專利名稱：：蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3及其編碼的核酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學、以及基因工程領(lǐng)域。特別是一種在蝶蛹金小蜂中表達的抗菌蛋白Pp-AP3及其編碼的核酸序列。
背景技術(shù)：
：近年來，由于藥物的濫用，藥物殘留和細菌耐藥性等問題日漸嚴重，現(xiàn)有的抗生素藥物正在失去原來的療效，從而引發(fā)了人們對食品安全的關(guān)注，越來越多的國家開始呼吁禁用抗生素，而抗菌肽(antibacterialp印tides)因其獨特的生物活性以及不同于傳統(tǒng)抗生素的特殊作用機理，已引起人們的極大的研究興趣，成為分子生物學和生物化學研究領(lǐng)域的熱點之一。各國的研究人員已經(jīng)從哺乳動物及昆蟲、兩棲動物等中發(fā)現(xiàn)了幾百種抗菌肽，其中有些已經(jīng)分離提取了出來，并對其結(jié)構(gòu)、抗菌活性等作了許多的研究，發(fā)現(xiàn)其抗菌活性高效、廣譜，并且本身無毒、無害，對細菌、病毒、某些原蟲、真菌及腫瘤細胞等具有選擇性殺傷作用。自1980年瑞典斯德哥爾摩大學Boman研究小組，首次由大腸桿菌注射誘導處理的惜古比天蠶蛾滯育蛹血淋巴中提純得抗菌肽以來，國內(nèi)外許多學者就昆蟲源的抗菌蛋白/肽已做了大量的篩選、活性測定、基因克隆與表達等工作，且明確昆蟲抗菌蛋白/肽可分成天蠶素(cecropins)、防衛(wèi)素(defensins)、富含脯氨酸的抗菌肽(prolin-richantibacterialpeptides)和富含甘氨酸的抗菌肽(glycine-richantibacterialpeptides)(Brey&Hultmark,1998)。作為地球上種類最多的生物，昆蟲具有繁殖快、適應(yīng)性廣的特點；除海洋外，所有生態(tài)環(huán)境都有昆蟲的分布。自19世紀起，昆蟲就被作為免疫防衛(wèi)系統(tǒng)的研究對象。尚存于地球上的昆蟲都是在劇烈的生存競爭中取得勝利后才生存下來的，它們在進化的過程中增強了抵抗各種病原菌侵染的能力，這就為我們篩選具有抗菌作用的昆蟲抗菌蛋白/肽及其目的基因提供了豐富的基因資源庫。眾多研究人員從不同的昆蟲中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種抗菌蛋白，但尚未有任何文獻報道從蝶蛹金小蜂中分離得到的抗菌肽。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有抗菌性能的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3及其編碼的核酸序列。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼的核酸序列，其所分離出的DNA分子包括編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3活性的多肽核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者該核苷酸序列能在40-55"C條件下與SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列雜交。作為本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3編碼的核酸序列的改進該序列具有SEQIDNO:l中第767-871位的核苷酸序列。作為本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3編碼的核酸序列的進一步改進該序列中包含8106個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明還同時提供了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp—AP3，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。作為本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp—AP3的改進蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽為多肽、其保守性變異多肽、其活性片段或其活性衍生物。本發(fā)明所提供的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3及其編碼的核酸序列，使其能夠應(yīng)用在蝶蛹金小蜂中表達的新的抗菌蛋白、編碼序列及其在開發(fā)成有應(yīng)用價值的食品添加劑和藥物并應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和食品衛(wèi)生等多個領(lǐng)域。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明通過基于cDNA表達性文庫的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及高效克隆篩選方法，以蝶蛹金小蜂為實驗材料，篩選其體內(nèi)表達的抗菌蛋白。該方法鑒于潛在抗菌蛋白/肽目的表達物能致死本身宿主菌的特點，將潛在抗菌蛋白/肽的蝶蛹金小蜂的基因的表達與表達物抗菌活性初步測定緊密相合，進行篩選。當篩選到表達物能使宿主菌死亡的克隆時，也就獲得了相應(yīng)的源于蝶蛹金小蜂的插入之文庫中的目的基因。