專利名稱：制備N－甲酰基－α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸甲酯的酶促方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過N-甲?；?L-天冬氨酸(下文稱為“F-L-Asp”)與L-苯丙氨酸甲酯或D,L-苯丙氨酸甲酯(下文分別稱為“L-PM”和“D,L-PM”)之間的縮合反應(yīng)制備N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(下文稱為“F-APM”)的酶促方法。
α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯，即天冬苯丙二肽酯為具有約200倍蔗糖甜度的強的增甜劑，尤其可通過從F-L-Asp與L-PM或D,L-PM的縮合反應(yīng)而獲得的F-APM中除去N-甲?；Ｗo基來制備。
背景技術(shù)：
作為以前通過F-L-Asp與L-PM之間的縮合反應(yīng)制備F-APM的方法，提出了例如US-A-3,786,039的方法，其中F-L-Asp和L-PM被允許在有機溶劑中反應(yīng)。
然而，由于產(chǎn)生α-異構(gòu)體和β-異構(gòu)體，并且需要分離-純化以除去無用的β-異構(gòu)體，因此作為工業(yè)方法，該方法不是一種有用的方法。
作為一種改進上面缺點的方法，提出了一些制備F-APM的酶促方法。例如，JP-A-60-164495(本文使用的術(shù)語“JP-A”指未審
公開日本專利申請)提供了一個實例，其中通過F-L-Asp與L-PM.HCl之間的縮合反應(yīng)以及使用嗜熱菌蛋白酶作為酶類制備了為白色固體的F-APM.PM(1∶1加成產(chǎn)物)。白色固體漂浮在水上。反應(yīng)后，通過加入鹽酸將水的pH調(diào)至1.6，并將由此獲得的F-APM萃取至乙酸乙酯中。
然而，甚至在這種方法中，F(xiàn)-APM的產(chǎn)率僅為41％，從此結(jié)果可以總結(jié)出當(dāng)反應(yīng)在水溶液中進行時，極大地限制了F-APM的產(chǎn)率。
作為解決該缺點的一種方法，在JP-A-62-259597中描述了一種新的制備N-保護的-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(下文稱為“N-保護的-APM”)的方法，其中在由N-保護的-L-天冬氨酸和L-PM溶解在其中的有機相和蛋白酶溶解在其中的水相組成的兩相反應(yīng)體系中進行所述縮合反應(yīng)，并將產(chǎn)生的N-保護的-APM以銨鹽或磷鎓鹽的形式轉(zhuǎn)移至有機相中。
然而，甚至在該方法中，N-保護的-APM的產(chǎn)率僅為20％，并且沒有獲得任何足夠的效果。對于有機溶劑，僅僅敘述了可使用其中可溶解叔銨鹽或叔磷鎓鹽的任一有機溶劑；然而，在所述專利申請中沒有描述有效的有機溶劑的具體種類。
為了提高N-芐氧羰基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(下文稱為“Z-APM”)的產(chǎn)率，Nakanishi等提出了一種在兩相體系中使用固定化嗜熱菌蛋白酶的方法，其中含有N-芐氧羰基-L-天冬氨酸(下文稱為“Z-L-Asp”)和PM的有機相被加入到含有固定化嗜熱菌蛋白酶的水相中以在水相中產(chǎn)生Z-APM，將產(chǎn)生的Z-APM立即從水相轉(zhuǎn)移至有機相(乙酸乙酯)中(生物技術(shù)(BIO/TECHNOLOGY)vol.3,pp.459-464,1985)。
然而，如該文獻第460頁圖2所示，當(dāng)使用摩爾比為1∶1的PM和Z-Asp時，Z-APM的產(chǎn)率僅為約40％。
