DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定，它包含編碼509個(gè)氨基酸殘基(SEQID NO:75)的1530個(gè)堿基對(duì)的未間斷開放閱讀框架(SEQ ID NO:74)。實(shí)施例15MS59，來自罌粟和花菱草的MS59，黃連素橋酶和來自擬南芥哥倫比亞栽培品種的兩個(gè)同源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)將含有推測(cè)的MS59成熟部分的PCR片段導(dǎo)入pET32a載體(Novagen,Madison,WI)并使用DNA測(cè)序證實(shí)片段的正確插入。然后，將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌AD494(DE3)pLysS(Novagen,Madison,WI)。然后開始制備幾個(gè)克隆的少量培養(yǎng)物，其中一半通過加入IPTG至1mM終濃度進(jìn)行誘導(dǎo)。來自大腸桿菌的總提取物在SDS凝膠上電泳，并且通過考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行分析。幾個(gè)克隆表現(xiàn)大大地過量表達(dá)MS59蛋白。選擇大大過量表達(dá)的克隆用于大量培養(yǎng)。用此大腸桿菌培養(yǎng)物接種入補(bǔ)充了0.4mM葡萄糖的500毫升LB中并使之生長(zhǎng)到光密度為0.5-0.7。然后加入IPTG至1mM終濃度并使之在30℃合成蛋白3小時(shí)。大多數(shù)MS59蛋白在不溶的蛋白組分中發(fā)現(xiàn)，少量看來是溶解的。所得的不溶蛋白制品主要含有MS59蛋白。將此制品用于制備抗體(實(shí)施例17)。將溶解組分用于體外測(cè)試以檢測(cè)MS59是否仍然表現(xiàn)抗真菌活性。
將含有4個(gè)MS59/WL64同系物的開放閱讀框架的pET32a質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌AD494(DE3)pLysS(Novagen,Madison,WI)。使幾個(gè)獨(dú)立克隆的小量培養(yǎng)物生長(zhǎng)至光密度0.5-0.7。然后加入IPTG到1mM終濃度并使之于30℃合成蛋白3小時(shí)。
分離溶解的和總的蛋白組分。使用SDS-PAGE分析樣品，隨后進(jìn)行Neuhoff染色和使用S-Tag Western檢測(cè)試劑盒(Novagen,Madison,WI)的Western分析。大部分蛋白在不溶的組分中發(fā)現(xiàn)，只有少量看來是溶解的。選擇強(qiáng)烈過量表達(dá)同系物蛋白的克隆用于以1.5升大量培養(yǎng)物生產(chǎn)蛋白。實(shí)施例16MS59，來自花菱草和罌粟的MS59,MS59/WL64同系物和來自擬南芥的兩個(gè)同源蛋白的體外抗真菌活性測(cè)試在大腸桿菌中合成含有N-末端trxA-,His-和S-Tag的MS59蛋白。His-Tag用于在帶Ni2+的IMAC(固定金屬親和層析)柱上純化溶解的MS59。通過逐漸提高咪唑濃度洗脫結(jié)合的蛋白。此純化的峰組分含有一些污染的大腸桿菌蛋白。
將此MS59純化的峰組分逆著50mM MES(pH6.0)透析，并用于使用致病疫霉和終極腐霉的體外測(cè)試。對(duì)于用致病疫霉和終極腐霉進(jìn)行體外抗真菌活性測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)方法，參見上文。
作為對(duì)照處理，我們以一些大腸桿菌蛋白背景測(cè)試了從相同表達(dá)宿主純化的不相關(guān)的組氨酸標(biāo)鑒蛋白。也包括煮沸的MS59對(duì)照(在100℃加熱10分鐘)。在致病疫霉測(cè)試中測(cè)試約40納克融合蛋白，此用量的兩倍用于終極腐霉抑制測(cè)試。
用Parafilm包住微量滴定板盤并在黑暗中室溫下培養(yǎng)。2-3天后，加樣孔中正在生長(zhǎng)的真菌菌絲體用乳酚棉蘭染色并評(píng)估其生長(zhǎng)程度。
來自含有MS59的大腸桿菌可溶組分的IMAC組分在20-40納克濃度時(shí)表現(xiàn)對(duì)致病疫霉和終極腐霉的完全抑制。表6來自大腸桿菌的MS59對(duì)致病疫霉的抗真菌效應(yīng)

以0(沒有抑制作用)到4(完全抑制生長(zhǎng))的線性評(píng)分對(duì)生長(zhǎng)抑制(GI)進(jìn)行目測(cè)評(píng)估。表7來自大腸桿菌的MS59對(duì)致病疫霉的抗真菌效應(yīng)

加樣孔的顯微分析表明在各個(gè)對(duì)照中致病疫霉游動(dòng)孢子的快速萌發(fā)和隨后的生長(zhǎng)。在含有來自大腸桿菌的MS59的反應(yīng)物中的萌發(fā)幾乎完全受到抑制。一些孢子的確萌發(fā)，但是菌絲尖生長(zhǎng)看來在起始之后立即停止。48小時(shí)后，致病疫霉菌絲體的生長(zhǎng)在對(duì)照中很充分，但在含有MS59的測(cè)試中幾乎檢測(cè)不到。甚至在72小時(shí)后也基本上沒有觀察到生長(zhǎng)。在含有MS59的反應(yīng)物中真菌菌絲體看似粒狀并且變稠。與大腸桿菌合成的MS59一起培養(yǎng)的真菌生長(zhǎng)的典型模式的例子在圖4中表示。48小時(shí)和72小時(shí)后，對(duì)照培養(yǎng)中的真菌生長(zhǎng)是如此地充分以致無法采到可攝影的材料。存在MS59時(shí)的培養(yǎng)導(dǎo)致進(jìn)一步生長(zhǎng)的完全抑制，在24小時(shí)觀察到的萌芽管沒有明顯的進(jìn)一步延伸。
同樣，在終極腐霉抑制測(cè)試中，如果使用菌絲體片段，對(duì)于用MS59處理沒有明顯的生長(zhǎng)(參見圖5)。24小時(shí)后，對(duì)照反應(yīng)物菌絲體完全過度生長(zhǎng)。MS59處理的樣品中在該階段只有小的菌絲體片段。
在大腸桿菌(pET32a)中表達(dá)罌粟同系物并測(cè)試對(duì)致病疫霉和終極腐霉的體外抗真菌活性。將致病疫霉的孢子和終極腐霉的菌絲片段分別懸浮于無菌水或馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)中。向各個(gè)加樣孔加入400-600個(gè)孢子或200片段/50微升。
用IMAC柱層析部分純化表達(dá)的蛋白。將含有表達(dá)的蛋白的組分變換到50mM MSE(pH6.0)緩沖液(過濾滅菌)中并用IMAC純化的大腸桿菌pET-MS59作為陽性對(duì)照測(cè)試其抗真菌活性。
對(duì)于花菱草和罌粟的MS59/WL64同系物，沒有觀察到抗真菌活性，甚至在比陽性對(duì)照高10倍的濃度下也沒有導(dǎo)致對(duì)兩種真菌的100％生長(zhǎng)抑制。這意味著這些大腸桿菌表達(dá)的蛋白沒有正確的折疊，因此沒有表現(xiàn)生物學(xué)活性。實(shí)施例17針對(duì)變性MS59制備抗體在兔中針對(duì)變性MS59(來自不溶的大腸桿菌組分的可溶化形式)制備抗體。該抗體表現(xiàn)僅與具有抗真菌活性和葡萄糖氧化酶活性的pMOG1180煙草植株的IF(實(shí)施例18和19)中的約60千道爾頓條帶有交叉反應(yīng)。令人驚奇的是，沒有發(fā)現(xiàn)與WL64的交叉反應(yīng)。實(shí)施例18構(gòu)建MS59克隆以在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)基于ATG起始密碼子和TGA終止密碼子周圍的序列設(shè)計(jì)PCR引物以用于克隆開放閱讀框架(ORF)。通過使用引物5’CC GCC ATGGAG ACT TCC ATT CTT ACT C3’(SEQ ID NO:16)進(jìn)行PCR在ATG起始密碼子處導(dǎo)入NcoⅠ限制性位點(diǎn)用于與組成型啟動(dòng)子融合。由于導(dǎo)入的NcoⅠ限制性位點(diǎn)，將ORF的第二個(gè)密碼子從caa(Q)變?yōu)間ag(E)。
通過使用引物5’GCC GGA TCC TCA AGA TGA CAA AGTTGG GAT GCT3’(SEQ ID NO:18)進(jìn)行PCR在TGA終止密碼子的下游導(dǎo)入BamHⅠ限制性位點(diǎn)。
用pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，我們利用PCR引物擴(kuò)增完整ORF以在起始密碼子處導(dǎo)入NcoⅠ限制性位點(diǎn)并在緊接終止密碼子的下游導(dǎo)入BamHⅠ限制性位點(diǎn)。通過測(cè)序證實(shí)DNA序列的正確性(SEQ IDNO:19)。將整個(gè)ORF與允許在大部分植物中高水平蛋白表達(dá)的組成型啟動(dòng)子連接。在ORF后導(dǎo)入含有多聚腺苷酸化所需序列(An等，1989，植物細(xì)胞，1,115-122)的馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅱ的3’非翻譯區(qū)域(Thirnburg等，1987，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，84,744-748)。將得到的嵌合基因?qū)腚p元載體pMOG800(于1993年8月12日保藏于真菌菌種保藏中心，Barrn，荷蘭，保藏號(hào)為CBS414.93)。將獲得的攜帶在ocs-mas雜交啟動(dòng)子(WO95/14098)控制下的MS59構(gòu)建體的pMOG1180克隆導(dǎo)入適于轉(zhuǎn)化目的農(nóng)作物番茄和馬鈴薯的根瘤農(nóng)桿菌EHA105菌株，適于轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥的MOG101菌株和適于轉(zhuǎn)化歐洲油菜的MOG301。實(shí)施例19含有MS59基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯植株的制備和分析利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將含有如實(shí)施例18所述的MS59基因構(gòu)建體的雙元構(gòu)建體導(dǎo)入煙草和馬鈴薯。使這些不同植物種類的轉(zhuǎn)基因幼苗再生為完整植株，隨后，分析原始轉(zhuǎn)化子中新導(dǎo)入的MS59基因的表達(dá)。采用對(duì)與BSA偶聯(lián)的MS59肽特異的抗體進(jìn)行此Western印跡技術(shù)分析。以1∶5000稀釋所有抗血清。使用純化蛋白的一系列濃度(12.5,25,50和100納克)來鑒定轉(zhuǎn)基因植物中導(dǎo)入蛋白的表達(dá)水平。將轉(zhuǎn)基因樣品在50mM醋酸鈉緩沖液(pH5.2)中勻漿并通過離心使提取物澄清。將上清液直接用于分析或在冰上放置過夜以沉淀。過夜沉淀之后總是隨后進(jìn)行澄清(通過離心)。使用Bradford試劑(Bradford,1976，生物化學(xué)分析，72,248-254)和BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白以任一方式測(cè)定所得上清的蛋白濃度。將盡可能多的蛋白(但不超過10納克)上樣到12.5％聚丙烯酰胺凝膠(laemmli，同上)上并且如前所述進(jìn)行免疫印跡(Ponstein等，同上)。
通過在含50mM醋酸鈉的緩沖液(pH5.2)中研磨葉段從MS59轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯植物制備提取物。之后，通過離心去除不溶性蛋白。測(cè)定溶解蛋白總含量并且將10微克等價(jià)物上樣到SDS凝膠上。在凝膠電泳之后，將蛋白轉(zhuǎn)移成印跡。利用針對(duì)純化MS59制備的抗血清(實(shí)施例17)使此印跡顯色。MS59特異的抗血清以1∶5000稀釋度使用。純化MS59也在膠的另一側(cè)電泳，并包括它作為參考。根據(jù)MS59蛋白的高水平表達(dá)選擇的轉(zhuǎn)化植物和S1子代植物在真菌抗性測(cè)試中得到測(cè)試。實(shí)施例20從煙草轉(zhuǎn)基因植株純化MS59轉(zhuǎn)基因蛋白制備組成型表達(dá)MS59的轉(zhuǎn)基因煙草植株。利用Western分析測(cè)定表達(dá)水平。對(duì)轉(zhuǎn)基因材料的提取物進(jìn)行針對(duì)致病疫霉和終極腐霉的體外生長(zhǎng)抑制活性測(cè)試。從含有pMOG1180構(gòu)建體(mas-ocs-啟動(dòng)子-MS59)的煙草和煙草對(duì)照株系的體外葉子制備小量總提取物。通過在50mM醋酸鈉(pH5.2)中研磨葉片材料來制備提取物。將上清液逆著50mM MES(pH6.0)透析并按照在總的實(shí)驗(yàn)部分所述的方法測(cè)試體外抗真菌活性。與其它株系或?qū)φ罩晗迪啾?，一些煙草pMOG1180株系表現(xiàn)針對(duì)致病疫霉和終極腐霉的高抗真菌活性。實(shí)施例21碳水化合物氧化酶活性/MS59在轉(zhuǎn)基因煙草中的定位測(cè)試等量的部分純化的溶解MS59和溶解的同系物組分(罌粟，花菱草，擬南芥A11和B7)的碳水化合物氧化酶活性。MS59的碳水化合物氧化酶活性是0.011ODu/分鐘，同系物為0.0003-0.0012ODu/分鐘，差距是10倍。
在后階段，從表現(xiàn)體外抗真菌活性的實(shí)施例20的轉(zhuǎn)基因煙草pMOG1180株系分離IF并用于測(cè)試碳水化合物氧化酶活性。在IF分離后留下的物質(zhì)(稱為“-IF”)也用于測(cè)試。表現(xiàn)抗真菌活性的相同株系具有高碳水化合物氧化酶活性。該活性定位于IF。實(shí)施例22將含有在組成型植物啟動(dòng)子控制下的Chi-Ⅰ、GluⅠ、AP24和MS59的4個(gè)基因構(gòu)建體導(dǎo)入番茄、馬鈴薯、胡蘿卜、歐洲油菜和擬南芥采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，將含有編碼Chi-Ⅰ,Glu-Ⅰ,AP24和MS59的基因的雙元構(gòu)建體pMOG1145和pMOG1180或含有編碼Chi-Ⅰ,Glu-Ⅰ,bPR-1和MS59的pMOG1146導(dǎo)入不同農(nóng)作物種類，包括番茄、馬鈴薯、胡蘿卜、歐洲油菜和擬南芥。在真菌侵染測(cè)試中測(cè)試S1子代植株。
序列表(1)基本信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)名稱MOGEN International nv(B)街道Einsteinweg97(C)城市Leiden(E)國(guó)家荷蘭(F)郵編(ZIP):2333CB(G)電話31-(0)71-5258282(H)電傳31-(0)71-5221471(ⅱ)發(fā)明名稱抗真菌蛋白及其編碼DNA和摻入此DNA的宿主(ⅲ)序列數(shù)75(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentln Release#1.0，版本#1.25(EPO)(ⅵ)優(yōu)先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朎P96.202.466.7(B)申請(qǐng)日1996年9月4日(ⅵ)優(yōu)先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朎P97.200.831.2(B)申請(qǐng)日1997年3月10日(2)關(guān)于SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅵ)原始來源(A)生物向日葵(B)株系栽培品種zebulon(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1Ser Ile Asn Val Asp Ile Glu Gln Glu Thr Ala Trp Val Gln Ala Gly1 5 10 15Ala Thr Leu Gly Glu Val Tyr Tyr Arg20 25(2)關(guān)于SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅵ)原始來源(A)生物向日葵(B)株系栽培品種zebulon(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Asp Pro Ser Phe Pro Ile Thr Gly Glu Val Tyr Thr Pro Gly Xaa Ser1 5 10 15Ser Phe Pro Thr Val Leu Gln Asn Tyr20 25(2)關(guān)于SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mis-特征(B)位置1(D)其它信息/功能=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3AACTTCTCCN AGNGTNGCNC CNGCTTGNAC CCA 33(2)關(guān)于SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)是
(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mis-特征(B)位置1(D)其它信息/功能=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GATCCNTCTT TCCCNATTAC TGGNGAGGTT TA32(2)關(guān)于SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度354個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物向日葵(B)株系栽培品種zebulon(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..354(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:GAT CCG TCT TTC CCG ATT ACT GGG GAG GTT TAC ACT CCC GGA AAC TCA 48Asp Pro Ser Phe Pro Ile Thr Gly Glu Val Tyr Thr Pro Gly Asn Ser1 5 10 15TCT TTT CCT ACC GTC TTG CAA AAC TAC ATC CGA AAC CTT CGG TTC AAT 96Ser Phe Pro Thr Val Leu Gln Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Arg Phe Asn20 25 30GAA ACT ACC ACA CCA AAA CCC TTT TTA ATC ATC ACA GCC GAA CAT GTT 144Glu Thr Thr Thr Pro Lys Pro Phe Leu Ile Ile Thr Ala Glu His Val35 40 45TCC CAC ATT CAG GCA GCT GTG GTT TGT GGC AAA CAA AAC CGG TTG CTA 192Ser His Ile Gln Ala Ala Val Val Cys Gly Lys Gln Asn Arg Leu Leu50 55 60CTG AAA ACC AGA AGC GGT GGT CAT GAT TAT GAA GGT CTT TCC TAC CTT 240Leu Lys Thr Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Leu65 70 75 80ACA AAC ACA AAC CAA CCC TTC TTC ATT GTG GAC ATG TTC AAT TTA AGG 288Thr Asn Thr Asn Gln Pro Phe Phe Ile Val Asp Met Phe Asn Leu Arg85 90 95TCC ATA AAC GTA GAT ATC GAA CAA GAA ACC GCA TGG GTC CAA GCC GGC 336Ser Ile Asn Val Asp Ile Glu Gln Glu Thr Ala Trp Val Gln Ala Gly100 105 110GCC ACC CTC GGA GAA GTT 354Ala Thr Leu Gly Glu Val115(2)關(guān)于SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6Asp Pro Ser Phe Pro Ile Thr Gly Glu Val Tyr Thr Pro Gly Asn Ser1 5 10 15Ser Phe Pro Thr Val Leu Gln Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Arg Phe Asn20 25 30Glu Thr Thr Thr Pro Lys Pro Phe Leu Ile Ile Thr Ala Glu His Val35 40 45Ser His Ile Gln Ala Ala Val Val Cys Gly Lys Gln Asn Arg Leu Leu50 55 60Leu Lys Thr Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Leu65 70 75 80Thr Asn Thr Asn Gln Pro Phe Phe Ile Val Asp Met Phe Asn Leu Arg85 90 95Ser Ile Asn Val Asp Ile Glu Gln Glu Thr Ala Trp Val Gln Ala Gly100 105 110Ala Thr Leu Gly Glu Val115(2)關(guān)于SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)位置1(D)其它信息/功能=“引物”(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:7:CAGGCAGCTG TGGTTTGTGG C 21(2)關(guān)于SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)位置1