具有抗菌作用基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入SOLR菌后，在誘導劑IPTG(異丙基-b-d-硫代半乳糖苷)的誘導下基因表達后產(chǎn)生抗菌的蛋白/肽，致使菌體的細胞膜收到破壞，從而允許染料分子進入細菌細胞，發(fā)生顯色反應(yīng)，即觀察發(fā)現(xiàn)藍色的克隆。所以，這些被染成藍色的克隆就是含有抗菌基因的克隆。將它們挑出后測序，就可得到相應(yīng)的基因序列及其編碼的相應(yīng)的抗菌蛋白。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的在本發(fā)明所分離出的DNA分子包括編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55攝氏度條件下與SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列雜交。較佳的，所述的序列編碼具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列。本發(fā)明分離出的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3包括具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDNO:2序列的多肽。本發(fā)明DNA分子包含所述的DNA分子中8-106個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細胞是原核細胞。在本發(fā)明中，"分離的"、"純化的"DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核苷酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3(或多肽)編碼的核酸序列指編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO:1中第767-871位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDNO:1序列編碼框第767-871位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子取代后產(chǎn)生的序列。由于密碼的簡并性，所以與SEQIDNO:1中第767-871位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQIDNO:1所述的序列。還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還包括與SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。還包括能編碼具有天然的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3相同功能的蛋白的SEQIDNO:1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5'和域3'端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3或多肽指具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的SEQIDNO:2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3相同功能的、SEQIDNO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地以5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又別如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的活性片段和活性衍生物。在本發(fā)明中蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3保守性變異多肽指與SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>Thr(T)SerSerTrp(W)Tyr;PheTyrTyr(Y)Trp;Phe;Thr;SerPheVal(V)lie;Leu;Met;Phe;AlaLeu發(fā)明還包括蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3或多肽的類似物。這些類似物與天然抗菌多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可以通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L一氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y—氮基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述列舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3多肽時，可以將蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼序列可操作地連于表達調(diào)控序列，從而形成蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3表達載體。如本發(fā)明所用的"可操作地連于"指這樣一種情況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能夠翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中宿主細胞為原核細胞。