除此之外，該文獻第461頁表1顯示了有機溶劑對Z-APM合成的初始比例以及被定義為“水相中的L-PM濃度與有機相中的濃度之比”的L-PM的分配系數(shù)的影響。然而，僅研究了三種有機溶劑，即乙酸乙酯、1,2-二氯乙烷和氯仿，沒有考慮被定義為有機相中的Z-APM濃度與水相中的濃度之比的產(chǎn)生的Z-APM的任何分配系數(shù)，并且在該文獻中根本未討論選擇將Z-APM從水相萃取至有機相的有效的有機溶劑的標準。而且，沒有描述或建議將該方法用于制備F-APM。
最近，在1996年9月29至10月2日舉行的加拿大工業(yè)學(xué)會會議(Canadia Industrial Association)上，該發(fā)明人提出了通過F-L-Asp與L-PM或D,L-PM之間的縮合反應(yīng)連續(xù)制備F-APM的簡易方法，其中在水相中進行所述縮合反應(yīng)，通過在由有機相和水相組成的兩相反應(yīng)體系中使用萃取劑將產(chǎn)生的F-APM轉(zhuǎn)移至有機相中，其中N-保護的-L-天冬氨酸和L-PM被溶解在有機相中，蛋白酶被溶解在水相中；然而，他沒有提供任何詳細的結(jié)果，尤其是涉及將產(chǎn)生的F-APM從水相有效地萃取至有機相中的適宜有機溶劑的選擇的地方。它僅指出在含水/1-丁醇兩相體系中獲得了極高的轉(zhuǎn)化，但是這種轉(zhuǎn)化僅稍高于80％。
因此，目前沒有提出任何通過在兩相反應(yīng)體系中F-L-Asp與L-PM或D,L-PM之間的縮合反應(yīng)以85％或更高的轉(zhuǎn)化率有效制備F-APM的方法。
而且，當(dāng)以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)F-APM時，從操作的效率和簡易性角度來看，連續(xù)操作比不連續(xù)操作更為優(yōu)選。
如JP-A-3-87195中描述的，該申請的申請人已將連續(xù)反應(yīng)應(yīng)用于通過Z-L-Asp與L-PM之間的縮合反應(yīng)制備Z-APM的方法中，其中在含有固定化嗜熱菌蛋白酶的水相內(nèi)柱中產(chǎn)生Z-APM，同時將由此產(chǎn)生的Z-APM轉(zhuǎn)移至外柱中的有機相中，并排出至有機溶劑的容器中。
然而，甚至在這種情況下，基于Z-L-Asp的Z-APM的產(chǎn)率僅為約70％。
Nakanishi等將前面文獻(生物/技術(shù)vol.3,pp.459-464,1985)中描述的方法應(yīng)用到該連續(xù)操作中，其中將溶解在乙酸乙酯中的含有80mM Z-L-Asp和200mM L-PM以及5mM CaCl2的底物溶液連續(xù)加入到含有固定化酶的水相中；然而，在Z-L-Asp與L-PM之間的縮合反應(yīng)開始185小時后，基于Z-L-Asp的Z-APM的產(chǎn)率逐漸降低至75％。
因此，目前需要一種有效的制備二肽酯，尤其是N-保護的-APM的連續(xù)方法，其中可使用比上述方法中所采用的芐氧羰基更為便宜的保護基，并且其中可獲得85％或更高的轉(zhuǎn)化率。甲?；绕S氧羰基更為便宜。

發(fā)明內(nèi)容
通過考慮上述問題來進行本發(fā)明，本發(fā)明的一個目的是提供一種新的通過F-L-Asp與L-PM或D,L-PM之間的縮合反應(yīng)有效制備F-APM的酶促方法。
因此，鑒于以上所述，發(fā)明人進行了深入細致的研究以解決前面描述的問題，通過這一發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明，即通過適當(dāng)選擇水不混溶溶劑可將F-APM有效地從水相萃取至有機相中。