(D)其它信息/功能=“引物”(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:8:GTCCACAATG AAGAAGGGTT G 21(2)關(guān)于SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)位置1(D)其它信息/功能=“引物”(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:9ACGTAGATAT CGAACAAGAA ACCGC 25(2)關(guān)于SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:10GCTTTACTAC ACGGGCTTCC CCAG 24(2)關(guān)于SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:11CTGGGGAAGC CCGTGTAGTA AAGC 24(2)關(guān)于SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:12GGTACTCCAA CCACGGCGCT C 21(2)關(guān)于SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:13CGGGAAGTTG CAGAAGATTG GGTTG 25(2)關(guān)于SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14GAGCAAGAGA AGAAGGAGAC20(2)關(guān)于SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度1784個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物向日葵(B)株系栽培品種zebulon(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置21..1608(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15ATATCACATC TTCTTTCAAC ATG CAA ACT TCC ATT CTT ACT CTC CTT CTT 50Met Gln Thr Ser Ile Leu Thr Leu Leu Leu1 5 10CTC TTG CTC TCA ACC CAA TCT TCT GCA ACT TCC CGT TCC ATT ACA GAT98Leu Leu Leu Ser Thr Gln Ser Ser Ala Thr Ser Arg Ser Ile Thr Asp15 20 25CGC TTC ATT CAA TGT TTA CAC GAC CGG GCC GAC CCT TCA TTT CCG ATA 146Arg Phe Ile Gln Cys Leu His Asp Arg Ala Asp Pro Ser Phe Pro Ile30 35 40ACC GGA GAG GTT TAC ACT CCC GGA AAC TCA TCT TTT CCT ACC GTC TTG 194Thr Gly Glu Val Tyr Thr Pro Gly Asn Ser Ser Phe Pro Thr Val Leu45 50 55CAA AAC TAC ATC CGA AAC CTT CGG TTC AAT GAA ACT ACC ACA CCA AAA 242Gln Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Arg Phe Asn Glu Thr Thr Thr Pro Lys60 65 70CCC TTT TTA ATC ATC ACA GCC GAA CAT GTT TCC CAC ATT CAG GCA GCT 290Pro Phe Leu Ile Ile Thr Ala Glu His Val Ser His Ile Gln Ala Ala75 80 85 90GTG GTT TGT 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NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度529個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20Met Glu Thr Ser Ile Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Thr Gln1 5 10 15Ser Ser Ala Thr Ser Arg Ser Ile Thr Asp Arg Phe Ile Gln Cys Leu20 25 30His Asp Arg Ala Asp Pro Ser Phe Pro Ile Thr Gly Glu Val Tyr Thr35 40 45Pro Gly Asn Ser Ser Phe Pro Thr Val Leu Gln Asn Tyr Ile Arg Asn50 55 60Leu Arg Phe Asn Glu Thr Thr Thr Pro Lys Pro Phe Leu Ile Ile Thr65 70 75 80Ala Glu His Val Ser His Ile Gln Ala Ala Val Val Cys Gly Lys Gln85 90 95Asn Arg Leu Leu Leu Lys Thr Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly100 105 110Leu Ser Tyr Leu Thr Asn Thr Asn Gln Pro Phe Phe Ile Val Asp Met115 120 125Phe Asn Leu Arg Ser Ile Asn Val Asp Ile Glu Gln Glu Thr Ala Trp130 135 140Val Gln Ala Gly Ala Thr Leu Gly Glu Val Tyr Tyr Arg Ile Ala Glu145 150 155 160Lys Ser Asn Lys His Gly Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Val Gly165 170 175Val Gly Gly His Phe Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Asn Leu Met Arg Lys180 185 190Tyr Gly Leu Ser Val Asp Asn Ile Val Asp Ala Gln Ile Ile Asp Val195 200 205Asn Gly Lys Leu Leu Asp Arg Lys Ser Met Gly Glu Asp Leu Phe Trp210 215 220Ala Ile Thr Gly Gly Gly Gly Val Ser Phe Gly Val Val Leu Ala Tyr225 230 235 240Lys Ile Lys Leu Val Arg Val Pro Glu Val Val Thr Val Phe Thr Ile245 250 255Glu Arg Arg Glu Glu Gln Asn Leu Ser Thr Ile Ala Glu Arg Trp Val260 265 270Gln Val Ala Asp Lys Leu Asp Arg Asp Leu Phe Leu Arg Met Thr Phe275 280 285Ser Val Ile Asn Asp Thr Asn Gly Gly Lys Thr Val Arg Ala Ile Phe290 295 300Pro Thr Leu Tyr Leu Gly Asn Ser Arg Asn Leu Val Thr Leu Leu Asn305 310 315 320Lys Asp Phe Pro Glu Leu Gly Leu Gln Glu Ser Asp Cys Thr Glu Met325 330 335Ser Trp Val Glu Ser Val Leu Tyr Tyr Thr Gly Phe Pro Ser Gly Thr340 345 350Pro Thr Thr Ala Leu Leu Ser Arg Thr Pro Gln Arg Leu Asn Pro Phe355 360 365Lys Ile Lys Ser Asp Tyr Val Gln Asn Pro Ile Ser Lys Arg Gln Phe370 375 380Glu Phe Ile Phe Glu Arg Met Lys Glu Leu Glu Asn Gln Met Leu Ala385 390 395 400Phe Asn Pro Tyr Gly Gly Arg Met Ser Glu Ile Ser Glu Phe Ala Lys405 410 415Pro Phe Pro His Arg Ser Gly Asn Ile Ala Lys Ile Gln Tyr Glu Val420 425 430Asn Trp Glu Asp Leu Ser Asp Glu Ala Glu Asn Arg Tyr Leu Asn Phe435 440 445Thr Arg Leu Met Tyr Asp Tyr Met Thr Pro Phe Val Ser Lys Asn Pro450 455 460Arg Glu Ala Phe Leu Asn Tyr Arg Asp Leu Asp Ile Gly Ile Asn Ser465 470 475 480His Gly Arg Asn Ala Tyr Thr Glu Gly Met Val Tyr Gly His Lys Tyr485 490 495Phe Lys Glu Thr Asn Tyr Lys Arg Leu Val Ser Val Lys Thr Lys Val500 505 510Asp Pro Asp Asn Phe Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Thr Leu Ser515 520 525Ser(2)關(guān)于SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度350個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅹⅰ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..350(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:21GAGAAACTCG GAGACTTTCA CACAATGCCT AACCTCAAAC TCCGACCCCA AACATCCCAT 60CTCCCCCGCT ATCTTCTTCT CCGGAAATGG CTCCTACTCC TCCGTATTAC AAGCCAACAT 120CCGTAACCTC CGCTTCAACA CCACCTCAAC TCCGAAACCC TTCCTCATAA TCGCCGCAAC 180ACATGAATCC CATGTGCAAG CCGCGATTAC TTGCGGGAAA CGCCACAACC TTCAGATGAA 240AATCAGAAGT GGAGGCCACG ACTACGATGG CTTGTCATAC GTTACATACT CTGGCAAACC 300GTTCTTCGTC CTCGACATGT TTAACCTCCG TTCGGTGGAT GTCGACGTGG350(2)關(guān)于SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度278個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅹⅰ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..278(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22GGCATGGATC TCCGCCGGAG CGACTCTCGG AGAGGTTTAT TATCGGATTT GGGAGAAAAG 60CAGAGTCCAT GGATTCCCCG CCGGAGTTTG ACCGACGGTT GGTGTTGGTG GGCATTTAAG 120CGGCGGTGGT TACGGTAACA TGGTGAGGAA GTTTGGATTA TCTGTGGATT ACGTTGAGGA 180TGCCAAGATC GTCGATGTAA ACNGTCGGGT TTTAGATCGG AAAGCAATGG GTGAGGATCT 240GTTCTGGGCG ATTACCGGTG GAGGAGGAGG TAGCGTAC 278(2)關(guān)于SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度345個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源
(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅹⅰ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..345(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:23TGGACATATT AGCGGAGGAG GATTCGGTAC AATAATGAGG AAATACGGTT TAGCGTCTGA 60TAACGTTGTG GACGCACGTT TGATGGATGT AAATGGGAAA ACTCTTGACC GGAAAACGAT 120GGGAGAGGAT TTGTTTTGGG CGCTTAGAGG CGGTGGAGCT GCGAGTTTTG GCGTTGTCTT 180GTCGTGGAAG GTTAAGCTTG CTAGGGTTCC TGAAAAGGTA ACTTGTTTCA TAAGTCAACA 240TCCGATGGGA CCTAGCATGA ACAAGCTTGT TCATAGATGG CAATCCATAG GATCAAGANN 300GCTAGACGAA GATTTATTCA TCAGAGTCAA TATTGACAAC AGTCT 345(2)關(guān)于SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度695個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅹⅰ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..695(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:24GTTCGTTAAA ACCTATCCTN NANGGGCNAA AGNATATCAA AGNTTGNTTA NGNAACCCAA 60NATTTCTGAA CTGGCCNCCT TCGGTGGTAT ATGNCNAAAN CCCTTGAATC TGCGNANCCN 120ATTCCGCATA GAAACGGAAC CCTCTTCAAG ATTCTCTATT TACNCGAACT GNCTAGANNG 180AATGACAAGA CATCGAGTAG NAAAATCAAC TGGATCAAAG AGATATACAA TTACATGGCG 240CCTTATGTCT CAAGCAATCC AAGACAAGCA TATGTGAACT ACAGAGATCT AGACTTCGGA 300CAGAACAAGA ACAACGCAAA GGTTAACTTC ATTGAAGCTA AAATCTGGGG ACCTAAGTAC 360TTCAAAGGCA ATTTTGACAG ATTGGTGAAG ATTAAAACCA AGGTTGATCC AGAGAACTTC 420TTCAGGCACG AGCAGAGTAT CCCACCTATG CCCTACTAGA AGCTAGGTTC ATGAAACCAA 480TAACATTATC AAAAATAAGR ATAAATGRTA ATTGTATACA ACATGATTCG KCTTTCTTTA 540TTTCAGACAA TGTGGACACT ACTCTAAANT AAAAWGTCNA TTTACCTTAA AAAAAAAATA 600ATCCCCNNTA ANANAAAANT GGGGGGGCCN TTTTTGGGGN TCCCGGTTTT NGGACGGGGN 660GCTTTNGGGG GGCTTGGNNT TTTTTTNGGN GCCCC695(2)關(guān)于SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度495個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅹⅰ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..495