常用的原核宿主細胞指得是大腸桿菌細胞。還可用Northern印跡法技術(shù)分析蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3基因產(chǎn)物的表達，即分析蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的RNA轉(zhuǎn)錄物在細胞中的存在與否和數(shù)量。此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3核苷酸編碼序列的8—106個連續(xù)氨基酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的核酸分子。本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。此外，根據(jù)本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3核苷酸序列和氦基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3同源基因或同源蛋白。為了得到與蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3基因相關(guān)的蝶蛹金小蜂cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選蝶蛹金小蜂cDNA文庫，這些探針是在低嚴緊條件下，用"P對蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自蝶蛹金小蜂的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學領(lǐng)域眾所周知的。另夕卜，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clonetech，Stratagene，PaloAlto......，這種篩選方法也可以識別與蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的基因家族的核苷酸序列。本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得到有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;Merrifield丄(1963)丄AmChem.Soc85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接產(chǎn)生全長的分子。利用本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或抗拮劑等。本發(fā)明在抗性試驗中具有明顯的作用，對抑制細菌的生長有明顯效果。我國擁有眾多昆蟲種類，卻很少從其體內(nèi)發(fā)現(xiàn)新的抗菌蛋白，本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3正是具備抗菌作用的新的蛋白，因此，具有很大的應(yīng)用價值。本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼的核酸序列，可按照以下方法獲得(1)蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3服基因的cDNA(互補脫氧核糖核酸)，表達性文庫的構(gòu)建自蝶蛹金小蜂分離總RNA，提取poly(A)+RNA,克隆構(gòu)建得蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3/肽基因的cDNA表達性文庫；(2)cDNA表達性文庫的篩選a、制備SOLR菌液；b、將原噬茵體文庫轉(zhuǎn)化入制備好的SOLR菌液中并測定效價；c、制備LB/Amp+濾膜平板；d、取已轉(zhuǎn)化的SOLR菌液鋪板，先在0.45毫米的瓊脂糖/氨芐青霉素微孔濾膜平板上涂板，37攝氏度倒置培養(yǎng)15小時左右至膜上有較小的菌落形成；再轉(zhuǎn)移至瓊脂糖/氨芐青霉素/異丙基-b-d-硫代半乳糖苷培養(yǎng)基，37攝氏度倒置培養(yǎng)34小時，至菌落生長到正常大小(1毫米左右)，轉(zhuǎn)至染色瓊脂培養(yǎng)基，染色10分鐘左右；同時與未經(jīng)異丙基-b-d-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導培養(yǎng)的作對照；挑取藍色菌落，于100微升含20%甘油的瓊脂糖/氨芐青霉素培養(yǎng)液中，零下70攝氏度貯存，得蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3服基因。上述步驟(1)中總RNA自昆蟲的整體或特定器官分離得到，采用純化mRNA試劑盒獲得poly(A)+RNA，采用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA⑧合成試劑盒和ZAP-cDNA⑤GigapackIII克隆試劑盒(由美國clontech公司Takana代理處購得，無中文名稱)構(gòu)建得cDNA表達性文庫。上述步驟(2)的d中染色瓊脂培養(yǎng)基按XX百分比傲照如下百分比配制)苔酚藍0.0005%(0.005%)，溴酚藍0.0005%(0.005%)，瓊脂0.4%(稱取0.5g苔酚藍和0.5g溴酚藍，分別溶解于9.5克水中，從而分別配成5%的苔酚藍母液和溴酚藍母液。另稱取4克瓊脂溶于^IL水中，加熱使其徹底溶解；加入1毫升苔酚藍母液和1毫升溴酚藍母液，使得兩種染料的終濃度為0.005%,混勻后放置半小時使其冷卻凝固即可。)