因此，本發(fā)明完成了一種新的通過N-甲?；?L-天冬氨酸與L-苯丙氨酸甲酯或D,L-苯丙氨酸甲酯之間的縮合反應(yīng)制備N-甲?；?α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的酶促方法，它包括將包含在pH=6.0時，如下面公式(1)所描述的N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯分配比例DF-APM為10-2或更高的水不混溶溶劑，DF-APM=PF--APM1+10pH-pKF-APM---(1)]]>其中PF-APM=(CF-APM)org/(CF-APM)aq(1a)；KF-APM={(CF-APM-)aq×CH+}/(CF-APM)aq---(1b);]]>(CF-APM)org在F-APM萃取之后，有機相所含有的F-APM的濃度；(CF-APM)aq在F-APM萃取之后，殘留在水相中的F-APM的濃度；(CF-APM-)aq在F-APM萃取之后，殘留在水相中的F-APM-的濃度；CH+]]>在F-APM萃取之后，殘留在水相中的H+的濃度，并含有N-甲?；?L-天冬氨酸和L-或D,L-苯丙氨酸甲酯的有機相；加入到含有嗜熱茵蛋白酶樣金屬蛋白酶的水相中；在水相中進行縮合反應(yīng)以產(chǎn)生N-甲?；?α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯；和將由此產(chǎn)生的N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯從水相萃取至有機相中。
附圖簡要說明

圖1顯示F-APM形成的起始速率與pH之間的相互關(guān)系。圖2顯示在水相(.)和有機相(o)中產(chǎn)生的F-APM的濃度隨時間的變化。圖3顯示用于連續(xù)生產(chǎn)F-APM的反應(yīng)器，其中數(shù)字表明下面含義1反應(yīng)器的主體2水套管3攪拌頁片4,5進料含有F-APM和L-PM的底物溶液的供應(yīng)泵6pH控制器7進料5N-NaOH以調(diào)節(jié)pH的供應(yīng)泵8pH電極9沉降器圖4表明當(dāng)磷酸三丁酯被用作有機溶劑時，產(chǎn)生的F-APM(o)以及底物F-L-Asp(□)和L-PM(Δ)在有機溶劑中的濃度隨時間的變化，實施發(fā)明的最佳方式通過由下面方案1描述的下面的F-APM的分配模型獲得公式1中描述的PF-APM和KF-APM。

進一步，通過下面公式(3)描述的相互關(guān)系獲得上面的公式(1)。DF-APM=(CF-APM)org(CF-APM)aq+(CF-APm-)aq]]>=(CF-APM)org(CF-APM)aq×11+(CF-APm-)aq/(CF-APM)aq]]>=PF-APM1+(KF-APM×CH+)-1=PF-APM1+10pH-pKF-APM---(3)]]>而且，由于大量的F-L-Asp可分布在水相中，在pH=6.0時，由下面公式(2)描述的其中F-L-Asp(DF-L-Asp)的分配比例為10-4或更小的有機溶劑適宜于加大對F-APM的轉(zhuǎn)化率DF-L-Asp=PF-L-Asp1+10pH-PKF-L-Asp1+102pH-pKF-L-Asp1-pKF-L-Asp2---(2)]]>其中PF-L-Asp=(CF-L-Asp)org/(CF-L-Asp)aq(2a)；KF-L-Asp1={(CF-L-Asp-)aq×CH+}/(CF-L-Asp)aq---(2b);]]>KF-L-Asp2={(CF-L-Asp2-)aq×CH+}/(CF-L-Asp-)aq---(2c);]]>(CF-L-Asp)org在萃取F-APM之后，有機相所含有的F-L-Asp的濃度；(CF-L-Asp)aq在萃取F-APM之后，殘留在水相中的F-L-Asp的濃度；(CF-L-Asp-)aq在萃取F-APM之后，殘留在水相中的F-L-Asp-的濃度；CH+]]>在F-APM萃取之后，殘留在水相中的H+的濃度，(CF-L-Asp2-)aq在萃取F-APM之后，殘留在水相中的F-L-Asp2-的濃度。
DF-L-Asp表明抑制F-L-Asp從水相的轉(zhuǎn)移(萃取)的能力。
通過下面方案2描述的F-L-Asp的分配模型獲得PF-L-Asp、KF-L-Asp1和KF-L-Asp2。