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25TCTGTTTTNA GGCAGAGCAG AGGAAGTTGT TGCTTTGCTT GGTAAGGAGT TTCCTGAATT 60NAGTTTAAAG AAGGAGAACT GTTCGGAGAT GACTTGGTTT CAGTCAGCTT TATGGTGGGA 120TAATCGTGTT AACCCTACTC ANATTGATCC WAAAGTGTTT CTCGATCGGA ATCTTGATAG 180AGCGAATTTC GGAAAGAGGA AATCGGATTA CGTTGCGAGT AAGATTCCTA GAGATGGGAT 240TAAGYCTTTT TCCAAGARGA TGMCTGACCT GGGGAAAAYC GGGCTTGTTT TTAAWCCGTA 300TGGTGGGAAA ATGGCGGAGG TTACGGTTAA CGCGACGCCG TTTCCNCACC GAAGCAAGCT 360TTTTAAGATT CAGTACTCGG TGACTTNGCA AGAAAACTCT NTCGAGATAG AGAAAGGGTT 420TCTTGAATCA GGCTAACGTC CTTATAGGTT CATGACCGGG TTTTTNAGCA AGANCCCTGG 480AATNCTTACT TNAAT 495(2)關(guān)于SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度204個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅹⅰ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..204(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26AAATTAAAAC AAATCAATGT TGATATTGAA TCCAATAGTG CTTGGTTTCA ACCTGGTGCT 60ACGCTTGGTG AGCTTTACTA CAGAATTNCA GAGAAGAGCA AAATCCATGG ATTTCCNGCG 120GGTTTNTNCA CAAGCNTAGG CATAGGTGGG TATATNANAG GCGGTGGATA CGGTACCTTG 180ATGAGGAAGT ATGGTCTTNC GGGA204(2)關(guān)于SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度491個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅹⅰ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..491(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:27GAGATTTCTC GAGCAAGATA CTCCACTGAT GATCTTTGAG CCATTGGGTG GGAAAATCAG 60CAAGATTTCA GAAACAGAAT CTCCATATCC ACACAGAAGA GGTAATCTGT ATAATATACA 120GTACATGGTG AAATGGAAAG TGAATGANGT CGAGGAGATG AACAAACATG TCAGGTGGAT 180GAGATCGTTA CACGATTACA TGACTCCGTA TGTTTCTAAA TCGCCGAGAG GAGCTTATTT 240GANTTACAGA GATCTTGATT TGGGCTCGAC CAAAGGGATT AACACGGGTT TCGGAGATGC 300AAGGAAATGG NNGGGTGAGN CTTTTTTCAA AGGTAATTTC CAAGGGGTTA GGTTTTGGTT 360AAAGGGGAGG TTTNNCCCAN CAAATTTTTT TTCAGGANCC GGCCANGNTT TTCCCCCCCC 420TNTTTTTNGG NCCCCAATCN AAANCCCCGT TTTAAAAGGG GGGCCATTTC NTTTTTTNCA 480NNTTAAAAGG G 491(2)關(guān)于SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度407個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅹⅰ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3..407(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:28ATTTGTTCGT GAGGTTAACT TTGACTTTAG TCAACGGTAC GAAGCCTGGT GAGAATACGG 60TTTTAGCGAC TTTCATTGGG ATGTATTTAG GCCGGTCGGA TAAGCTGTTG ACCGTNATGA 120ACCGGGATTT CCCGGAGTTG AAGCTGAAGA AAACCGATTN TACCGAGATG AGATGGATCG 180ATTCGGTTCT GTTTTGGGAC GATTATCCGG TTGGTACACC GACTTCTGTG CTACTAAATC 240CGCTAGTCGC AAAAAAGTTG TTCATGAAAC GAAAATCGGA CTACGTGAAG CGTCTNATTT 300TCGAGAACCC GATCTCNNGT TTGATACTCA AGAAATTTGT AGAGGTTNNG AAAGTTAAAA 360TNAATTTGGA TCCGCATTNN GGNANNNATG GTGAAACCCC NNGTTNT 407(2)關(guān)于SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度360個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅹⅰ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3..360(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:29ACGGCGTCGT ATTGGCCTAC AAAATAAACC TTGTTGAAGT CCCAGAAAAC GTCACCGTTT 60TCAGAATCTC CCGGACGTTA GAACAAAATG CGACGGATAT CATTCACCGG TGGCAACAAG 120TTGCACCGAA GCTTCCCGAC GAGCTTTTCA TAAGANCAGT CATTGACGTA NAAACGGCAC 180TGTTTCATNN CTCAAAAGAC CGTCAGACAA CATTCATAGC AATGTTTCTA GGAGACACGN 240CAACTCTACT GTCGATATTA AACCGGAGAT TCCCAGAATT GGGTTTGGTC CGGTCTGACT 300GTACCGNAAC AAGCNNTTGG ATCCAATCTG TGCTATTTTT GGGACAAATA TCCCAGGTTG 360(2)關(guān)于SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度427個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源
(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3..427(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30TCTTCACTGT CACCAAAACG TTAGAACAAG ACGCAAGATT GAAGACTATT TCTAAGTGGC 60AACAAATTTC ATCCAAGATT ATTGAAGAGA TACACATCCG AGTGGTACTC AGAGCAGCTG 120GAAATGATGG AAACAAGACT GTGACAATGA CCTACCTAGG TCAGTTTCTT GGCGAGAAAG 180GCACCTTGCT GAAGGTTATG GAGAAGGCTT TTCCAGAACT AGGGTTAACT CAAAAGGATT 240GTACTGAAAT GAGCTGGATT GAAGCCGCCC TTTTCCATGG TGGRTTTCCA ACAGGKTCTC 300CTATTGAAAT TTTGCTTMAG CTCAAGTCGC CTYTAGGAAA AGRTTWCTTC AAAGCAACGK 360CGGATTTCGT TAAAGAACCT WTTCCTGTGA TAGGGCTCAA AGGAATATTC AAAAGATTGA 420TTGAAGG 427(2)關(guān)于SEQ ID NO:31的信息(ⅱ)序列特征(A)長(zhǎng)度437個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..437(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31GTTGTACTAT CATNGAAGAT TAAGTTAGTC GATGTTCCGT CCACGGTCAC CGNGTTTAAA 60GTCCAGAAAC ATNAGGAGAA AGAGGCCGTT AGGNTCATCA ACAAGTGGCA GTATGTTGCG 120GATAAGGTCC CTGAAGATCT TTTCATCAGC GCAACGTTGG NGAGATCAAA CGGAAACTCT 180GTGCAGGCTT TGTTTACTGG ACTCTATCTT GGNCCGGTGA ATAATNTCTT GGCCTTGATG 240GAAGAAAAGT TTCCAGANTT AGGTCTTGAT ATCCAAGNCT GCACAGAGAT GAGTTGGGCT 300GAATCTGCAC TCTGGTNTNC TGNTTTCNCT AAAGGAGAGN CTCCTTGGGT GTTCCNCGCG 360GATCGGNAGC GGNCAATTTN TGGNCTTTCA AGGGGAAAGN CGGCTTTTTN CAAGAACCCG 420NTACCCGGGG TTCAATT437(2)關(guān)于SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度441個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..441(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32GCGGACCCTA TAGATCANNA TGTGCTACTG ANAGAAGAGG AAGCCAAGAA CAAGCCGGAG 60ACAGATAAAT ATCTGAAATG GGNCGATANC GTTTACGAAT TTATGACNCC ATATGTTTCG 120AAATCTCCAA GAGGAGCTTA TGTCAATTTC AAGGATATGG ATTTGGGTAT GTATCTTGGA 180AAGAAGAAGA CAAAGTACGA GGAAGGAAAG AGTTGGGGAG TGAAGTATTT CAAGAACAAT 240TTCGAGAGAT TGGTGAGAGT GAAGACTAGG GTTGATCCAA CAGATTTCTT CTGCGATGAA 300CAGAGCATTC CTCTGGTGAA CAAAGTTACC TGAAGATATC ATTTGAAGTT TTTTATTAGT 360CCCTTTTCTC TGTGAAATCA TCTGTGCGTG TTGAATATTA TGCGTCAAGT GTGTAACTTA 420TGTGTGTGAT TGTGAATTGT G 441(2)關(guān)于SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度502個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..502(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33CTGGCTTAAC ACAACGTCGT TTTGGGCCAA TTACCCGGCG GGTACACCCA AGAGCATCCT 60TCTAGATAGG CCTCCGACGA ATTCAGTGTC ATTTAAGAGT AAATCGGATT TTGTCAAAAA 120ACCAATACCC AAAAAAGGTT TAGAGAAGCT TTGGAAGACA ATGTTTAAAT TCAACAGTAG 180CGTCTCGTTG CAATTCAACC CTTACGGTGG AGTGATGGAC CGGATTCCGG CAACGGCCAC 240CGCTTTTCCT CATCGGAAAG GAAACTTGTT CAAGGTTCAA TACNCTACGA TGTGGTTTGA 300CGCAAACGCC ACACAGAGTA GCCNGGCTAT GATGAATGAG CTTTTTGAGG TGGCGGGACC 360GTACGTGNGT CAAGTAAACC CGAGANANGG CTTCCTTTAA NTTCAGAGNC CATCGNTNTT 420NGGAGCAANN CCAAGTGGGG GGGNCCAACC GGGGGNTNAA ANCNNAGNTC TTNGGGGGCC 480CAGAATTTCC TTNGGGGAAT TT 502(2)關(guān)于SEQ ID NO:34的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度400個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..400(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34NGGGAATTGC NCGAGGNAAG TTGTACCCAA TTCCTGGACC ACCATTGGTT TCCCAAGAAN 60CCCGAGACAA CCGTTTTTCA ATNACCGTGA TGTTGATTTG GGTATTAATT CTCATAATGG 120TAAAATCAGT AGTTATGTGG AAGGTAAACG TTACGGGAAG AAGTATTTCG CAGGTAATTT 180CGAGAGATTG GTGAAGATTA AGACGAGAGT TGATAGTGGT AATTTCTTTA GGAACGAACA 240GAGTATTCCT GTGTTACCAT AAGTGTATTT ATTTGATTAT TGGTTAGTGA AATTTGTTGT 300TGTATAATGA TTATATGTCG TATTTTTATT TATTATTAGT AATTTATAAA GTTTGATATT 360AAATACAAAT AGTATAATAA GATAGTTTCT TTTAGTAAAA 400(2)關(guān)于SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度383個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..383(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35CAACTCTAAT GGGAACACCT ACTTCGATCG AATGTCGATG GGGGAAGAGC TTTTCTGGGC 60GGTTCGAGGA GGTGGAGCCG CGAGTTTCGG CATCGTGATG GGATACAAAA TCCGGTTGGT 120TCCGGTTCCG GAGAAAGTTA CGGTTTTTAG CGTCGGAAAA ACCGTCGGAG AAGGAGCCGT 180TGATCTTATA ATGAAGTGGC AGAACTTCTC TCATAGTACG GNTCGGAATT TNTTTGTGAA 240GCTGANTTTT GANTTTAGTC AACGGTGCAA AGCCGGGTGA AAAAAAGGTT TTAGNGNCTT 300TCANTTTGGN TGNAANCTTG GGGGTTTTAT NAGAACGGTT AACCGGGATT NANCCCGNGT 360TTTCCCGGGG TTAAAACCTT NGG 383(2)關(guān)于SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度354個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..354(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36ATCAATGTTC TTACTAAACG TACACGAGCA TCGTTGGCTT TCAAGGCTAA ATCTGATTTT 60NTTCAAGAAC CGATNCCTAA AACCGCGATT TCGAAGCTTT GGAGACGGTT GCAAGAACCG 120GAAGCAGAGC ATGCTCAGCT AATTTNCACN CCATTTGGTG GTAAAATGAG TNAGATTGCA 180GATTACGAAA CACCATTTCC GCATAGGAAG GGGAATATAT ATNAGATTCA GTACTTGAAT 240TACTGGAGAG GAGACGTGAA AGAGAAGTAT ATTGAGATNG GTGGAGGAGA GTTTACGGTT 300GNTATNAGTA AGTTTTTTGG CGAAGTNTNC CNAGAGGNGN CTTNNTNTAA ACCT 354(2)關(guān)于SEQ ID NO:37的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度403個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..403(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37TTTTTTAGTA CACTAATAAT CAAATGGAAT GAGAAATGAA GCCACAAAAG TATCTGCAAT 60CAAAATATCC TGCTATCTCC ATCTCAAGCT CTCAATAGTA TCCTCTCCGA AAGTGAAATC 120AACATTTCAA ACTCTATTTC TTGGTGGAAT CGATAGACTG ATTCCTCTGA TGAACCAGAA 180GTTTCCGGAA CTCGGCTTAC GATCTCAAGA CTGTTCGGAA ATGAGCTGGA TCGAATCGAT 240AATGTTCTTC AACTGGAGAT CAGGACAGCC GTTAGAGATT TTGCTCAACA GAGACCTAAG 300GATTCGAGGA TCAGTATTTC AAAGCAAAGT CAGGATTATG GTTCAAAAAC CCGTTCCTGA 360AAACGTTTTT CGAAGAGGTA TCCAAGGGGT TTCTCGAGCA AGT 403(2)關(guān)于SEQ ID NO:38的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度260個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..260(ⅹⅰ)序列描述SEQ lD NO:38GAGATGAGTT GGATTAANTC TGTACTCTGG TTTGCTGATT TCCCTAAAGG AGAATCTCTT 60NGTGTTCTCA CGAATCGTAA GCGTACATCT CTATCTTTNA AAGGCAAAGA TGATTTTATC 120CAAGAACCGA TACCCGAGGC TGCAATTNAA GAGATATGGA GGCGATTAGA AGCCCCCNAG 180GCTCGGCTTG GAAAGATCAT ATTAACTCCA TTTGGTGGGA AAATNAGTGA AATGGCAGAG 240TACGTANCAC CATTCCCACA 260(2)關(guān)于SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度605個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..605(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39CTCTTGCATA TTCGCTGCAA GGATGGGAAA TTCAAAACCA CTCCCTACAA TTTTTTGTAT 60TATAGTTTCA GTCTTGTATT TTTAATTCTA TTGCATAACA CCAACTTCTT CATCAGCCTC 120CATCCAAGAT CAATTCATAA ACTGTGTCAA AAGAAACACA CATGTTTCTT TTCCACTCGA 180GAAAACGTTA TTCACCCCTG CGAAAAACGT CTCTTTGTTC AACCAAGTCC TTGANTCGAC 240GGCTCAAAAT CTCCAGTTCT TGGCAAAATC CATGCCTAAA CCGGGRTTCA TATTCAGACC 300GATTCACCAG TCTCAAGTCC AAGSTTCCAT CATTTGTTCA AMGRAACTCG GGNTTCATTT 360TNGTGTTTGA NGTGGCGGTC ACGATTTTCG AGGCCTTTGT NTTTATGTTT CACGGTTTGA 420AAAAACCGTT TATATTACTC GGCCTGTCAA ANTTGNANNC AAAATCANAT GTTGGATATT 480GNATTCCAAA TAGGTNCTTG GGGTNAACCT GGTGGCTANC GTTTGGTGAG CTTTTACTTT 540CAAGAATTTG CANGNGGANG TGCAAAGATT CCATGGGATT TCCCGGGGGG TTTNTTGCAC 600AATGT 605(2)關(guān)于SEQ ID NO:40的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度464個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..464(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40AACACAAAAC TCTTCCATTT GGCTTCTCTC TTGCATATTC GTTGCAAGGA TGGGAAATTC 60AAAACCACTC CCTACAATTN CTTGTATTAT CGTTTCAGTC TTGTATTTTN NATTCTATTG 120CATAACACCA ACTTCTTCAT CAGCCTCCAT CCAAGNTCAA TTCATAAACT GTGTCAAAAG 180GAACACACAT GTTTCTTTTC CACTCGAGNA AACGGTATTC ACTCCTGCGG AAAACGGCTC 240TNTTATTCAA CGGGTCCNTG AATCGACGGG TCAAAATCTC CAGTTCTTGG NAAAATCCAT 300GNCTAAACCG GGGTTCATAT TCAGGCCGGT TCACCAGTCT CAAGTCCAAG NTTCCATCAT 360TTGTTCAAAG GAACTCGGGA TTCATTTCCG CGNTAGAAGT GGCGGGCANN GGTTTCGGGG 420CCTGTCTNTT GNTTANGGGN AGGAAAACCG GTTNTATTNC TCGG 464(2)關(guān)于SEQ ID