。SOLR菌液cDNA合成試劑盒中自帶該SOLR菌液。步驟(2)的原噬菌體文庫是步驟(1)中所構(gòu)建的cDNA表達性文庫。可按照下列配方配制瓊脂糖/氨芐青霉素濾膜平板瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸餾水1升。120攝氏度高溫高壓滅菌后冷卻至50攝氏度左右，加入100毫克/毫升的氨芐青霉素(Amp)母液(自配)1毫升，搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后在培養(yǎng)基表面放上高溫滅菌過的微孔濾膜(孔徑為0.45微米，購于河北省保定市萬科實驗儀器貿(mào)易有限公司)，此即瓊脂糖/氨芐青霉素濾膜平板?？砂凑障铝信浞脚渲骗傊悄S青霉素/異丙基-b-d-硫代半乳糖苷培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸餾水1升。120攝氏度高溫高壓滅菌后冷卻至50攝氏度左右，加入100毫克/毫升的氨芐青霉素(Amp)母液(自配)1毫升，0.5摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)母液(自配)1毫升，搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后即瓊脂糖/氨芐青霉素/異丙基-b-d-硫代半乳糖苷培養(yǎng)基。本發(fā)明涉及的序列及記號分別如下(1)序列特征(A)長度915bp(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(2)分子類型核苷酸(3)序列描述浙江大學蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼序列915DNA蝶蟲甬金小蜂(Pterama/uspwparum)GGGAACAAsAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCC6QGGGCTGCAGGAATTCGGCACGAGGCCGAACAATTGTATCCTCCGGTTGGCTCTCTTGTGT12〇GGATACTTATATATATATATATATACCGATCTCGATACCGGTCAAAGTTTTTTTTTTTGT180TTTCGTTTCGAACTTACTGTGACAAATTCCGTTGCTGAAAAAGAAGAAAAGAAGATACAT240CATGGCTCACGGAACAACCCTTGCGCTTGTAATTTGCGCTACTATCGCTTGCAGCTTCGC300CATAGAATTGCCCGACTTCATCCACGTCTGCAAGCGTAACGATCCTCAGATCGAGTCGTG360CATCAAAAAGAGTGTCGAAGATCTACGACCAAAACTGATGACAGGTGTCCCCGAATACAA420TATCCCATCGTTGGAACCACTTCTGTTGAAGGAACTGGTAGCAGCTGAAGGTGCCGGTGG480ACTCAAGATCACGGCCAAGGATGTCCATGCCTACGGTGCCAGTGACTTTGTTGTTCAGAA540GCTCAGAGTCGACGTTTCGCAGCTGCGTTTCGCCCTGGACATCCTCCTACCTCACCTGTA600CATCGAGGGTCAGTACGAGATCGATGGACGTGTCCTCCTGCTGCCAATCCGTGGTAACGG660CCCAATGACCGGTAACTTCACCGATGCGACTGGTTCGGTCAAGATCCAGGCAACTTTGTT720CAAGGATGACCAGGGCAACGATCACCTCAAGCTCAGCGAGTTCCGCATGCGTATTTCC778MetArg工leSerATCCGTAAAGGTTCTCTCAAATTGGACAACCTTTTCGGTGGTGACCCAACC829lieArgLysGlySerLeuLysLeuAspAsnLeuPheGlyGlyAspProThr51〇1520CTTGGGCAATGTTGTCAACAACGCCATCAACACCAACTTTGACGCTTTTATC881LeuGlyGinCysCcyGinGinArgHisGinHisGinLeuStop2530AAGGAACTTCAACCTCTTMCGAGAAGGCTTTGT91下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖l是本發(fā)明的基于cDNA(互補DNA)表達性文庫的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的高效克隆篩選技術(shù)方案示意圖；圖2為本發(fā)明的篩選時濾膜上的SOLR菌菌落圖；注在大量白色菌落中有形狀較小的藍色菌落，即是包含具潛在抗菌活性的目的基因；圖3為本發(fā)明的用紙片法測試合成的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3對SOLR菌的抑制效果圖；圖中"《)"代表0.1%乙酸，"2"代表1m摩爾樣品。具體實施方式下面結(jié)合實驗室具體的試驗數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1:(參照圖1:)1、蝶蛹金小蜂cDNA(互補DNA)表達性文庫的構(gòu)建蝶蛹金小蜂來源于浙江大學昆蟲科學研究所昆蟲生理生化實驗室。a、自蝶蛹金小蜂的整體分離總RNA，以純化mRNA試劑盒獲得poly(A)+RNA，再采用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA⑧合成試劑盒和ZAP-cDNA⑧GigapacklII克隆試劑盒(由美國dontech公司Takana代理處購得，無中文名稱)構(gòu)建得cDNA(互補DNA)表達性文庫。