進一步，通過下面公式(4)獲得上面的公式(2)。DF-L-Asp=(CF-L-Asp)org(CF-L-Asp)aq+(CF-L-Asp-)aq+(CF-L-Asp2-)aq]]>=(CF-L-Asp)org(CF-L-Asp)aq×11+{(CF-L-Asp-)aq+(CF-L-Asp2-)aq}/(CF-L-Asp)aq]]>=PF-L-Asp1+(KF-L-Asp1/CH+)+(KF-L-Asp1/CH+)/(KF-L-Asp2/CH+)]]>=PF-L-Asp1+10pH-pKF-L-Asp1+102pH-pKF-L-Asp1-pKF-L-Asp2---(4)]]>另一方面，在其中被用作原料之一的L-PM或D,L-PM的水解速率高的有機溶劑不是優(yōu)選的，水解速率與有機溶劑和水之間的相互溶解性密切相關(guān)。即，在水中溶解性大的有機溶劑不是優(yōu)選的，因為在這些有機溶劑中L-PM或D,L-PM的水解速率高。因此，優(yōu)選水不混溶的有機溶劑被用作本發(fā)明的溶劑。
這種水不混溶有機溶劑優(yōu)選選自磷酸三丁酯、正戊醇、甲基乙基酮、異丁醇和三戊基醇的溶劑，因為在該溶劑中對F-APM的轉(zhuǎn)化率高。
而且，可使用萃取劑以提高產(chǎn)生的F-APM的萃取效率，優(yōu)選選擇具有強萃取能力、為相轉(zhuǎn)移催化劑的銨鹽和磷鎓鹽作為萃取劑。
進一步，任何商購的嗜熱菌蛋白酶樣金屬蛋白酶，例如thermoase(商品名，由Daiwa Kasei有限公司生產(chǎn))可用作用于本發(fā)明的酶。如本文所采用的，嗜熱菌蛋白酶樣金屬蛋白酶包括“由nprM編碼的野生型嗜熱菌蛋白酶樣中性金屬蛋白酶，其中nprM為一種從嗜熱脂肪芽孢桿菌克隆的蛋白酶基因(Kubo,M.等普通微生物學(xué)雜志，134:1883-1892(1988))或來自嗜熱脂肪溶蛋白芽孢桿菌(Bacillusstearothermoproteolyticus)的基因(Endo,s.發(fā)酵技術(shù)雜志40:346-353(1962))，以及在其天然產(chǎn)生的序列中通過用其它氨基酸置換一個或多個氨基酸或通過缺失或插入一個或多個氨基酸而獲得的任何突變體。這里包括的所有這類突變體能選擇性地形成(N-保護的)-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯。該突變體的實例為具有上面“野生型嗜熱菌蛋白酶樣中性金屬蛋白酶”的氨基酸序列的修飾中性蛋白酶，其中至少一個選自第144位殘基亮氨酸、第150位殘基天冬氨酸、第187位殘基谷氨酸以及第227位殘基天冬酰胺的氨基酸被非所述氨基酸的氨基酸殘基置換(EP0616033A1)，尤其是其中第150位殘基天冬氨酸被色氨酸置換(WO95/16029)的突變體，以及存在于第144位殘基亮氨酸、第149位殘基蘇氨酸、第240位殘基丙氨酸、第270位殘基丙氨酸以及第288位殘基丙氨酸中的電子密度腔體被通過用一個或多個疏水和/或多個大的氨基酸殘基置換至少一個氨基酸殘基來填充所述腔體的至少一部分，或通過影響限制電子密度腔的氨基酸殘基而獲得的突變體(WO97/21804)。例如如美國專利4,116768,EP0616033A1、WO95/16029和WO97/21804中所描述的，所有這些金屬蛋白酶被用于為天冬氨酰苯丙氨酸甲酯前體的Z-APM的合成中。
F-L-Asp和L-PM或D,L-PM可首先被包含在水不混溶溶劑中，并可將由所述水不混溶溶劑組成的有機相加入到水相中，或?qū)⒐腆wF-L-Asp和固體L-PM或D,L-PM分別加入到有機相和/或水相中。
從反應(yīng)動力學(xué)理論的角度來看，水相中pH范圍為6.0-6.5是最優(yōu)選的，然而，這種pH范圍不總是必需的，因為產(chǎn)生的F-APM進入有機相中的萃取速率為速率決定性的。例如，如果降低pH，由于L-PM或D,L-PM的溶解性增加，F(xiàn)-APM的轉(zhuǎn)化率提高。因此，低于6.0-6.5的pH，例如pH為約5.0是優(yōu)選的，應(yīng)考慮產(chǎn)生的F-APM的萃取速率以及對F-APM的轉(zhuǎn)化率之間的平衡來選擇水相中的pH。