NO:41的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度386個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..386(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:41TCGGGAGCCC ANGNTAAATT ANNTGAAAAT GGGGNCGNAT ANCCGTTTAC NGAATTTTAT 60GACNCCCAAT ATGTTTCGAA ATCTCAAAGA NNGGGANCTT ATGTCAATTT CAAGGATATG 120GATTTGGGTA TGTATCTTGG AAAGNAGAAG ACAAAGTACG AGGAAGGAAA GAGTTGGGGA 180GTGAAGTATT TCAAGAACAA TTTCGAGAGA TTGGTGAGAG TGAAGACTAG GGTTGATCCN 240ACAGATTTCN TCTGCGATGA ACAGAGCATT CCTCTGGTGN ACAAAGTTAC CTGAAGATAT 300CATTTGAAGT TTTTTATTAG TCCCTTTTCT CTGTGAAATC ATCTGTGCGT GTTGAATANT 360ATGCGTCAAG TGTGTAACTT ATGTGT 386(2)關(guān)于SEQ ID NO:42的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度377個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..377(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:42TACCATAGGG AGGTGGTGNA AGATTTTGTA TGTAGNCTTA GGGGAAGGCG AGTAGTATGG 60TGGTGGTGGG GAGCTGTAAA CGTATGGTGG TGGTGGAGAT TTGTATGTGG GCTGGTTAAC 120TTCATTGAAG CTAAAATCTG GGGACCTAAG TACTTCAAAG GCAATTTTGA CAGATTGGTG 180AAGATTAAAA CCAAGGTTGA TCCAGAGAAC TTCTTCAGGC ACGAGCAGAG TATCCCACCT 240ATGCCCTACT AGAAGCTAGG TTCATGAAAC CAATAACATT ATCAAAAATA AGAATAAATG 300ATAATTGTAT ACAACATGAT TCGTCTTTCT TTATTTCAGA CAATGTGGAC ACTACTCTAA 360ATAAAATGTC ATTTACC377(2)關(guān)于SEQ ID NO:43的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度377個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..377(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:43TACCATAGGG AGGTGGTGNA AGATTTTGTA TGTAGNCTTA GGGGAAGGCG AGTAGTATGG 60TGGTGGTGGG GAGCTGTAAA CGTATGGTGG TGGTGGAGAT TTGTATGTGG GCTGGTTAAC 120TTCATTGAAG CTAAAATCTG GGGACCTAAG TACTTCAAAG GCAATTTTGA CAGATTGGTG 180AAGATTAAAA CCAAGGTTGA TCCAGAGAAC TTCTTCAGGC ACGAGCAGAG TATCCCACCT 240ATGCCCTACT AGAAGCTAGG TTCATGAAAC CAATAACATT ATCAAAAATA AGAATAAATG 300ATAATTGTAT ACAACATGAT TCGTCTTTCT TTATTTCAGA CAATGTGGAC ACTACTCTAA 360ATAAAATGTC ATTTACC377(2)關(guān)于SEQ ID NO:44的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度346個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..346(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:44GAGCTGTGGA TATGGTCACA AATGGCAATC GGTTGGTCCG AAAACTGATC CGAATCTTTT 60TATGAGAATN TTGATTCAAC CAGTGACGAG GAAGAAGGTA AAGACTGTGA GAGCTTCTNT 120GGTTGCCCTN TTTTNAGGCN AGACAGATGA AGTTTTTGCT TTCCTTAGTA AGGAGTTTCC 180TGAATTGGGT TTAAAGAAGG AGAATTNTTC GGAGATGACT TGGTTTCANT CTGCTTTATG 240GTGGGACAAT CGTCTTAATG CTACTCAGGT TGATCCTAAA GTNTTTCTTG ATCGGAATCT 300CGATACCTCG AGTTTCGGTA AGAGGAAATC GGATTACGTC GCGACT346(2)關(guān)于SEQ ID NO:45的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度261個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..261(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:45ATGGGGTGAG ACTTATTTCA AAGGTAATTT CAAGAGATTA GGTTTGGTTA AAGGGAAGNT 60TGATCCAACA AATTTCTTCA GGAACGAACA GAGTATTCCT CCTCTGTTTT GAGTCCTCAA 120TACAAAACCA GATATAAAAG ATGTCATTTC ATTTTTTCAA TTATAATAGA TAATGTAACT 180TTCTGCTACA ATTGTAAAAG TGAGATGTAC CCAATACGGT TTAAGCGGAC CGAGAATAGT 240CAATTCAAAG ACCAAATTCT G 261(2)關(guān)于SEQ ID NO:46的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度478個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..478(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:46GCTCAAAGGA CTAACCATGA AAACTTCCTC AAGTGTCTCT CTCACCGANT CAACGAGGAC 60GACTCAAGAN TTATACACAC ATCAAAAGAT CCTTCGTATT TNTCAATCTT GATTTCTTCC 120ATACAAAATC CAAGTTTCTC TGTTCTCGAA ACACCTAAAC CGGTTTCAAT CATCACTCCG 180GTTCAAGCCA CCGATGTTCA ATCTACGNTT AAATNCGCAC GGNCTTCACG GGTATACACA 240ATCAGGGCTA GGAGTGGTNG TCATGACTAC GGAGGTTTAT CTTTACATTG GCTTAAAAAN 300CANNCCGTTC GTTNNTCATT GATTTNNAGA AATCTTCCGG GCTTATTTAA CATNTAAGAT 360GTTTGATAAN CCGGNNCCNG TTTGGGGTTC AAATCCCGGT GGCTTACAAA NTTNGGGGGA 420ATTGTNCCTA TGAGGTTTGG AAAATTAANG CAAAATNTTT TGGGCCTTCC CGGCCGGT 478(2)關(guān)于SEQ ID NO:47的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度579個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系Columbia生態(tài)型(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..579(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:47GGCCGTTAGG ATCATCAAGA AATGGCAATA TGCTGCAGAT AAGGTTCCTG ATGATCTTTT 60CATTAGGACA ACATTGGAGA GATCAAACAA GAACGCAGTA CACGCTTTGT TCACTGGACT 120ATATATTGGT CCGGTGAACA ATCTATTGGC GTTGATGGAA GAAAAGTTTC CGGAACTAGG 180TCTTGAGAAA GAAGGTTGTG AAGAGATGAG TTGGATTGAG TCTGTACTCT GGTTTGCTGA 240TTTCCCTAAA GGAGAATCTC TTGGTGTTCT CACGAATCGT GAGCGTACAT CTCTATCTTT 300CAAAGGCAAA GATGATTTTG TCCAAGAACC GATACCCGAG GCTGCAATTC AAGAGATATG 360GAGGCGATTA GAAGCCCCCG AGGCTCGGCT TGGAAAGATC ATATTAACTC CATTTGGGTG 420NGGNAAAATG AGTGAAATGG CAGAGNCCGA ACCACCAATT CCCACANNCG AGGGAGGGGA 480ACCCCTNTGN GGNTCAGAAT GTGGTTCCTG GNNNNNAAGN GGGNGCCAGN ACCAANCCGG 540GNCNGTAAAN CNTGNAATGG GCCNAACCCG TNCCGGATT579(2)關(guān)于SEQ ID NO:48的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度252個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物稻(B)株系日本型，粳型亞種(D)發(fā)育階段黃化苗(8日齡)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3..252(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:48TGTCCTGGAA GGTCCGCCTC GTGCAGGTTN CGACGACGGT GACGGTGTTC GTCGTCGGGA 60GGAACGTCGA CCAGGGCGCC GCNGACGTCG TCGCCAGATG GCAAGACGTC GCGCCGAGCC 120TCCCTCCCGA GCTCACCATA CGGGTGATCG TNCGAGGGCA GCGCGCCACG TTCCAGTCGC 180TGTACCTCGG CTCGTGCGCC GACCTGGTGC CGACGATGAG CAGCATGTTC CCGGAGCTCG 240GGATGACGAT TG 252(2)關(guān)于SEQ ID NO:49的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)否(ⅵ)原始來源(A)生物萵苣(B)株系lollo bionda(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置12(D)其它信息/標(biāo)記物=不確定/備注=“Xaa=Cys或Ser”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置20..21(D)其它信息/標(biāo)記物=不確定/備注=“Xaa-Xaa可能是Ser-Phe”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:49Thr Ser Thr Ser Ile Ile Asp Arg Phe Thr Gln Xaa Leu Asn Asn Arg1 5 10 15Ala Asp Pro Xaa Xaa20(2)關(guān)于SEQ ID NO:50的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)否(ⅵ)原始來源(A)生物萵苣(B)株系lollo bionda(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)記物=不確定/備注“Xaa=可能是Ser”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置3(D)其它信息/標(biāo)記物=未知(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置5(D)其它信息/標(biāo)記物=不確定/備注“Xaa=可能是Ser”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置12(D)其它信息/標(biāo)記物=不確定
/備注“Xaa=可能是Trp”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的位點(diǎn)(B)位置24(D)其它信息/標(biāo)記物=不確定/備注“Xaa=可能是Tyr”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:50Xaa Ile Xaa Val Xaa Ile Glu Asp Glu Thr Ala Xaa Val Gln Ala Gly1 5 10 15Ala Thr Leu Gly Glu Val Tyr Xaa20(2)關(guān)于SEQ ID NO:51的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)否(A)生物萵苣(B)株系lollo bionda(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:51Ala Asp Pro Ser Phe Pro Leu Ser Gly Gln Leu Tyr Tyr Pro1 5 10(2)關(guān)于SEQ ID NO:52的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:52ACTTCTACTT CTATTATTGA TAGGTTTACT CA 32(2)關(guān)于SEQ ID NO:53的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度405個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物萵苣(B)株系lollo bionda(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..405(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:53ACT TCT ACT TCT ATT ATT GAT AGG TTT ACT CAA TGT CTA AAC AAC CGA 48Thr Ser Thr Ser Ile Ile Asp Arg Phe Thr Gln Cys Leu Asn Asn Arg1 5 10 15GCT GAC CCT TCT TTC CCG CTC AGT GGA CAA CTT TAC ACT CCC GAT AAC 96Ala Asp Pro Ser Phe Pro Leu Ser Gly Gln Leu Tyr Thr Pro Asp Asn20 25 30TCC TCT TTT CCA TCC GTC TTG CAA GCT TAC ATC CGG AAC CTC CGA TTC 144Ser Ser Phe Pro Ser Val Leu Gln Ala Tyr Ile Arg Asn Leu Arg Phe35 40 45AAT GAA TCC ACG ACT CCC AAA CCC ATC TTA ATC ATC ACC GCC TTA CAC 192Asn Glu Ser Thr Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ile Ile Thr Ala Leu His50 55 60CCT TCA CAC ATT CAA GCA GCT GTT GTG TGC GCC AAA ACA CAC CGC CTG 240Pro Ser His Ile Gln Ala Ala Val Val Cys Ala Lys Thr His Arg Leu65 70 75 80CTA ATG AAA ACC AGA AGC GGA GGC CAT GAT TAT GAG GGG CTT TCC TAT 288Leu Met Lys Thr Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr85 90 95GTG ACC AAT TCG AAC CAA CCC TTT TTT GTT GTT GAC ATG TTC AAC TTA 336Val Thr Asn Ser Asn Gln Pro Phe Phe Val Val Asp Met Phe Asn Leu100 105 110CGC TCC ATA AAC GTG AGT ATT GAA GAT GAA ACT GCA TGG GTC CAA GCC 384Arg Ser Ile Asn Val Ser Ile Glu Asp Glu Thr Ala Trp Val Gln Ala115 120 125GGC GCC ACC CTC GGA GAA GTT 405Gly Ala Thr Leu Gly Glu Val130 135(2)關(guān)于SEQ ID NO:54的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度135個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:54Thr Ser Thr Ser Ile Ile Asp Arg Phe Thr Gln Cys Leu Asn Asn Arg1 5 10 15Ala Asp Pro Ser Phe Pro Leu Ser Gly Gln Leu Tyr Thr Pro Asp Asn20 25 30Ser Ser Phe Pro Ser Val Leu Gln Ala Tyr Ile Arg Asn Leu Arg Phe35 40 45Asn Glu Ser Thr Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ile Ile Thr Ala Leu His50 55 60Pro Ser His Ile Gln Ala Ala Val Val Cys Ala Lys Thr His Arg Leu65 70 75 80Leu Met Lys Thr Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr85 90 95Val Thr Asn Ser Asn Gln Pro Phe Phe Val Val Asp Met Phe Asn Leu100 105 110Arg Ser Ile Asn Val Ser Ile Glu Asp Glu Thr Ala Trp Val Gln Ala115 120 125Gly Ala Thr Leu Gly Glu Val130 135(2)關(guān)于SEQ ID NO:55的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:55CACGTTTATG GAGCGTAAGT TGAAC25(2)關(guān)于SEQ ID NO:56的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:56CACCCTTCAC ACATTCAAGC AGC 23(2)關(guān)于SEQ ID NO:57的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1981個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物萵苣(B)株系lollo bionda(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置7..1626(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞未確定(B)位置替換(372,“g”)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞未確定(B)位置替換(379,“g”)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞未確定(B)位置替換(786,“t”)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞未確定(B)位置替換(1105..1106,“ga”)