b、根據(jù)，參照試劑盒操作說明進行各步操作，即構(gòu)建得cDNA(互補DNA)表達性文庫。2、蝶蛹金小蜂cDNA(互補DNA)表達性文庫的篩選a、制備SOLR(大腸桿菌的一種，無中文名)菌液接菌環(huán)在酒精燈上灼燒至紅，冷卻后蘸取少量大腸桿菌SOLR甘油菌(菌液和甘油的混合物，甘油的體積比約為20%，有利于菌液在低溫下保存而不影響其正?；钚?于含卡那霉素的瓊脂糖培養(yǎng)基上劃線，37攝氏度培養(yǎng)12小時。挑取單菌落于50毫升的瓊脂糖豐富培養(yǎng)基(LB營養(yǎng)瓊脂)中，37攝氏度，200轉(zhuǎn)/分(rpm)培養(yǎng)12小時左右。轉(zhuǎn)移至50毫升離心管中，1000轉(zhuǎn)/分，4攝氏度離心10分鐘。去上清液，再用10毫摩爾的硫酸鎂溶液懸浮沉淀，調(diào)解OD600值為1.0。b、制備瓊脂糖/氨芐青霉素濾膜平板制備含100微克/毫升的氨芐青霉素的瓊脂糖平板若干。LB/A卿+濾膜平板的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸餾水l升；均勻混合后，12(TC高溫高壓(0.4Mpa)滅菌后冷卻至5(TC左右，加入100毫克/毫升的氨芐青霉素母液l毫升；搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后在培養(yǎng)基表面放上高溫滅菌過的孔徑為0.45微米的微孔濾膜，即得LB/Amp+濾膜平板；即取已滅菌的濾膜(孔徑0.45pm)鋪于LB/Amp+平板上，注意膜與平板之間無氣泡。c、將原噬箇體文庫(即步驟1所構(gòu)建的cDNA表達性文庫)轉(zhuǎn)化入制備好的SOLR菌液中并測定效價將原噬菌體文庫加雙蒸水稀釋50倍，分別取稀釋過的菌液1微升于步驟(a)所得的200微升SOLR菌液中，37攝氏度溫育15分鐘，取100微升在瓊脂糖/氨芐青霉素濾膜平板上涂板，用在酒精燈上灼燒并冷卻過的三角棒涂開，正面向上放置20分鐘后37攝氏度倒置培養(yǎng)12小時。查看細菌生長情況，從而決定轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中原噬粒文庫的稀釋倍數(shù)，由于稀釋50倍及100倍后轉(zhuǎn)化效果不好，使得生長濃度較低(每塊培養(yǎng)基上應(yīng)該生長數(shù)千個克隆)從而不稀釋。取1OO微升的蝶蛹金小蜂噬粒(即我們自己構(gòu)建的蝶蛹金小蜂的cDNA表達性文庫)于2毫升步驟(a)所得的SOLR菌液中，37攝氏度溫育15分鐘，取100微升在瓊脂糖/氨芐青霉素濾膜平板上涂板，用在酒精燈上灼燒并冷卻好的三角棒涂開，正面向上放置20分鐘后37攝氏度倒置培養(yǎng)12小時，査看結(jié)合效果。將上步所得的蝶蛹金小蜂噬粒與SOLR的結(jié)合產(chǎn)物2毫升置于50毫升瓊脂糖豐富培養(yǎng)液(LB營養(yǎng)液)中，37攝氏度，200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)4~5小時，至稠，再取100微升在瓊脂糖/氨芐青霉素濾膜平板上涂板，37攝氏度倒置培養(yǎng)12小時，測定效價。將上步所得的50毫升菌液按20%比例加入甘油，搖勻后分裝成1毫升/管，于零下70攝氏度貯存?zhèn)溆谩０?00倍、1000倍和10000倍的比例稀釋上述菌液后，各取100微升在瓊脂糖/氨芐青霉素濾膜平板上涂板，正面向上放置20分鐘后37攝氏度倒置培養(yǎng)12小時。觀察膜上菌落生長情況以找出最佳倍數(shù)。通過測定效價和最佳稀釋倍數(shù)。找出最佳反應(yīng)菌液體積，即100微升/板，培養(yǎng)后每塊LB濾膜平板上有幾千個菌落。d、鋪板、染色取零下70攝氏度C存的已轉(zhuǎn)化的SOLR菌液100微升在瓊脂糖/氨節(jié)青霉素濾膜平板上涂板，正面向上放置20分鐘后，于37攝氏度倒置培養(yǎng)15小時左右至膜上有較小(一般為0.10.5mm)的菌落形成。再轉(zhuǎn)移至瓊脂糖/氨芐青霉素/異丙基-b-d-硫代半乳糖苷培養(yǎng)基(1^/八1^+/1丁0+培養(yǎng)基)，37攝氏度倒置培養(yǎng)3~4小時，至菌落生長到正常大小，轉(zhuǎn)至染色瓊脂培養(yǎng)基，染色10分鐘左右，參見圖2，仔細觀察后用滅菌牙簽挑取藍色菌落，于100微升含20%甘油的瓊脂糖/氨芐青霉素培養(yǎng)液中，并記錄挑取的菌落大小及染色深淺情況，渦旋振蕩混勻后分成兩管，在兩管上標上相同的號碼，如PP1a，零下70攝氏度貯存。上述染色瓊脂培養(yǎng)基的制作方法如下稱取0.5g苔酚藍和0.5g溴酚藍，分別溶解于9.5克水中，從而分別配成5%的苔酚藍母液和溴酚藍母液；另稱取4克瓊脂溶于1L水中，加熱使其徹底溶解，再加入1毫升苔酚藍母液和1毫升溴酚藍母液，混勻后放置半小時使其冷卻凝固即可。即所得染色瓊脂培養(yǎng)基為苔酚藍0.0005%，溴酚藍0.0005%，瓊脂0.4%。上述LB/Amp7lPTG+培養(yǎng)基的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸餾水l升；均勻混合后，12(TC高溫高壓滅菌后冷卻至5(TC左右，加入100毫克/毫升的氨芐青霉素母液l毫升，0.5摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷母液1亳升，搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后，即得18^1^+/116+培養(yǎng)基。e、涂板法驗證取出上述d步驟保存的PP1a菌液樣品，置于冰上。