并且，不連續(xù)操作和連續(xù)操作均是有效的，但從操作的效率和簡易角度看，連續(xù)操作是優(yōu)選的，并且本發(fā)明的方法可用于連續(xù)操作。即連續(xù)操作是可能的，其中將含有F-L-Asp和L-PM或D,L-PM原料的有機相(具有如本文描述的N-F-APM分配比例)連續(xù)加入到嗜熱菌蛋白酶樣金屬蛋白酶溶解在其中的水相中，將產(chǎn)生的F-APM從水相轉(zhuǎn)移至有機相中，連續(xù)分離含有F-APM的有機相。
在本發(fā)明中，可通過本發(fā)明的方法有效地制備F-APM，其中含有水不混溶溶劑的有機相(具有如本文描述的N-F-APM分配比例)加入到水相中，在水相中進行L-Asp與L-PM或D,L-PM的縮合反應(yīng)，將產(chǎn)生的F-APM有效地轉(zhuǎn)移至特定的有機相中，并且本發(fā)明的方法可用于從操作效率和簡易角度來看為優(yōu)選的連續(xù)操作中。
實施例下面將通過實施例和比較實施例來說明本發(fā)明。然而，應(yīng)注意本發(fā)明決不被這些實施例所限制。實施例1有機溶劑的選擇將10ml用水飽和的有機溶劑和10ml用有機溶劑飽和的水溶液加入到樣品試管中，并將50mM F-L-Asp溶解在用水飽和的所述有機溶劑中，將50mM F-APM溶解在用有機溶劑飽和的所述水溶液中。
對于表明有機溶劑從水相萃取F-APM能力的值，使用由公式(1)描述的DF-APM。
對于表明抑制F-L-Asp從水相轉(zhuǎn)移至有機相能力的值，使用由公式(2)描述的DF-L-Asp。
40℃下，進行這些PF-APM和PF-L-Asp的測定。
多種有機溶劑的DF-APM值示于表1中，其中甲基異丁基酮、甲酸正丁酯和乙酸丁酯被顯示作為比較實施例，多種有機溶劑的DF-L-Asp值示于表2中。
表1DF-APM有機溶劑 PF-APMPKF-APMpH=5 pH=6 pH=7磷酸三丁酯 13.0 4.01 1.200.130.0133正戊醇 3.70 4.22 0.527 0.0604 0.0061叔戊醇 6.89 4.21 0.866 0.107 0.0111甲基乙基酮 2.14 4.61 0.556 0.087 0.0087甲基異丁基酮 0.80 4.01 0.074 0.0080 0.00082甲酸正丁酯 0.64 4.17 0.083 0.0091 0.0012乙酸丁酯 0.47 4.02 0.045 0.0049 0.00049
表2DF-L-Asp(×10-4)有機溶劑PF-L-AspPKF-L-Asp1pKF-L-Asp2pH=5 pH=6 pH=7磷酸三丁酯 0.558 3.184.4418.2 0.226 0.00231正戊醇 0.166 2.954.171.90.0216 0.00021叔戊醇 0.498 3.164.6321.4 0.294 0.00305甲基乙基酮 0.296 3.434.4316.0 0.201 0.00206異丁醇 0.356 3.114.449.90.123 0.00125從這些表中清楚可見選自磷酸三丁酯、正戊醇、叔戊醇、甲基乙基酮和異丁醇的水不混溶溶劑是優(yōu)選的，因為在pH=6.0時的DF-APM值為1×10-2或更高，在pH=6.0時的DF-L-Asp值為1×10-4或更低。水相最優(yōu)選pH的確定分別制備含有1g/l thermoase(商品名，Daiwa Kasei有限公司生產(chǎn))的水溶液和其中溶解了70mM F-L-Asp和100mM L-PM的底物溶液并保存在40℃。
在通過加入1N NaOH水溶液調(diào)節(jié)所述底物溶液的pH后，將5ml由此獲得的底物溶液與1g/l thermoase混合，F(xiàn)-L-Asp和L-PM之間的縮合反應(yīng)開始。