(D)其它信息/備注“也可能是“gg”和“aa””(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:57ACAAAA ATG GCA ATT ACC TAT TCT TTC AAC TTC AAA TCT TAT ATT TTT 48Met Ala Ile Thr Tyr Ser Phe Asn Phe Lys Ser Tyr Ile Phe1 5 10CCT CTC CTC CTT GTC TTG CTC TCT ACC CAT TCA TCA GCG ACT TCA ACT 96Pro Leu Leu Leu Val Leu Leu Ser Thr His Ser Ser Ala Thr Ser Thr15 20 25 30TCC ATT ATA GAT CGC TTC ACC CAA TGT CTA AAC AAC CGA GCT GAC CCT 144Ser Ile Ile Asp Arg Phe Thr Gln Cys Leu Asn Asn Arg Ala Asp Pro35 40 45TCT TTC CCG CTC AGT GGA CAA CTT TAC ACT CCC GAT AAC TCC TCT TTT 192Ser Phe Pro Leu Ser Gly Gln Leu Tyr Thr Pro Asp Asn Ser Ser Phe50 55 60CCA TCC GTC TTG CAA GCT TAC ATC CGG AAC CTC CGA TTC AAT GAA TCC 240Pro Ser Val Leu Gln Ala Tyr Ile Arg Asn Leu Arg Phe Asn Glu Ser65 70 75ACG ACT CCC AAA CCC ATC TTA ATC ATC ACC GCC TTA CAC CCT TCA CAC 288Thr Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ile Ile Thr Ala Leu His Pro Ser His80 85 90ATT CAA GCA GCT GTT GTG TGC GCC AAA ACA CAC CGC CTG CTA ATG AAA 336Ile Gln Ala Ala Val Val Cys Ala Lys Thr His Arg Leu Leu Met Lys95 100 105 110ACC AGA AGC GGA GGC CAT GAT TAT GAG GGG CTT TCC TAT GTG ACC AAT 384Thr Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Val Thr Asn115 120 125TCG AAC CAA CCC TTT TTT GTT GTT GAC ATG TTC AAC TTA CGC TCC ATA 432Ser Asn Gln Pro Phe Phe Val Val Asp Met Phe Asn Leu Arg Ser Ile130 135 140AAC GTG AGT ATT GAA GAT GAA ACT GCA TGG GTC CAA GCT GGT GCG ACT 480Asn Val Ser Ile Glu Asp Glu Thr Ala Trp Val Gln Ala Gly Ala Thr145 150 155CTT GGT GAA GTC TAC TAC CGA ATA GCA GAG AAA AGC AAC AGT CAT GCT 528Leu Gly Glu Val Tyr Tyr Arg Ile Ala Glu Lys Ser Asn Ser His Ala160 165 170TTT CCG GCT GGC GTT TGC CCT ACT GTT GGA GTT GGT GGC CAT TTT AGT 576Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Val Gly Val Gly Gly His Phe Ser175 180 185 190GGT GGT GGT TAT GGT AAC TTG ATG GGA AAA TAC GGC CTT TCT GTT GAC 624Gly Gly Gly Tyr Gly Asn Leu Met Gly Lys Tyr Gly Leu Ser Val Asp195 200 205AAT ATT GTC GAT GCT CAG TTA ATC GAT GTG AAT GGT AAA CTT CTG AAT 672Asn Ile Val Asp Ala Gln Leu Ile Asp Val Asn Gly Lys Leu Leu Asn210 215 220CGG AAA TCA ATG GGT GAA GAT CTT TTT TGG GCC ATC ACA GGT GGT GGT 720Arg Lys Ser Met Gly Glu Asp Leu Phe Trp Ala Ile Thr Gly Gly Gly225 230 235GGT GTC AGC TTT GGT GTG GTT GTA GCG TAC AAG ATC AAA CTG GTT CGT 768Gly Val Ser Phe Gly Val Val Val Ala Tyr Lys Ile Lys Leu Val Arg240 245 250GTT CCT ACC ACT GTG ACC GTT TTT AAC GTA CAA AGA ACA TCC GAG CAG 816Val Pro Thr Thr Val Thr Val Phe Asn Val Gln Arg Thr Ser Glu Gln255 260 265 270AAC CTA AGC ACC ATA GCC CAC CGA TGG ATA CAA GTT GCG GAT AAG CTC 864Asn Leu Ser Thr Ile Ala His Arg Trp Ile Gln Val Ala Asp Lys Leu275 280 285GAT AAT GAC CTT TTC CTT CGA ATG ACC TTT AAC GTG ATA AAC AAC ACA 912Asp Asn Asp Leu Phe Leu Arg Met Thr Phe Asn Val Ile Asn Asn Thr290 295 300AAT GGC GAA AAG ACG ATA CGT GGT TTG TTT CCA ACA CTG TAC CTC GGA 960Asn Gly Glu Lys Thr Ile Arg Gly Leu Phe Pro Thr Leu Tyr Leu Gly305 310 315AAC TCT ACC GCT CTT GTT GCC CTC CTG AAC AAG GAT TTC CCT GAA TTA 1008Asn Ser Thr Ala Leu Val Ala Leu Leu Asn Lys Asp Phe Pro Glu Leu320 325 330GGT GTA GAA ATT TCA GAT TGT ATT GAA ATG AGT TGG ATC GAG TCT GTT 1056Gly Val Glu Ile Ser Asp Cys Ile Glu Met Ser Trp Ile Glu Ser Val335 340 345 350CTT TTC TAC ACA AAC TTC CCC ATT GGT ACT CCG ACC ACT GCT CTT CTA 1104Leu Phe Tyr Thr Asn Phe Pro Ile Gly Thr Pro Thr Thr Ala Leu Leu355 360 365AGC CGT ACA CCT CAA AGA CTA AAC CCA TTC AAA ATC AAA TCT GAT TAC 1152Ser Arg Thr Pro Gln Arg Leu Asn Pro Phe Lys Ile Lys Ser Asp Tyr370 375 380GTA AAA AAC ACT ATT TCC AAA CAG GGA TTC GAA TCC ATA TTT GAA AGG 1200Val Lys Asn Thr Ile Ser Lys Gln Gly Phe Glu Ser Ile Phe Glu Arg385 390 395ATG AAA GAA CTC GAA AAC CAA ATG CTA GCT TTC AAC CCT TAT GGT GGA 1248Met Lys Glu Leu Glu Asn Gln Met Leu Ala Phe Asn Pro Tyr Gly Gly400 405 410AGA ATG AGC GAA ATT TCC GAA TTT GCA AAG CCT TTT CCC CAT CGA TCA 1296Arg Met Ser Glu Ile Ser Glu Phe Ala Lys Pro Phe Pro His Arg Ser415 420 425 430GGG AAT ATA GCG AAG ATC CAA TAC GAA GTA AAC TGG GAT GAA CTT GGC 1344Gly Asn Ile Ala Lys Ile Gln Tyr Glu Val Asn Trp Asp Glu Leu Gly435 440 445GTT GAA GCA GCC AAT CGG TAC TTG AAC TTC ACA AGG GTG ATG TAT GAT 1392Val Glu Ala Ala Asn Arg Tyr Leu Asn Phe Thr Arg Val Met Tyr Asp450 455 460TAT ATG ACT CCG TTT GTT TCT AAG AAC CCC AGG GAA GCA TTT CTG AAC 1440Tyr Met Thr Pro Phe Val Ser Lys Asn Pro Arg Glu Ala Phe Leu Asn465 470 475TAC AGG GAT TTA GAT ATT GGT GTC AAC AGT CAT GGC AAG AAT GCT TAC 1488Tyr Arg Asp Leu Asp Ile Gly Val Asn Ser His Gly Lys Asn Ala Tyr480 485 490GGT GAA GGA ATG GTT TAT GGG CAC AAG TAT TTC AAA GAG ACG AAT TAT 1536Gly Glu Gly Met Val Tyr Gly His Lys Tyr Phe Lys Glu Thr Asn Tyr495 500 505 510AAG AGG CTA ACG ATG GTG AAG ACG AGG GTT GAT CCT AGC AAT TTT TTT 1584Lys Arg Leu Thr Met Val Lys Thr Arg Val Asp Pro Ser Asn Phe Phe515 520 525AGG AAT GAG CAA AGT ATC CCA ACT TTG TCA TCT TCA TGG AAG 1626Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Thr Leu Ser Ser Ser Trp Lys530 535 540TAAATTCTAA ATTCACTTGT GAAATTGAAT AAAAGTATGG CTTTTTCAAG GTCATGGTAT 1686CCAGATTCAG ATGATATTGA TATAATTTTG ACTTGTATTT ATACAAACAA AATTATATTA 1746TATTTTTCTG AATTTAGATT TTCCATTCTT TGGAAAAATA TACGAACATT GATGTTGATA 1806TTTTTAAGAA TTATAGATTT TGAACATTGT GAACAATGAA TAAACCGAGG ACTTCCCTTG 1866GGTTTTTTTT ATAAGTATGT AATAGCATGT CTTTAATCAA GATAACCGAT CATTGGATGC 1926AATTTATTAT TATAAACCTT ATTTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1981(2)關(guān)于SEQ ID NO:58的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度540個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:58Met Ala Ile Thr Tyr Ser Phe Asn Phe Lys Ser Tyr Ile Phe Pro Leu1 5 10 15Leu Leu Val Leu Leu Ser Thr His Ser Ser Ala Thr Ser Thr Ser Ile20 25 30Ile Asp Arg Phe Thr Gln Cys Leu Asn Asn Arg Ala Asp Pro Ser Phe35 40 45Pro Leu Ser Gly Gln Leu Tyr Thr Pro Asp Asn Ser Ser Phe Pro Ser50 55 60Val Leu Gln Ala Tyr Ile Arg Asn Leu Arg Phe Asn Glu Ser Thr Thr65 70 75 80Pro Lys Pro Ile Leu Ile Ile Thr Ala Leu His Pro Ser His Ile Gln85 90 95Ala Ala Val Val Cys Ala Lys Thr His Arg Leu Leu Met Lys Thr Arg100 105 110Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Val Thr Asn Ser Asn115 120 125Gln Pro Phe Phe Val Val Asp Met Phe Asn Leu Arg Ser Ile Asn Val130 135 140Ser Ile Glu Asp Glu Thr Ala Trp Val Gln Ala Gly Ala Thr Leu Gly145 150 155 160Glu Val Tyr Tyr Arg Ile Ala Glu Lys Ser Asn Ser His Ala Phe Pro165 170 175Ala Gly Val Cys Pro Thr Val Gly Val Gly Gly His Phe Ser Gly Gly180 185 190Gly Tyr Gly Asn Leu Met Gly Lys Tyr Gly Leu Ser Val Asp Asn Ile195 200 205Val Asp Ala Gln Leu Ile Asp Val Asn Gly Lys Leu Leu Asn Arg Lys210 215 220Ser Met Gly Glu Asp Leu Phe Trp Ala Ile Thr Gly Gly Gly Gly Val225 230 235 240Ser Phe Gly Val Val Val Ala Tyr Lys Ile Lys Leu Val Arg Val Pro245 250 255Thr Thr Val Thr Val Phe Asn Val Gln Arg Thr Ser Glu Gln Asn Leu260 265 270Ser Thr Ile Ala His Arg Trp Ile Gln Val Ala Asp Lys Leu Asp Asn275 280 285Asp Leu Phe Leu Arg Met Thr Phe Asn Val Ile Asn Asn Thr Asn Gly290 295 300Glu Lys Thr Ile Arg Gly Leu Phe Pro Thr Leu Tyr Leu Gly Asn Ser305 310 315 320Thr Ala Leu Val Ala Leu Leu Asn Lys Asp Phe Pro Glu Leu Gly Val325 330 335Glu Ile Ser Asp Cys Ile Glu Met Ser Trp Ile Glu Ser Val Leu Phe340 345 350Tyr Thr Asn Phe Pro Ile Gly Thr Pro Thr Thr Ala Leu Leu Ser Arg355 360 365Thr Pro Gln Arg Leu Asn Pro Phe Lys Ile Lys Ser Asp Tyr Val Lys370 375 380Asn Thr Ile Ser Lys Gln Gly Phe Glu Ser Ile Phe Glu Arg Met Lys385 390 395 400Glu Leu Glu Asn Gln Met Leu Ala Phe Asn Pro Tyr Gly Gly Arg Met405 410 415Ser Glu Ile Ser Glu Phe Ala Lys Pro Phe Pro His Arg Ser Gly Asn420 425 430Ile Ala Lys Ile Gln Tyr Glu Val Asn Trp Asp Glu Leu Gly Val Glu435 440 445Ala Ala Asn Arg Tyr Leu Asn Phe Thr Arg Val Met Tyr Asp Tyr Met450 455 460Thr Pro Phe Val Ser Lys Asn Pro Arg Glu Ala Phe Leu Asn Tyr Arg465 470 475 480Asp Leu Asp Ile Gly Val Asn Ser His Gly Lys Asn Ala Tyr Gly Glu485 490 495Gly Met Val Tyr Gly His Lys Tyr Phe Lys Glu Thr Asn Tyr Lys Arg500 505 510Leu Thr Met Val Lys Thr Arg Val Asp Pro Ser Asn Phe Phe Arg Asn515 520 525Glu Gln Ser Ile Pro Thr Leu Ser Ser Ser Trp Lys530 535 540(2)關(guān)于SEQ ID NO:59的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:59GGTAATGATC TCCTTTCTTG TTTGACC 27(2)關(guān)于SEQ ID NO:60的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:60AGAGCGGCCG CTATATTACA ACTTCTCCAC CATCACTCCT C41(2)關(guān)于SEQ ID NO:61的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:61:GGTGATGTTA ATGATAATCT CCTC 24(2)關(guān)于SEQ ID NO:62的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:62AGAGCGGCCG CTACAATTCC TTCAACATGT AAATTTCCTC 40(2)關(guān)于SEQ ID NO:63的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:63ACTTCCCGTA GAAACTCGGA GACTTTCACA CAATGC 36(2)關(guān)于SEQ ID NO:64的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:64TCCATCCAAG ATCAATTCAT AAACTGTGTC30(2)關(guān)于SEQ ID NO:65的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:65AGAGCGGCCG CTTTCATGAA CCTAGCTTCT AGTAGG 36(2)關(guān)于SEQ ID NO:66的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:66AGAGCGGCCG CGAAATGGCC CCCCTTTTAA AACGGGG37(2)關(guān)于SEQ ID NO:67的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:67AGAGCGGCCG CAAATGATAT CTTCAGGTAA CTTTGTTCAC 40(2)關(guān)于SEQ ID NO:68的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:68AGAGCGGCCG CATAATCAAA TAAATACACT TATGGTAACA CAG 43(2)關(guān)于SEQ ID NO:69的信息