吸取5微升涂于LB/Amp+ZIPTG—及LB/Amp+7IPTG+濾膜平板，正面向上放置10分鐘后37攝氏度倒置培養(yǎng)12小時。LB/Amp7lPTG—濾膜平板的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸餾水l升；均勻混合后，12(TC高溫0.4Mpa滅菌后冷卻至5(TC左右，加入100毫克/毫升的氨芐青霉素母液1毫升；搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后在培養(yǎng)基表面放上高溫滅菌過的孔徑為0.45微米的微孔濾膜，即得LB/Amp7lPTG—濾膜平板。LB/Amp7lPTG+濾膜平板的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸餾水l升；均勻混合后，12(TC高溫高壓滅菌后冷卻至5(TC左右，加入100毫克/毫升的氨芐青霉素母液1毫升，0.5摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷母液1毫升，搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后在培養(yǎng)基表面放上高溫滅菌過的孔徑為0.45微米的微孔濾膜，即得LB/Amp7lPTG+濾膜平板。將膜取下置于染色瓊脂培養(yǎng)基上染色，比較膜上同一樣品菌落生長的大小、密度、著色度及在LB/Amp7lPTG+濾膜平板上的菌落是否呈現(xiàn)統(tǒng)一顏色的情況，將詳細情況進行記錄。將新挑出的菌落(PP化)保存于100微升含20。/。甘油的瓊脂糖/氨芐青霉素培養(yǎng)液中，渦旋振蕩混勻后分成兩管，在兩管上標上與原樣品相同的號碼，如PP1b，b表示是涂板法驗證后重新挑取的菌液樣品，零下70攝氏度貯存。根據(jù)染色的不同情況，作出不同的處理:①如果兩張膜上的菌落均不被染成藍色，則說明此樣品不含殺菌作用的基因，可丟棄該樣品。②如果菌落在LB/Amp7lPTG+濾膜上被部分染成藍色，而在LB/Amp7lPTG—不染色，說明挑取的樣品具有殺菌作用的基因，但此樣品混合了其他不含殺菌作用基因的克隆，則挑取LB/Amp7lPTG+濾膜上被染成藍色的單菌落于100微升含20Q/。甘油的瓊脂糖/氨芐青霉素培養(yǎng)液中，渦旋振蕩混勻后分成兩管，在兩管上標上與原樣品相同的號碼，如PP化，b表示是劃線法驗證后重新挑取的菌液樣品，零下70攝氏度貯存。③如果菌落在LB/Arap7lPTG+濾膜上被全部染成藍色，而在1^^1^+/0^&上不染色，說明挑取的樣品具有殺菌作用的基因，且此樣品只含有該種克隆，則挑取在LB/Amp7lPTG—上的無色單菌落于含20。/。甘油的100微升瓊脂糖/氨芐青霉素培養(yǎng)液中，渦旋振蕩混勻后分成兩管，在兩管上標上與原樣品相同的號碼，如PP2b，零下70攝氏度貯存。④如果菌落在LB/Amp7lPTG+濾膜上被部分染成藍色，而在LB/A卿7lPTG—膜上也有部分被染成藍色，說明挑取的樣品含有殺菌作用的基因，且該基因在沒有異丙基-b-d-硫代半乳糖苷誘導的情況下也能表達從而產(chǎn)生殺菌效果；但此樣品混合了其他不含殺菌作用基因的克隆，處理方法同②。如果菌落在13^11^+/1丁0+及LB/AmpVlPTG—兩張濾膜上全部被染成藍色，說明挑取的樣品含有殺菌作用的基因，且該基因在沒有異丙基-b-d-硫代半乳糖苷誘導的情況下也能表達從而產(chǎn)生殺菌效果，且此樣品只含有該種克隆，因此只需保存原先保存的樣品，不用再挑取新的菌落。對于還沒有純化的樣品如情況②和④還需進行再次涂板，直至在LB/Amp+7IPTG+濾膜平板上呈現(xiàn)統(tǒng)一的藍色為止。藍色是因為該菌落中昆蟲源基因表達的蛋白/肽能使SOLR菌死亡，死亡的細胞被苔酚蘭染色成藍色，否則為白色。3、抗菌活性的初步驗證液體抑菌實驗a、取保存的菌液樣品(經(jīng)上述步驟⑤驗證后保存的菌液)涂于1^/八11^+/1丁0-及LB/Amp+7IPTG+濾膜平板，培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)至染色瓊脂培養(yǎng)基染色，如果LB/AmpVlPTG+板上的克隆全部染色，則挑取LB/AmpVlPTG-板上白克隆510個；如果LB/Amp+ZIPTG+板上的克隆不是全部染色的話，說明菌樣在保存后經(jīng)過多次操作，可能已經(jīng)不純，則挑取LB/AmpVlPTG+板上的染色克隆510個。b、將挑取的克隆接入5豪升LB/Amp+培養(yǎng)液，37°C、200rpm震蕩培養(yǎng)10h左右，使細菌的OD600達到1.0左右。c、取上述菌液(SPOD60()達到1.0左右的菌液)30iJl于3ml瓊脂糖/氨芐青霉素培養(yǎng)液(氨芐青霉素新鮮加入)中，(每個樣品接4管，2管LB/AmpVlPTG+，2管LB/Amp+ZIPTG—)。分別培養(yǎng)2，3，4小時后測OD600(經(jīng)常觀察，當瓊脂糖/氨芐青霉素的菌液的OD600值大致在0.5左右時測其值)。通過觀察發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖/氨芐青霉素/異丙基-b-d-硫代半乳糖苷的菌液與瓊脂糖/氨芐青霉素的菌液相比較為澄清，或者有沉淀出現(xiàn)，而瓊脂糖/氨芐青霉素的菌液則呈現(xiàn)出絮狀的菌絲；通過分光光度計的測定，瓊脂糖/氨芐青霉素/異丙基-b-d-硫代半乳糖苷的菌液的OD600值明顯小于瓊脂糖/氨芐青霉素的菌液，說明在異丙基-b-d-硫代半乳糖苷的誘導下抗菌肽基因表達，從而對細菌生長產(chǎn)生抑制作用。4、測序篩選所得并經(jīng)過驗證的含抗菌蛋白/肽的質(zhì)粒的菌液樣品送至測序公司進行測序；詳細序列見SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。