用HPLC分析F-L-Asp、L-PM和F-APM的濃度。
圖1表明pH與F-APM最初形成速率之間的相互關(guān)系。坐標軸顯示針對6.4處的F-APM初始形成速率的相對值(V6.4=0.0060mM/Min)。
很清楚水相最優(yōu)選的pH為約6.4實施例2在水相和有機相的雙相體系中通過不連續(xù)操作完成本實施例。
分別制備含有1.131g/l thermoase,0.1M緩沖劑(MES)和0.01M CaCl2的酶水溶液(pH=6.5)和含有88.15mM F-L-Asp和120.97mM L-PM的底物磷酸三丁酯溶液，并保存在40℃。將各5ml兩種溶液混合，F(xiàn)-L-Asp和L-PM之間的縮合反應(yīng)開始。用HPLC分析F-L-Asp、L-PM和F-APM的濃度。
圖2顯示在水相和有機相中F-L-APM的濃度與時間的關(guān)系。
顯然所有產(chǎn)生的F-APM被轉(zhuǎn)移至有機相中，任何F-APM不存在于水相中，基于F-L-Asp的從F-L-Asp轉(zhuǎn)化為F-APM的轉(zhuǎn)化率為約12.6％。比較實施例1進行與實施例1類似的方法，但不使用有機溶劑。
F-L-Asp轉(zhuǎn)化為F-APM的轉(zhuǎn)化率僅為約3.7％。實施例3預(yù)先將含有20g/l thermoase(商品名，Daiwa Kasei有限公司生產(chǎn))的酶水溶液倒入300ml反應(yīng)器中，并通過使用圖3描述的反應(yīng)裝置，將含有約5mM F-L-Asp和約130mM L-PM的各種有機溶劑的底物溶液以0.5ml/分鐘連續(xù)加入到該反應(yīng)器中(在反應(yīng)器中的停留時間為10小時)。
將起始原料F-L-Asp和L-PM從有機相萃取至水相中，讓其在含有游離酶的水相中反應(yīng)，將產(chǎn)生的F-APM從水相萃取至有機相中，連續(xù)分離出F-APM。由于其強的疏水特性，游離酶不必從水相中萃取出來，這些酶可以連續(xù)使用。
通過使用具有3.5cm直徑和7mm寬的棒型葉片的攪拌器以450rpm攪拌反應(yīng)溶液，在反應(yīng)期間，將溫度和pH保持在40℃和6.0。
通過使用多種有機溶劑獲得的F-APM的轉(zhuǎn)化率示于下面表3中。
表3有機溶劑F-APM的轉(zhuǎn)化率(％)磷酸三丁酯 96甲基乙基酮 64甲基乙基酮 85(使用D,L-PM)表3表明磷酸三丁酯的轉(zhuǎn)化率為96％的非常高的值。
圖4顯示當(dāng)使用磷酸三丁酯時，在有機相中F-L-Asp、L-PM和產(chǎn)生的F-APM的濃度隨時間的變化，并表明F-APM以恒定濃度連續(xù)產(chǎn)生。
雖然已詳細并參考其具體實施例描述了本發(fā)明，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不背離其實質(zhì)和范圍的情況下對其作出的各種變化和修改將是顯而易見的。
本發(fā)明是基于1996年10月15在日本申請的申請?zhí)柶匠?-272129，其全部內(nèi)容被本文引作參考。
權(quán)利要求
1．一種通過N-甲?；?L-天冬氨酸與L-苯丙氨酸甲酯或D,L-苯丙氨酸甲酯之間的縮合反應(yīng)制備N-甲?；?α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的酶促方法，它包括將包含在pH=6.0時，如下面公式(1)所描述的N-甲?；?α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯分配比例DF-APM為10-2或更高的水不混溶溶劑DF-APM=PF-APM1+10pH-pKF-APM---(1)]]>其中PF-APM=(CF-APM)otg/(CF-APM)aq(1a)；KF-APM={(CF-APM-)aq×CH+}/(CF-APM)aq---(1b);]]>(CF-APM)org在萃取F-APM之后，有機相所含有的F-APM的濃度；(CF-APM)aq在萃取F-APM之后，殘留在水相中的F-APM的濃度；(CF-APM-)aq在萃取F-APM之后，殘留在水相中的F-APM-的濃度；CH+在萃取F-APM之后，殘留在水相中的H+的濃度，并含有N-甲?