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:69AGAGCGGCCG CTGGTTTTGT ATTGAGGACT CAAAACAG38(2)關(guān)于SEQ ID NO:70的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1757個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系columbia(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置接點(diǎn)(1..570,801..1754)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:70ACT TCC CGT AGA AAC TCG GAG ACT TTC ACA CAA TGC CTA ACC TCA AAC 48Thr Ser Arg Arg Asn Ser Glu Thr Phe Thr Gln Cys Leu Thr Ser Asn1 5 10 15TCC GAC CCC AAA CAT CCC ATC TCC CCC GCT ATC TTC TTC TCC GGA AAT96Ser Asp Pro Lys His Pro Ile Ser Pro Ala Ile Phe Phe Ser Gly Asn20 25 30GGC TCC TAC TCC TCC GTA TTA CAA GCC AAC ATC CGT AAC CTC CGC TTC 144Gly Ser Tyr Ser Ser Val Leu Gln Ala Asn Ile Arg Asn Leu Arg Phe35 40 45AAC ACC ACC TCA ACT CCG AAA CCC TTC CTC ATA ATC GCC GCA ACA CAT 192Asn Thr Thr Ser Thr Pro Lys Pro Phe Leu Ile Ile Ala Ala Thr His50 55 60GAA TCC CAT GTG CAA GCC GCG ATT ACT TGC GGG AAA CGC CAC AAC CTT 240Glu Ser His Val Gln Ala Ala Ile Thr Cys Gly Lys Arg His Asn Leu65 70 75 80CAG ATG AAA ATC AGA AGT GGA GGC CAC GAC TAC GAT GGC TTG TCA TAC 288Gln Met Lys Ile Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Asp Gly Leu Ser Tyr85 90 95GTT ACA TAC TCT GGC AAA CCG TTC TTC GTC CTC GAC ATG TTT AAC CTC 336Val Thr Tyr Ser Gly Lys Pro Phe Phe Val Leu Asp Met Phe Asn Leu100 105 110CGT TCG GTG GAT GTC GAT GTG GCA AGT AAG ACC GCG TGG GTC CAA ACC 384Arg Ser Val Asp Val Asp Val Ala Ser Lys Thr Ala Trp Val Gln Thr115 120 125GGT GCC ATA CTC GGA GAA GTT TAT TAC TAT ATA TGG GAG AAG AGC AAA 432Gly Ala Ile Leu Gly Glu Val Tyr Tyr Tyr Ile Trp Glu Lys Ser Lys130 135 140ACC CTA GCT TAT CCC GCC GGA ATT TGT CCC ACG GTT GGT GTC GGT GGC 480Thr Leu Ala Tyr Pro Ala Gly Ile Cys Pro Thr Val Gly Val Gly Gly145 150 155 160CAT ATC AGT GGT GGA GGT TAC GGT AAC ATG ATG AGA AAA TAC GGT CTC 528His Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Asn Met Met Arg Lys Tyr Gly Leu165 170 175ACC GTA GAT AAT ACC ATC GAT GCA AGA ATG GTC GAC GTT AAT 570Thr Val Asp Asn Thr Ile Asp Ala Arg Met Val Asp Val Asn180 185 190GGTATAATTG ATATCTCTAT TTTATATACT AATTAAATTT TATAGTGTGG ATCGGATAGT 630GATTTTGGTC CATCAATTAA AAACTTGGTG AACATAAAAT TAACCAAGCA ATCAATTTAG 690ACAAGCAACA TAATCATATA TATTTTTCTT ACATTTGTAT GTACCTGAAT ATTTATATTT 750ATGTTTATAT GTTCTCACTA TATTTTCACT TTTGTATTTG AAAATTTTTA GGA AAA806Gly LysATT TTG GAT AGA AAA TTG ATG GGA GAA GAT CTC TAC TGG GCA ATA AAC 854Ile Leu Asp Arg Lys Leu Met Gly Glu Asp Leu Tyr Trp Ala Ile Asn195 200 205GGA GGA GGA GGA GGG AGC TAC GGC GTC GTA TTG GCC TAC AAA ATA AAC 902Gly Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Val Val Leu Ala Tyr Lys Ile Asn210 215 220CTT GTT GAA GTC CCA GAA AAC GTC ACC GTT TTC AGA ATC TCC CGG ACG 950Leu Val Glu Val Pro Glu Asn Val Thr Val Phe Arg Ile Ser Arg Thr225 230 235 240TTA GAA CAA AAT GCG ACG GAT ATC ATT CAC CGG TGG CAA CAA GTT GCA 998Leu Glu Gln Asn Ala Thr Asp Ile Ile His Arg Trp Gln Gln Val Ala245 250 255CCG AAG CTT CCC GAC GAG CTT TTC ATA AGA ACA GTC ATT GAC GTA GTA 1046Pro Lys Leu Pro Asp Glu Leu Phe Ile Arg Thr Val Ile Asp Val Val260 265 270AAC GGC ACT GTT TCA TCT CAA AAG ACC GTC AGG ACA ACA TTC ATA GCA 1094Asn Gly Thr Val Ser Ser Gln Lys Thr Val Arg Thr Thr Phe Ile Ala275 280 285ATG TTT CTA GGA GAC ACG ACA ACT CTA CTG TCG ATA TTA AAC CGG AGA 1142Met Phe Leu Gly Asp Thr Thr Thr Leu Leu Ser Ile Leu Asn Arg Arg290 295 300TTC CCA GAA TTG GGT TTG GTC CGG TCT GAC TGT ACC GAA ACA AGC TGG 1190Phe Pro Glu Leu Gly Leu Val Arg Ser Asp Cys Thr Glu Thr Ser Trp305 310 315 320ATC CAA TCT GTG CTA TTC TGG ACA AAT ATC CAA GTT GGT TCG TCG GAG 1238Ile Gln Ser Val Leu Phe Trp Thr Asn Ile Gln Val Gly Ser Ser Glu325 330 335ACA CTT CTA CTC CAA AGG AAT CAA CCC GTG AAC TAC CTC AAG AGG AAA 1286Thr Leu Leu Leu Gln Arg Asn Gln Pro Val Asn Tyr Leu Lys Arg Lys340 345 350TCA GAT TAC GTA CGT GAA CCG ATT TCA AGA ACC GGT TTA GAG TCA ATT 1334Ser Asp Tyr Val Arg Glu Pro Ile Ser Arg Thr Gly Leu Glu Ser Ile355 360 365TGG AAG AAA ATG ATC GAG CTT GAA ATT CCG ACA ATG GCT TTC AAT CCA 1382Trp Lys Lys Met Ile Glu Leu Glu Ile Pro Thr Met Ala Phe Asn Pro370 375 380TAC GGT GGT GAG ATG GGG AGG ATA TCA TTA CGG GTG ACT CCG TTC CCA 1430Tyr Gly Gly Glu Met Gly Arg Ile Ser Leu Arg Val Thr Pro Phe Pro385 390 395 400TAC AGA GCC GGT AAT CTC TGG AAG ATT CAG TAC GGT GCG AAT TGG AGA 1478Tyr Arg Ala Gly Asn Leu Trp Lys Ile Gln Tyr Gly Ala Asn Trp Arg405 410 415GAT GAG ACT TTA ACC GAC CGG TAC ATG GAA TTG ACG AGG AAG TTG TAC 1526Asp Glu Thr Leu Thr Asp Arg Tyr Met Glu Leu Thr Arg Lys Leu Tyr420 425 430CAA TTC ATG ACA CCA TTT GTT TCC AAG AAT CCG AGA CAA TCG TTT TTC 1574Gln Phe Met Thr Pro Phe Val Ser Lys Asn Pro Arg Gln Ser Phe Phe435 440 445AAT AAC CGT GAT GTT GAT TTG GGT ATT AAT TCT CAT AAT GGT AAA ATC 1622Asn Asn Arg Asp Val Asp Leu Gly Ile Asn Ser His Asn Gly Lys Ile450 455 460AGT AGT TAT GTG GAA GGT AAA CGT TAC GGG AAG AAG TAT TTC GCA GGT 1670Ser Ser Tyr Val Glu Gly Lys Arg Tyr Gly Lys Lys Tyr Phe Ala Gly465 470 475 480AAT TTC GAG AGA TTG GTG AAG ATT AAG ACG AGA GTT GAT AGT GGT AAT 1718Asn Phe Glu Arg Leu Val Lys Ile Lys Thr Arg Val Asp Ser Gly Asn485 490 495TTC TTT AGG AAC GAA CAC AGT ATT CCT GTG TTA CCA TAA 1757Phe Phe Arg Asn Glu His Ser Ile Pro Val Leu Pro500 505(2)關(guān)于SEQ ID NO:71的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度508個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:71Thr Ser Arg Arg Asn Ser Glu Thr Phe Thr Gln Cys Leu Thr Ser Asn1 5 10 15Ser Asp Pro Lys His Pro Ile Ser Pro Ala Ile Phe Phe Ser Gly Asn20 25 30Gly Ser Tyr Ser Ser Val Leu Gln Ala Asn Ile Arg Asn Leu Arg Phe35 40 45Asn Thr Thr Ser Thr Pro Lys Pro Phe Leu Ile Ile Ala Ala Thr His50 55 60Glu Ser His Val Gln Ala Ala Ile Thr Cys Gly Lys Arg His Asn Leu65 70 75 80Gln Met Lys Ile Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Asp Gly Leu Ser Tyr85 90 95Val Thr Tyr Ser Gly Lys Pro Phe Phe Val Leu Asp Met Phe Asn Leu100 105 110Arg Ser Val Asp Val Asp Val Ala Ser Lys Thr Ala Trp Val Gln Thr115 120 125Gly Ala Ile Leu Gly Glu Val Tyr Tyr Tyr Ile Trp Glu Lys Ser Lys130 135 140Thr Leu Ala Tyr Pro Ala Gly Ile Cys Pro Thr Val Gly Val Gly Gly145 150 155 160His Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Asn Met Met Arg Lys Tyr Gly Leu165 170 175Thr Val Asp Asn Thr Ile Asp Ala Arg Met Val Asp Val Asn Gly Lys180 185 190Ile Leu Asp Arg Lys Leu Met Gly Glu Asp Leu Tyr Trp Ala Ile Asn195 200 205Gly Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Val Val Leu Ala Tyr Lys Ile Asn210 215 220Leu Val Glu Val Pro Glu Asn Val Thr Val Phe Arg Ile Ser Arg Thr225 230 235 240Leu Glu Gln Asn Ala Thr Asp Ile Ile His Arg Trp Gln Gln Val Ala245 250 255Pro Lys Leu Pro Asp Glu Leu Phe Ile Arg Thr Val Ile Asp Val Val260 265 270Asn Gly Thr Val Ser Ser Gln Lys Thr Val Arg Thr Thr Phe Ile Ala275 280 285Met Phe Leu Gly Asp Thr Thr Thr Leu Leu Ser Ile Leu Asn Arg Arg290 295 300Phe Pro Glu Leu Gly Leu Val Arg Ser Asp Cys Thr Glu Thr Ser Trp305 310 315 320Ile Gln Ser Val Leu Phe Trp Thr Asn Ile Gln Val Gly Ser Ser Glu325 330 335Thr Leu Leu Leu Gln Arg Asn Gln Pro Val Asn Tyr Leu Lys Arg Lys340 345 350Ser Asp Tyr Val Arg Glu Pro Ile Ser Arg Thr Gly Leu Glu Ser Ile355 360 365Trp Lys Lys Met Ile Glu Leu Glu Ile Pro Thr Met Ala Phe Asn Pro370 375 380Tyr Gly Gly Glu Met Gly Arg Ile Ser Leu Arg Val Thr Pro Phe Pro385 390 395 400Tyr Arg Ala Gly Asn Leu Trp Lys Ile Gln Tyr Gly Ala Asn Trp Arg405 410 415Asp Glu Thr Leu Thr Asp Arg Tyr Met Glu Leu Thr Arg Lys Leu Tyr420 425 430Gln Phe Met Thr Pro Phe Val Ser Lys Asn Pro Arg Gln Ser Phe Phe435 440 445Asn Asn Arg Asp Val Asp Leu Gly Ile Asn Ser His Asn Gly Lys Ile450 455 460Ser Ser Tyr Val Glu Gly Lys Arg Tyr Gly Lys Lys Tyr Phe Ala Gly465 470 475 480Asn Phe Glu Arg Leu Val Lys Ile Lys Thr Arg Val Asp Ser Gly Asn485 490 495Phe Phe Arg Asn Glu His Ser Ile Pro Val Leu Pro500 505(2)關(guān)于SEQ ID NO:72的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1527個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系columbia(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..1524(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:72ACT TCC CGT AGA AAC TCG GAG ACT TTC ACA CAA TGC CTA ACC TCA AAC48Thr Ser Arg Arg Asn Ser Glu Thr Phe Thr Gln Cys Leu Thr Ser Asn1 5 10 15TCC GAC CCC AAA CAT CCC ATC TCC CCC GCT ATC TTC TTC TCC GGA AAT96Ser Asp Pro Lys His Pro Ile Ser Pro Ala Ile Phe Phe Ser Gly Asn20 25 30GGC TCC TAC TCC TCC GTA TTA CAA GCC AAC ATC CGT AAC CTC CGC TTC 144Gly Ser Tyr Ser Ser Val Leu Gln Ala Asn Ile Arg Asn Leu Arg Phe35 40 45AAC ACC ACC TCA ACT CCG AAA CCC TTC CTC ATA ATC GCC GCA ACA CAT 192Asn Thr Thr Ser Thr Pro Lys Pro Phe Leu Ile Ile Ala Ala Thr His50 55 60GAA TCC CAT GTG CAA GCC GCG ATT ACT TGC GGG AAA CGC CAC AAC CTT 240Glu Ser His Val Gln Ala Ala Ile Thr Cys Gly Lys Arg His Asn Leu65 70 75 80CAG ATG AAA ATC AGA AGT GGA GGC CAC GAC TAC GAT GGC TTG TCA TAC 288Gln Met Lys Ile Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Asp Gly Leu Ser Tyr85 90 95GTT ACA TAC TCT GGC AAA CCG TTC TTC GTC CTC GAC ATG TTT AAC CTC 336Val Thr Tyr Ser Gly Lys Pro Phe Phe Val Leu Asp Met Phe Asn Leu100 105 110CGT TCG GTG GAT GTC GAC GTG GCA AGT AAG ACC GCG TGG GTC CAA ACC 384Arg Ser Val Asp Val Asp Val Ala Ser Lys Thr Ala Trp Val Gln Thr115 120 125GGT GCC ATA CTC GGA GAA GTT TAT TAC TAT ATA TGG GAG AAG AGC AAA 432Gly Ala Ile Leu Gly Glu Val Tyr Tyr Tyr Ile Trp Glu Lys Ser Lys130 135 140ACC CTA GCT TAT CCC GCC GGA ATT TGT CCC ACG GTT GGT GTC GGT GGC 480Thr Leu Ala Tyr Pro Ala Gly Ile Cys Pro Thr Val Gly Val Gly Gly145 150 155 160CAT ATC AGT GGT GGA GGT TAC GGT AAC ATG ATG AGA AAA TAC GGT CTC 528His Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Asn