本發(fā)明新的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3全長cDNA的長度為915bp，其中開放閱讀框位于767-871位核苷酸。根據(jù)全長cDNA推導出蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的氨基酸序列，共34個氨基酸殘基，分子量3747.30kD，P値9.29。將蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用Genebank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST沐AMP數(shù)據(jù)庫(http:〃aps.unmc.edu/AP/main.php;http:〃reseach.izr.astar.edu.sg/Templar/DB/ANTIMIC)進行核苷酸和蛋白質(zhì)相似物和同源物的檢索。通過序列比對判斷所篩選的基因是新基因，與目前已發(fā)現(xiàn)的各類抗菌蛋白/多肽在基因和蛋白水品上沒有明顯的同源性。5、蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的人工合成(由上海波泰生物科技有限公司完成)a、試齊U芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸為美國SIAM公司產(chǎn)品；PyBOP、Wang樹脂為美國SIAM公司產(chǎn)品；六氫吡啶、二甲基吡啶為Merck公司產(chǎn)品；二甲基甲酰胺(DMF)為日本進口(使用前先經(jīng)茚三酮浸泡和3A分子篩脫水，并測定無游離氨基)；二氯甲烷(DCM)為中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司產(chǎn)品(使用前用無水碳酸鉀浸泡處理)；三氟乙酸(TFA)為GEELBELGIUM公司產(chǎn)品；甲醇為上海振興化工一廠產(chǎn)品；HPLC甲醇為Merck公司產(chǎn)品；四氫呋喃為上?；瘜W試劑站中心化工廠產(chǎn)品。b、儀器431A型多肽合成儀為Appliedbiosystems產(chǎn)品,高效液相色譜為安捷倫1100色譜儀；冷凍干燥機(FREEZEDRYER18)為LABC0NC0產(chǎn)品；質(zhì)譜儀為FinniganLCQ。c、方法合成序列RISIRKGSLKLDNLFGGDPTLGQCCQQRHQHQL肽鏈的合成肽鏈的合成采用Fmoc/PyBOP方法。Fmoc的脫帽用30。/o六氫吡啶的DMF溶液。肽鏈從樹脂上的切落用切肽試劑(三氟乙酸/結(jié)晶苯酚/7jC/乙二硫醇/甲乙硫醚/=81.5/5/5/5/2.5/1)。稱取100mgFmoc-lie-wangresin,依次按各種Fmoc-氨基酸每步接肽反應(yīng)加入PyBOP--------Mwt:520.30----------------1123.9[mg/coupling]HOBt+H20—Mwt:153.10----------------4320[micro-L/coupling]NMM----------109.95[mL/mol]-------------3240[micro-L/coupling脫帽反應(yīng)加入六氫吡P定-----------30%------------------------9000x2[micro-L/coupling]洗滌時用DMF----------------------------------------------9000x5[micro-L/coupling]接肽在431A自動合成儀上進行，接完的樹脂全部轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，加入事先配好并預(yù)冷的切肽試劑5ml。25。C下攪拌反應(yīng)2小時。過濾，收集濾液。樹脂用少量三氟乙酸洗3次。將洗滌液與濾液合并，濃縮后冷卻，然后加入10ml冷乙醚使多肽沉淀。離心收集，真空干燥。得粗品約60mg。純化先用分析柱確定目標肽方法是使用C18反相柱子，條件為A相為95。/o的水(甲醇配比)，B相為95。/。的甲醇(甲醇配比)，然后各加0.1y。的TFA，常規(guī)條件從A相到B相為20分鐘梯度。檢測波長:220納米，流速1毫升/分鐘，先用A溶液平衡柱子，上樣后，從A到B溶液梯度洗脫20分鐘，收集目標肽，然后做質(zhì)譜鑒定。制備(使用儀器Waters600E)使用C化反相制備柱子，條件為A相為95。/。的水(甲醇配比)，B相為95。/。的甲醇(甲醇配比)，然后各加0.1Q/。的TFA，常規(guī)條件從A相到B相為30分鐘梯度。檢測波長:220納米，流速10毫升/分鐘，先用A溶液平衡柱子，上樣后，從A到B溶液梯度洗脫30分鐘，收集目標肽洗脫液，凍干。6、合成肽抗菌活性的測定a、制備合成肽溶液將30mg合成肽溶解于140ul0.1X的乙酸溶液中配成100mM的母液，分裝成10管存于一2crc備用。b、制備試驗菌液為了排除抑菌作用由AMP引起的可能性，應(yīng)使用帶質(zhì)粒的SOLR菌；將菌液培養(yǎng)到OD值為0.5左右時放置于4"C保存。c、制備濾紙片取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6mm的小紙片，滅菌烘干備用。d、按照瓊脂1%w/v、蛋白胨1。/。w/v、酵母提取物0.5。/。w/v、氯化鈉0.05%w/v配置瓊脂糖培養(yǎng)基，將pH調(diào)至7.0后滅菌，倒板等其冷卻后，取用LB液體培養(yǎng)基稀釋100倍的上述試驗菌液200微升均勻涂板，等菌液吸收10分鐘后將三層濾紙片放置于培養(yǎng)基上。放三層紙片可以增大加樣量。然后將合成肽溶液5微升加在濾紙片上，用卡那霉素做陽性對照，正面向上吸收完全后倒置培養(yǎng)過夜。