；?L-天冬氨酸和L-或D,L-苯丙氨酸甲酯的有機相；加入到含有嗜熱菌蛋白酶樣金屬蛋白酶的水相中；在水相中進行縮合反應(yīng)以產(chǎn)生N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯；和將由此產(chǎn)生的N-甲?；?α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯從水相萃取至有機相中。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在水不混溶溶劑中，當(dāng)pH=6.0時，由下面公式(2)描述的N-甲?；?L-天冬氨酸的分配比例DF-L-Asp為10-4或更小DF-L-Asp=PF-L-Asp1+10pH-pKF-L-Asp1+102pH-pKF-L-Asp1-pkF-L-Asp2---(2)]]>其中PF-L-Asp=(CF-L-Asp)org/(CF-L-Asp)aq(2a)；KF-L-Asp1={(CF-L-Asp-)aq×CH+}/(CF-L-Asp)aq---(2b);]]>KF-L-Asp2={(CF-L-Asp2-)aq×CH+}/(CF-L-Asp-)aq---(2c);]]>和(CF-L-Asp)org在萃取F-APM之后，有機相所含有的F-L-Asp的濃度；(CF-L-Asp)aq在萃取F-APM之后，殘留在水相中的F-L-Asp的濃度；(CF-L-Asp-)aq在萃取F-APM之后，殘留在水相中的F-L-Asp-的濃度；CH+在F-APM萃取之后，殘留在水相中的H+的濃度，(CF-L-Asp2-)aq在萃取F-APM之后，殘留在水相中的F-L-Asp2-的濃度。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中水不混溶溶劑為至少一種選自磷酸三丁酯、正戊醇、甲基乙基酮、異丁醇和三戊基醇的溶劑。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中將含有F-L-天冬氨酸和L-或D,L-苯丙氨酸甲酯的水不混溶溶劑連續(xù)加入到水相中，連續(xù)分離出包含產(chǎn)生的N-甲?；?α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的有機相。
5．根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中預(yù)先將N-甲?；?L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯或D,L-苯丙氨酸甲酯溶解在水不混溶溶劑中，接著將包含水不混溶溶劑的有機相加入到水相中。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中將固體N-甲?；?L-天冬氨酸和固體L-苯丙氨酸甲酯或固體D,L-苯丙氨酸甲酯分別加入到有機相和/或水相中。
全文摘要
一種通過N－甲酰基－L－天冬氨酸與L－苯丙氨酸甲酯或D,L－苯丙氨酸甲酯之間的縮合反應(yīng)制備N－甲?；粒璍－天冬氨酰－L－苯丙氨酸甲酯的酶促方法,它包括:將包含在pH=6.0時,如下面公式(1):D
文檔編號C07K5/075GK1236371SQ97198809
公開日1999年11月24日 申請日期1997年10月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月15日
發(fā)明者平田彰 申請人:荷蘭加甜劑公司