Met Met Arg Lys Tyr Gly Leu165 170 175ACC GTA GAT AAT ACC ATC GAT GCA AGA ATG GTC GAC GTA AAT GGA AAA 576Thr Val Asp Asn Thr Ile Asp Ala Arg Met Val Asp Val Asn Gly Lys180 185 190ATT TTG GAT AGA AAA TTG ATG GGA GAA GAT CTC TAC TGG GCA ATA AAC 624Ile Leu Asp Arg Lys Leu Met Gly Glu Asp Leu Tyr Trp Ala Ile Asn195 200 205GGA GGA GGA GGA GGG AGC TAC GGC GTC GTA TTG GCC TAC AAA ATA AAC 672Gly Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Val Val Leu Ala Tyr Lys Ile Asn210 215 220CTT GTT GAA GTC CCA GAA AAC GTC ACC GTT TTC AGA ATC TCC CGG ACG 720Leu Val Glu Val Pro Glu Asn Val Thr Val Phe Arg Ile Ser Arg Thr225 230 235 240TTA GAA CAA AAT GCG ACG GAT ATC ATT CAC CGG TGG CAA CAA GTT GCA 768Leu Glu Gln Asn Ala Thr Asp Ile Ile His Arg Trp Gln Gln Val Ala245 250 255CCG AAG CTT CCC GAC GAG CTT TTC ATA AGA ACA GTC ATT GAC GTA GTA 816Pro Lys Leu Pro Asp Glu Leu Phe Ile Arg Thr Val Ile Asp Val Val260 265 270AAC GGC ACT GTT TCA TCT CAA AAG ACC GTC AGG ACA ACA TTC ATA GCA 864Asn Gly Thr Val Ser Ser Gln Lys Thr Val Arg Thr Thr Phe Ile Ala275 280 285ATG TTT CTA GGA GAC ACG ACA ACT CTA CTG TCG ATA TTA AAC CGG AGA 912Met Phe Leu Gly Asp Thr Thr Thr Leu Leu Ser Ile Leu Asn Arg Arg290 295 300TTC CCA GAA TTG GGT TTG GTC CGG TCT GAC TGT ACC GAA ACA AGC TGG 960Phe Pro Glu Leu Gly Leu Val Arg Ser Asp Cys Thr Glu Thr Ser Trp305 310 315 320ATC CAA TCT GTG CTA TTC TGG ACA AAT ATC CAA GTT GGT TCG TCG GAG 1008Ile Gln Ser Val Leu Phe Trp Thr Asn Ile Gln Val Gly Ser Ser Glu325 330 335ACA CTT CTA CTC CAA AGG AAT CAA CCC GTG AAC TAC CTC AAG AGG AAA 1056Thr Leu Leu Leu Gln Arg Asn Gln Pro Val Asn Tyr Leu Lys Arg Lys340 345 350TCA GAT TAC GTA CGT GAA CCG ATT TCA AGA ACC GGT TTA GAG TCA ATT 1104Ser Asp Tyr Val Arg Glu Pro Ile Ser Arg Thr Gly Leu Glu Ser Ile355 360 365TGG AAG AAA ATG ATC GAG CTT GAA ATT CCG ACA ATG GCT TTC AAT CCA 1152Trp Lys Lys Met Ile Glu Leu Glu Ile Pro Thr Met Ala Phe Asn Pro370 375 380TAC GGT GGT GAG ATG GGG AGG ATA TCA TCT ACG GTG ACT CCG TTC CCA 1200Tyr Gly Gly Glu Met Gly Arg Ile Ser Ser Thr Val Thr Pro Phe Pro385 390 395 400TAC AGA GCC GGT AAT CTC TGG AAG ATT CAG TAC GGT GCG AAT TGG AGA 1248Tyr Arg Ala Gly Asn Leu Trp Lys Ile Gln Tyr Gly Ala Asn Trp Arg405 410 415GAT GAG ACT TTA ACC GAC CGG TAC ATG GAA TTG ACG AGG AAG TTG TAC 1296Asp Glu Thr Leu Thr Asp Arg Tyr Met Glu Leu Thr Arg Lys Leu Tyr420 425 430CAA TTC ATG ACA CCA TTT GTT TCC AAG AAT CCG AGA CAA TCG TTT TTC 1344Gln Phe Met Thr Pro Phe Val Ser Lys Asn Pro Arg Gln Ser Phe Phe435 440 445AAT TAC CGT GAT GTT GAT TTG GGT ATT AAT TCT CAT AAT GGT AAA ATC 1392Asn Tyr Arg Asp Val Asp Leu Gly Ile Asn Ser His Asn Gly Lys Ile450 455 460AGT AGT TAT GTG GAA GGT AAA CGT TAC GGG AAG AAG TAT TTC GCA GGT 1440Ser Ser Tyr Val Glu Gly Lys Arg Tyr Gly Lys Lys Tyr Phe Ala Gly465 470 475 480AAT TTC GAG AGA TTG GTG AAG ATT AAG ACG AGA GTT GAT AGT GGT AAT 1488Asn Phe Glu Arg Leu Val Lys Ile Lys Thr Arg Val Asp Ser Gly Asn485 490 495TTC TTT AGG AAC GAA CAG AGT ATT CCT GTG TTA CCA TAA 1527Phe Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Val Leu Pro500 505(2)關(guān)于SEQ ID NO:73的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度508個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:73Thr Ser Arg Arg Asn Ser Glu Thr Phe Thr Gln Cys Leu Thr Ser Asn1 5 10 15Ser Asp Pro Lys His Pro Ile Ser Pro Ala Ile Phe Phe Ser Gly Asn20 25 30Gly Ser Tyr Ser Ser Val Leu Gln Ala Asn Ile Arg Asn Leu Arg Phe35 40 45Asn Thr Thr Ser Thr Pro Lys Pro Phe Leu Ile Ile Ala Ala Thr His50 55 60Glu Ser His Val Gln Ala Ala Ile Thr Cys Gly Lys Arg His Asn Leu65 70 75 80Gln Met Lys Ile Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Asp Gly Leu Ser Tyr85 90 95Val Thr Tyr Ser Gly Lys Pro Phe Phe Val Leu Asp Met Phe Asn Leu100 105 110Arg Ser Val Asp Val Asp Val Ala Ser Lys Thr Ala Trp Val Gln Thr115 120 125Gly Ala Ile Leu Gly Glu Val Tyr Tyr Tyr Ile Trp Glu Lys Ser Lys130 135 140Thr Leu Ala Tyr Pro Ala Gly Ile Cys Pro Thr Val Gly Val Gly Gly145 150 155 160His Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Asn Met Met Arg Lys Tyr Gly Leu165 170 175Thr Val Asp Asn Thr Ile Asp Ala Arg Met Val Asp Val Asn Gly Lys180 185 190Ile Leu Asp Arg Lys Leu Met Gly Glu Asp Leu Tyr Trp Ala Ile Asn195 200 205Gly Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Val Val Leu Ala Tyr Lys Ile Asn210 215 220Leu Val Glu Val Pro Glu Asn Val Thr Val Phe Arg Ile Ser Arg Thr225 230 235 240Leu Glu Gln Asn Ala Thr Asp Ile Ile His Arg Trp Gln Gln Val Ala245 250 255Pro Lys Leu Pro Asp Glu Leu Phe Ile Arg Thr Val Ile Asp Val Val260 265 270Asn Gly Thr Val Ser Ser Gln Lys Thr Val Arg Thr Thr Phe Ile Ala275 280 285Met Phe Leu Gly Asp Thr Thr Thr Leu Leu Ser Ile Leu Asn Arg Arg290 295 300Phe Pro Glu Leu Gly Leu Val Arg Ser Asp Cys Thr Glu Thr Ser Trp305 310 315 320Ils Gln Ser Val Leu Phe Trp Thr Asn Ile Gln Val Gly Ser Ser Glu325 330 335Thr Leu Leu Leu Gln Arg Asn Gln Pro Val Asn Tyr Leu Lys Arg Lys340 345 350Ser Asp Tyr Val Arg Glu Pro Ile Ser Arg Thr Gly Leu Glu Ser Ile355 360 365Trp Lys Lys Met Ile Glu Leu Glu Ile Pro Thr Met Ala Phe Asn Pro370 375 380Tyr Gly Gly Glu Met Gly Arg Ile Ser Ser Thr Val Thr Pro Phe Pro385 390 395 400Tyr Arg Ala Gly Asn Leu Trp Lys Ile Gln Tyr Gly Ala Asn Trp Arg405 410 415Asp Glu Thr Leu Thr Asp Arg Tyr Met Glu Leu Thr Arg Lys Leu Tyr420 425 430Gln Phe Met Thr Pro Phe Val Ser Lys Asn Pro Arg Gln Ser Phe Phe435 440 445Asn Tyr Arg Asp Val Asp Leu Gly Ile Asn Ser His Asn Gly Lys Ile450 455 460Ser Ser Tyr Val Glu Gly Lys Arg Tyr Gly Lys Lys Tyr Phe Ala Gly465 470 475 480Asn Phe Glu Arg Leu Val Lys Ile Lys Thr Arg Val Asp Ser Gly Asn485 490 495Phe Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Val Leu Pro500 505(2)關(guān)于SEQ ID NO:74的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1530個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物擬南芥(B)株系columbia(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..1527(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:74TCC ATC CAA GAT CAA TTC ATA AAC TGT GTC AAA AGA AAC ACA CAT GTT48Ser Ile Gln Asp Gln Phe Ile Asn Cys Val Lys Arg Asn Thr His Val1 5 10 15TCT TTT CCA CTC GAG AAA ACG TTA TTC ACC CCT GCG AAA AAC GTC TCT96Ser Phe Pro Leu Glu Lys Thr Leu Phe Thr Pro Ala Lys Asn Val Ser20 25 30TTG TTC AAC CAA GTC CTT GAA TCG ACG GCT CAA AAT CTC CAG TTC TTG 144Leu Phe Asn Gln Val Leu Glu Ser Thr Ala Gln Asn Leu Gln Phe Leu35 40 45GCA AAA TCC ATG CCT AAA CCG GGA TTC ATA TTC AGA CCG ATT CAC CAG 192Ala Lys Ser Met Pro Lys Pro Gly Phe Ile Phe Arg Pro Ile His Gln50 55 60TCT CAA GTC CAA GCT TCC ATC ATT TGT TCA AAG AAA CTC GGA ATT CAT 240Ser Gln Val Gln Ala Ser Ile Ile Cys Ser Lys Lys Leu Gly Ile His65 70 75 80TTT CGT GTT AGA AGT GGC GGT CAC GAT TTC GAG GCC TTG TCT TAT GTT 288Phe Arg Val Arg Ser Gly Gly His Asp Phe Glu Ala Leu Ser Tyr Val85 90 95TCA CGG ATT GAA AAA CCG TTT ATA TTA CTC GAC CTG TCA AAA TTG AAA 336Ser Arg Ile Glu Lys Pro Phe Ile Leu Leu Asp Leu Ser Lys Leu Lys100 105 110CAA ATC AAT GTT GAT ATT GAA TCC AAT AGT GCT TGG GTT CAA CCT GGT 384Gln Ile Asn Val Asp Ile Glu Ser Asn Ser Ala Trp Val Gln Pro Gly115 120 125GCT ACG CTT GGT GAG CTT TAC TAC AGA ATT GCA GAG AAG AGC AAG ATC 432Ala Thr Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Arg Ile Ala Glu Lys Ser Lys Ile130 135 140CAT GGA TTT CCC GCG GGT TTG TGC ACA AGT GTA GGC ATA GGT GGG TAT 480His Gly Phe Pro Ala Gly Leu Cys Thr Ser Val Gly Ile Gly Gly Tyr145 150 155 160ATG ACA GGC GGT GGA TAC GGT ACC TTG ATG AGG AAG TAT GGT CTT GCG 528Met Thr Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Leu Met Arg Lys Tyr Gly Leu Ala165 170 175GGA GAT AAT GTT CTA GAC GTA AAG ATG GTT GAT GCA AAT GGT AAA TTA 576Gly Asp Asn Val Leu Asp Val Lys Met Val Asp Ala Asn Gly Lys Leu180 185 190CTC GAC AGA GCC GCG ATG GGT GAG GAC CTA TTT TGG GCG ATT AGA GGA 624Leu Asp Arg Ala Ala Met Gly Glu Asp Leu Phe Trp Ala Ile Arg Gly195 200 205GGC GGT GGA GCG AGT TTC GGG ATA GTT CTA GCA TGG AAG ATC AAG CTT 672Gly Gly Gly Ala Ser Phe Gly Ile Val Leu Ala Trp Lys Ile Lys Leu210 215 220GTT CCT GTT CCT AAG ACT GTT ACC GTC TTC ACT GTC ACC AAA ACG TTA 720Val Pro Val Pro Lys Thr Val Thr Val Phe Thr Val Thr Lys Thr Leu225 230 235 240GAA CAA GAC GCA AGA TTG AAG ACT ATT TCT AAG TGG CAA CAA ATT TCA 768Glu Gln Asp Ala Arg Leu Lys Thr Ile Ser Lys Trp Gln Gln Ile Ser245 250 255TCC AAG ATT ATT GAA GAG ATA CAC ATC CGA GTG GTA CTC AGA GCA GCT 816Ser Lys Ile Ile Glu Glu Ile His Ile Arg Val Val Leu Arg Ala Ala260 265 270GGA AAT GAT GGA AAC AAG ACT GTG ACA ATG ACC TAC CTA GGT CAG TTT 864Gly Asn Asp Gly Asn Lys Thr Val Thr Met Thr Tyr Leu Gly Gln Phe275 280 285CTT GGC GAG AAA GGC ACC TTG CTG AAG GTT ATG GAG AAG GCT TTT CCA 912Leu Gly Glu Lys Gly Thr Leu Leu Lys Val Met Glu Lys Ala Phe Pro290 295 300GAA CTA GGG TTA ACT CAA AAG GAT TGT ACT GAA ATG AGC TGG ATT GAA 960Glu Leu Gly Leu Thr Gln Lys Asp Cys Thr Glu Met Ser Trp Ile Glu305 310 315 320GCC GCC CTT TTC CAT GGT GGA TTT CCA ACA GGT TCT CCT ATT GAA ATT 1008Ala Ala Leu Phe His Gly Gly Phe Pro Thr Gly Ser Pro Ile Glu Ile325 330 335TTG CTT CAG CTC AAG TCG CCT CTA GGA AAA GAT TAC TTC AAA GCA ACG 1056Leu Leu Gln Leu Lys Ser Pro Leu Gly Lys Asp Tyr Phe Lys Ala Thr340 345 350TCG GAT TTC GTT AAA GAA CCT ATT CCT GTG ATA GGC TTC AAA GGA ATA 1104Ser Asp Phe Val Lys Glu Pro Ile Pro Val Ile Gly Phe Lys Gly Ile355 360 365TTC AAA AGA TTG ATT GAA GGA AAC ACA ACA TTT CTG AAC TGG ACT CCT 1152Phe Lys Arg Leu Ile Glu Gly Asn Thr Thr Phe Leu Asn Trp Thr Pro370 375 380TAC GGT GGT ATG ATG TCG AAA ATC CCT GAA TCT GCG ATC CCA TTT CCG 1200Tyr Gly Gly Met Met Ser Lys Ile Pro Glu Ser Ala Ile Pro Phe Pro385 390 395 400CAT AGA AAC GGA ACC CTC TTC AAG ATT CTC TAT TAC GCG