觀察抑菌圈(參見圖3)，測其大小。觀察抑菌圈實驗的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)濾紙周圍沒有細菌生長，因此呈現(xiàn)出明亮的抑菌圈。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。序列表SEQIDNO:1ggg33C3333sgctggsgctccsccgcggtggcggccgctctsgnsctsgtggstccccc60gggctgc3gg3sttcggcscgsggccgsacasttgtstcctccggttggctctcttgtgt120ggstactteitataLtststataitatsccgstctcgstaccggtcassgtttttttttttgt180tttcgtttcg33cttsctgtgscai35ittccgttgctgaei33a1ga3g3333gssgstscst240catggctcacggaacaacccttgcgcttgtaatttgcgctactatcgcttgcagcttcgc300cstsgasttgcccgscttcstccscgtctgc33gcgt33cgatcctcsgstcgsgtcgtg360catcaaaaagagtgtcgaagatctacgaccaaaactgatgacaggtgtccccgaatacaa420tstcccatcgttgg33cc3cttctgttgsagg33ctggt3gcsgctgssggtgccggtgg480actcaagatcacggccaaggatgtccatgcctacggtgccagtgactttgttgttcagas540gctcsgsgtcgscgtttcgc3gctgcgtttcgccctggscaitcctcctscctcscctgta600catcgagggtcagtacgagatcgatggacgtgtcctcctgctgccastccgtggtsacgg660cccaatgaccggtaacttcaccgatgcgactggttcggtcaagatccaggcaactttgtt720caaggatgaccagggcaacgatcacctcaagctcagcgagttccgcatgcgtatttccat780ccgtaaaggttctctcaaattggacaaccttttcggtggtgscccaacccttgggcaatg840ttgtcai3C3￡icgcc3tc33csccssctttgscgcttttstc33gg33cttcsscctctts900tcgag33ggctttgt915SEQIDNO:2MetArglieSerlieArgLysGlySerLeuLysLeuAspAsnLeuPheGlyGlyAspPjroThrLeuGlyGinCysCcyGinGinArgHis202530GinHisGin!Leu權(quán)利要求1、一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼的核酸序列，其特征在于所分離出的DNA分子包括編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的多肽核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQIDNO1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列雜交。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3編碼的核酸序列，其特征在于該序列具有SEQIDNO:l中第767-871位的核苷酸序列。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3編碼的核酸序列，其特征在于該序列中包含8106個連續(xù)核苷酸。4、一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp—AP3，其特征在于具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp—AP3，其特征在于所述蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽為多肽、其保守性變異多肽、其活性片段或其活性衍生物。全文摘要本發(fā)明公開了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼的核酸序列，所分離出的DNA分子包括編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的多肽核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQIDNO1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者該核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQIDNO1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明還同時公開了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp-AP3，其具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3具有抗菌性能。文檔編號C07K14/435GK101328481SQ20081012014公開日2008年12月24日申請日期2008年7月24日優(yōu)先權(quán)日2008年7月24日發(fā)明者葉恭銀,慎小晶,成雄鷹,萃胡申請人:浙江大學