AAC TGG CTA 1248His Arg Asn Gly Thr Leu Phe Lys Ile Leu Tyr Tyr Ala Asn Trp Leu405 410 415GAG AAT GAC AAG ACA TCG AGT AGA AAA ATC AAC TGG ATC AAA GAG ATA 1296Glu Asn Asp Lys Thr Ser Ser Arg Lys Ile Asn Trp Ile Lys Glu Ile420 425 430TAC AAT TAC ATG GCG CCT TAT GTC TCA AGC AAT CCA AGA CAA GCA TAT 1344Tyr Asn Tyr Met Ala Pro Tyr Val Ser Ser Asn Pro Arg Gln Ala Tyr435 440 445GTG AAC TAC AGA GAT CTA GAC TTC GGA CAG AAC AAG AAC AAC GCA AAG 1392Val Asn Tyr Arg Asp Leu Asp Phe Gly Gln Asn Lys Asn Asn Ala Lys450 455 460GTT AAC TTC ATT GAA GCT AAA ATC TGG GGA CCT AAG TAC TTC AAA GGC 1440Val Asn Phe Ile Glu Ala Lys Ile Trp Gly Pro Lys Tyr Phe Lys Gly465 470 475 480AAT TTT GAC AGA TTG GTG AAG ATT AAA ACC AAG GTT GAT CCA GAG AAC 1488Asn Phe Asp Arg Leu Val Lys Ile Lys Thr Lys Val Asp Pro Glu Asn485 490 495TTC TTC AGG CAC GAG CAG AGT ATC CCA CCT ATG CCC TAC TAG 1530Phe Phe Arg His Glu Gln Ser Ile Pro Pro Met Pro Tyr500 505(2)關(guān)于SEQ ID NO:75的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度509個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:75Ser Ile Gln Asp Gln Phe Ile Asn Cys Val Lys Arg Asn Thr His Val1 5 10 15Ser Phe Pro Leu Glu Lys Thr Leu Phe Thr Pro Ala Lys Asn Val Ser20 25 30Leu Phe Asn Gln Val Leu Glu Ser Thr Ala Gln Asn Leu Gln Phe Leu35 40 45Ala Lys Ser Met Pro Lys Pro Gly Phe Ile Phe Arg Pro Ile His Gln50 55 60Ser Gln Val Gln Ala Ser Ile Ile Cys Ser Lys Lys Leu Gly Ile His65 70 75 80Phe Arg Val Arg Ser Gly Gly His Asp Phe Glu Ala Leu Ser Tyr Val85 90 95Ser Arg Ile Glu Lys Pro Phe Ils Leu Leu Asp Leu Ser Lys Leu Lys100 105 110Gln Ile Asn Val Asp Ile Glu Ser Asn Ser Ala Trp Val Gln Pro Gly115 120 125Ala Thr Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Arg Ile Ala Glu Lys Ser Lys Ile130 135 140His Gly Phe Pro Ala Gly Leu Cys Thr Ser Val Gly Ile Gly Gly Tyr145 150 155 160Met Thr Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Leu Met Arg Lys Tyr Gly Leu Ala165 170 175Gly Asp Asn Val Leu Asp Val Lys Met Val Asp Ala Asn Gly Lys Leu180 185 190Leu Asp Arg Ala Ala Met Gly Glu Asp Leu Phe Trp Ala Ile Arg Gly195 200 205Gly Gly Gly Ala Ser Phe Gly Ile Val Leu Ala Trp Lys Ile Lys Leu210215 220Val Pro Val Pro Lys Thr Val Thr Val Phe Thr Val Thr Lys Thr Leu225 230 235 240Glu Gln Asp Ala Arg Leu Lys Thr Ile Ser Lys Trp Gln Gln Ile Ser245 250 255Ser Lys Ile Ile Glu Glu Ile His Ile Arg Val Val Leu Arg Ala Ala260 265 270Gly Asn Asp Gly Asn Lys Thr Val Thr Met Thr Tyr Leu Gly Gln Phe275 280 285Leu Gly Glu Lys Gly Thr Leu Leu Lys Val Met Glu Lys Ala Phe Pro290 295 300Glu Leu Gly Leu Thr Gln Lys Asp Cys Thr Glu Met Ser Trp Ile Glu305 310 315 320Ala Ala Leu Phe His Gly Gly Phe Pro Thr Gly Ser Pro Ile Glu Ile525 330 335Leu Leu Gln Leu Lys Ser Pro Leu Gly Lys Asp Tyr Phe Lys Ala Thr340 345 350Ser Asp Phe Val Lys Glu Pro Ile Pro Val Ile Gly Phe Lys Gly Ile355 360 365Phe Lys Arg Leu Ile Glu Gly Asn Thr Thr Phe Leu Asn Trp Thr Pro370 375 380Tyr Gly Gly Met Met Ser Lys Ile Pro Glu Ser Ala Ile Pro Phe Pro385 390 395 400His Arg Asn Gly Thr Leu Phe Lys Ile Leu Tyr Tyr Ala Asn Trp Leu405 410 415Glu Asn Asp Lys Thr Ser Ser Arg Lys Ile Asn Trp Ile Lys Glu Ile420 425 430Tyr Asn Tyr Met Ala Pro Tyr Val Ser Ser Asn Pro Arg Gln Ala Tyr435 440 445Val Asn Tyr Arg Asp Leu Asp Phe Gly Gln Asn Lys Asn Asn Ala Lys450 455 460Val Asn Phe Ile Glu Ala Lys Ile Trp Gly Pro Lys Tyr Phe Lys Gly465 470 475 480Asn Phe Asp Arg Leu Val Lys Ile Lys Thr Lys Val Asp Pro Glu Asn485 490 495Phe Phe Arg His Glu Gln Ser Ile Pro Pro Met Pro Tyr500 50權(quán)利要求
1．一種分離的蛋白或其部分或其突變蛋白，具有抗真菌活性，優(yōu)選地抗卵菌綱活性，更優(yōu)選地抗疫霉和/或抗腐霉活性，并且該蛋白質(zhì)可從植物來源獲得，由如SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:18,SEQ IDNO:57,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:74所示的核苷酸序列編碼。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的蛋白，其特征在于該蛋白可從向日葵或萵苣植株獲得。
3．一種具有碳水化合物氧化酶活性的分離的蛋白，其特征在于具有抗真菌活性，優(yōu)選地抗卵菌綱活性，更優(yōu)選地抗疫霉和/或抗腐霉活性。
4．一種碳水化合物氧化酶或其部分或其突變蛋白，其特征在于具有如SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列。
5．一種分離的蛋白，其特征在于它包括一種或多種選自包含下列氨基酸序列的群體的肽(a)SEQ ID NO:1的1-25位氨基酸，(b)SEQ ID NO:2的1-25氨基酸，(c)SEQ ID NO:6的1-118位氨基酸，(d)SEQ ID NO:16的1-529位氨基酸，或所述序列的具有抗真菌活性的部分，(e)SEQ ID NO:20的1-529位氨基酸，或所述序列的具有抗真菌活性的部分，(f)SEQ ID NO:49的1-21位氨基酸，(g)SEQ ID NO:50的1-24位氨基酸，(h)SEQ ID NO:51的1-14位氨基酸，(i)SEQ ID NO:58的1-540位氨基酸，或所述序列的具有抗真菌活性的部分，(j)SEQ ID NO:71的1-508位氨基酸，或所述序列的具有抗真菌活性的部分，(j)SEQ ID NO:73的1-508位氨基酸，或所述序列的具有抗真菌活性的部分，(j)SEQ ID NO:75的1-509位氨基酸，或所述序列的具有抗真菌活性的部分，以及它們具有抗真菌活性的突變蛋白。
6．一種抗真菌蛋白，其特征在于所包含的氨基酸序列由SEQ IDNO:15所示的開放閱讀框架或其部分編碼。
7．一種抗真菌蛋白，其特征在于所包含的氨基酸序列由SEQ IDNO:57所示的開放閱讀框架或其部分編碼。
8．一種抗真菌蛋白，其特征在于所包含的氨基酸序列由SEQ IDNO:70所示的開放閱讀框架或其部分編碼。
9．一種抗真菌蛋白，其特征在于所包含的氨基酸序列由SEQ IDNO:72所示的開放閱讀框架或其部分編碼。
10．一種抗真菌蛋白，其特征在于所包含的氨基酸序列由SEQ IDNO:74所示的開放閱讀框架或其部分編碼。
11．一種抗真菌蛋白，其特征在于所包含的氨基酸序列由SEQ IDNO:19所示的開放閱讀框架或其部分編碼。
12．一種抗真菌蛋白，其特征在于所包含的氨基酸序列由SEQ IDNO:21-48中的任意一個(gè)所示的開放閱讀框架編碼。
13．一種分離的DNA序列，包括能編碼根據(jù)權(quán)利要求1-12中的任意一項(xiàng)所述的蛋白的開放閱讀框架和能在嚴(yán)格條件下與其雜交的DNA。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的DNA序列，其特征在于包含SEQID NO:5中所示的核苷酸序列。
15．根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的DNA序列，其特征在于包含SEQID NO:15中所示的核苷酸序列。
16．根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的DNA序列，其特征在于包含SEQID NO:19中所示的核苷酸序列。
17．根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的DNA序列，其特征在于包含SEQID NO:21-48中所示的核苷酸序列。
18．根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的DNA序列，其特征在于包含SEQID NO:57中所示的核苷酸序列。
19．根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的DNA序列，其特征在于包含SEQID NO:70中所示的核苷酸序列。
20．根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的DNA序列，其特征在于包含SEQID NO:72中所示的核苷酸序列。
21．根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的DNA序列，其特征在于包含SEQID NO:74中所示的核苷酸序列。
22．一種嵌合DNA序列，包含根據(jù)權(quán)利要求13-21中的任意一項(xiàng)所述的DNA序列。
23．根據(jù)權(quán)利要求22所述的嵌合DNA序列，進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域和選擇性地轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域，它們與所述開放閱讀框架連接使嵌合DNA在存在于存活宿主細(xì)胞中時(shí)能在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生包含所述開放閱讀框架的RNA。
24．根據(jù)權(quán)利要求23所述的嵌合DNA序列，其中含所述開放閱讀框架的RNA在存在于所述宿主細(xì)胞中時(shí)能在宿主細(xì)胞中翻譯成蛋白，從而產(chǎn)生所述的蛋白。
25．根據(jù)權(quán)利要求22-24中的任意一項(xiàng)所述的嵌合DNA序列，是復(fù)制子，優(yōu)選地pMOG1144或pMOG1180。
26．根據(jù)權(quán)利要求25所述的嵌合DNA序列，是載體。
27．根據(jù)權(quán)利要求26所述的載體，是兩元載體，優(yōu)選地pMOG1144或pMOG1180。
28．包含根據(jù)權(quán)利要求25所述的復(fù)制子的宿主細(xì)胞，一旦該復(fù)制子存在其中就能維持該復(fù)制子。
29．包含根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的載體的宿主細(xì)胞，一旦存在該載體其中就能維持該載體。
30．根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的嵌合DNA序列穩(wěn)定摻入其基因組中的宿主細(xì)胞。
31．根據(jù)權(quán)利要求30所述的宿主細(xì)胞，是植物細(xì)胞，所述載體是非整合型病毒載體。
32．根據(jù)權(quán)利要求30所述的宿主細(xì)胞，是植物細(xì)胞。
33．一種植物或植物部分，包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的植物細(xì)胞。
34．一種植物或植物部分，基本上由根據(jù)權(quán)利要求32所述的植物細(xì)胞組成。
35．根據(jù)權(quán)利要求34所述的植物，其特征在于所述嵌合DNA至少在許多植物細(xì)胞中表達(dá)并使其中合成所述的抗真菌蛋白。
36．合成具有抗真菌活性，優(yōu)選地抗卵菌綱活性，更優(yōu)選地抗疫霉和/或抗腐霉活性的蛋白的方法，其特征在于在有利條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求29到32所述的宿主細(xì)胞并且從宿主細(xì)胞回收該蛋白。
36．合成具有抗真菌活性，優(yōu)選地抗卵菌綱活性，更優(yōu)選地抗疫霉和/或抗腐霉活性的蛋白的方法，其特征在于在有利條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求29到32所述的宿主細(xì)胞并且從培養(yǎng)基分離該蛋白。
38．根據(jù)權(quán)利要求1-12中的任意一項(xiàng)所述的蛋白的用途，用于抑制真菌生長(zhǎng)，優(yōu)選地抑制卵菌綱種類生長(zhǎng)，更優(yōu)選地抑制疫霉屬種類和/或腐霉屬種類生長(zhǎng)。
39．一種分子量為55-56kD的植物來源的蛋白，其特征在于具有碳水化合物氧化酶活性。
40．根據(jù)權(quán)利要求39所述的蛋白，其特征在于是己糖氧化酶。
41．根據(jù)權(quán)利要求40所述的蛋白，其特征在于可從向日葵或萵苣植株獲得。
42．抑制植物葉子上真菌，優(yōu)選地卵菌綱，更優(yōu)選地疫霉或腐霉生長(zhǎng)的方法，其特征在于用由根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的宿主細(xì)胞或由根據(jù)權(quán)利要求35所述的植物產(chǎn)生的蛋白處理植物。
43．獲得對(duì)真菌，優(yōu)選地卵菌綱，更優(yōu)選地疫霉或腐霉的易感性降低的植物的方法，包括以下步驟(a)將嵌合DNA序列導(dǎo)入易于再生出完整植株的祖細(xì)胞，-所述嵌合DNA序列包含能編碼根據(jù)權(quán)利要求1-12中的任意一項(xiàng)所述的蛋白的開放閱讀框架，所述開放閱讀框架可操作性地與轉(zhuǎn)錄和翻譯區(qū)域及選擇性地轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域連接，以使對(duì)所述真菌侵染易感的植物細(xì)胞中合成所述蛋白，并且-所述嵌合DNA序列能編碼植物選擇性標(biāo)記，以允許選擇所述選擇性標(biāo)記存在其中的轉(zhuǎn)化祖細(xì)胞，并且(b)在有利于具有所述的選擇性標(biāo)記的祖細(xì)胞的條件下使所述祖細(xì)胞再生為植株，并且(c)鑒定合成根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的蛋白的植物，由此降低所述植物對(duì)所述真菌侵染的易感性。
44．根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于步驟(a)使用能將T-DNA轉(zhuǎn)移入植物細(xì)胞并攜帶雙元載體的根瘤農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行，步驟(b)在存在抗生素從而有利于含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞的情況下進(jìn)行。
45．一種抗真菌組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1-12中的任意一項(xiàng)所述的蛋白和適當(dāng)?shù)妮d體。
46．能夠識(shí)別根據(jù)權(quán)利要求1-12中的任意一項(xiàng)所述的蛋白的抗體。
47．可從編碼根據(jù)權(quán)利要求1-12中的任意一項(xiàng)所述的蛋白的基因得到的核酸序列，在植物中具有組織特異性和/或發(fā)育特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。
48．根據(jù)權(quán)利要求47所述的核酸序列，可從所述基因的翻譯起始位點(diǎn)的上游區(qū)域得到。
49．根據(jù)權(quán)利要求48所述的核酸序列，具有所述基因翻譯起始位點(diǎn)上游區(qū)域的至少1000個(gè)核苷酸。
50．根據(jù)權(quán)利要求47-49中的任意一項(xiàng)所述的核酸序列的用途，用于制備可在植物中表達(dá)的基因構(gòu)建體。
全文摘要
本發(fā)明提供可從植物來源獲得的具有抗真菌活性,特別是抗疫霉和/或抗腐霉活性并且通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定分子量為約55—65千道爾頓的分離的蛋白;以及包含能編碼根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的開放閱讀框架的分離DNA序列,優(yōu)選地特征在于所含的開放閱讀框架能編碼在SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:74中所示的蛋白或其突變蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步包括摻入了能編碼根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白的嵌合DNA并且蛋白在其中表達(dá)的植物。本發(fā)明也證明了所述蛋白的碳水化合物氧化酶和優(yōu)選地己糖氧化酶活性。本發(fā)明也提供使用該蛋白或能合成該蛋白的宿主細(xì)胞來抵抗真菌,尤其是疫霉和腐霉屬種類的方法。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1233290SQ97198755
公開日1999年10月27日 申請(qǐng)日期1997年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月4日
發(fā)明者M·H·斯圖威, J·H·H·V·庫斯特斯, M·B·斯拉-布拉格, L·S·美徹斯, J·P·E·范德威特－特路斯特, W·拉格威格, A·S·普斯坦 申請(qǐng)人:莫根國(guó)際股份有限公司