一種抗菌蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種抗菌蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 消毒是指殺死病原微生物、但不一定能殺死細(xì)菌芽孢的方法。用于消毒的物質(zhì)叫 做消毒劑。而消毒液顧名思義就是液體的消毒劑。理想的消毒劑應(yīng)具備殺菌譜廣、殺菌能 力強(qiáng)、作用速度快、穩(wěn)定性好、無毒、無殘留、無腐蝕性、無刺激性、易溶于水、對人和動物安 全及價(jià)廉易得、對環(huán)境污染程度低等特點(diǎn)。
[0003]目前消毒液產(chǎn)品主要分為環(huán)境消毒類、常規(guī)手腳消毒液和創(chuàng)傷消毒液。環(huán)境消毒 類消毒液是指主要應(yīng)用于衛(wèi)生防疫和災(zāi)區(qū)的常規(guī)消毒殺菌、游泳池、賓館、飯店、家庭、學(xué) 校、醫(yī)院等公共場所消毒的產(chǎn)品，包括84消毒液、過氧乙酸、來蘇水等。常規(guī)手腳消毒液是 指主要用于手腳皮膚的產(chǎn)品，包括醋酸氯己定、乙醇為等。而創(chuàng)傷消毒液類主要應(yīng)用于醫(yī)院 內(nèi)手術(shù)或外傷，燒傷以及各種潰瘍的創(chuàng)口消毒，以及個(gè)人常規(guī)的外傷或潰瘍消毒處理，包括 紫藥水、雙氧水、酒精等。
[0004]目前，傳統(tǒng)的創(chuàng)傷消毒液在實(shí)際應(yīng)用中有許多缺點(diǎn)，比如紫藥水，即2%的甲紫溶 液，此溶液有加快傷口結(jié)痂和愈合的作用，常用于淺表皮膚、黏膜感染，但因該溶液刺激較 大，不宜用在黏膜或開放創(chuàng)面，尤其是大創(chuàng)面，而且可誘發(fā)皮膚癌；雙氧水，即過氧化氫，具 有消毒殺菌作用，但濃度過大時(shí)易灼傷患處皮膚，且性質(zhì)不穩(wěn)定，存放時(shí)間不長，易失效； 75%酒精可以有效去除細(xì)菌，預(yù)防傷口感染，但酒精有破壞細(xì)胞和較強(qiáng)的刺激性，故不能用 于傷口內(nèi)、破潰部位以及眼、鼻、口、陰道等部位粘膜的消毒，另外，酒精貯藏的容器應(yīng)嚴(yán)密， 用后瓶口應(yīng)塞緊，防止揮發(fā)造成含量下降影響殺菌效力。
[0005] 由此可見，傳統(tǒng)的創(chuàng)傷消毒液往往對傷口或患處有刺激作用。對于化學(xué)品消毒劑 還存在著化學(xué)殘留的問題，而對于植物提取的消毒液，存在著原料的質(zhì)量不能保證一致，并 且在提取過程中應(yīng)用了化學(xué)溶劑，也存在著一定的化學(xué)殘留的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供了一種對人體無刺激性并且抑菌效果 好的抗菌蛋白，用于創(chuàng)傷消毒。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 一種抗菌蛋白，具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0009] 在一些實(shí)施方案中，所述的抗菌蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0010] 本發(fā)明還提供了編碼所述的抗菌蛋白的DNA分子。
[0011] 其中，在一些實(shí)施方案中，編碼SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的DNA分子，其核苷 酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示抗菌蛋白的制備方法，將編 碼SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的DNA分子重組到表達(dá)載體pMAL-p2x，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并進(jìn) 行表達(dá)、提取、純化。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，所述重組為獲取兩端帶有酶切位點(diǎn)的編碼SEQ ID NO: 1所示 的氨基酸序列的DNA分子，將其插入到表達(dá)載體pMAL-p2x的酶切位點(diǎn)之間并測序鑒定。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，所述酶切位點(diǎn)為EcoRI和Hindlll。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，所述大腸桿菌表達(dá)菌株為BL21 (DE3 ) pLysS。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，所述提取包括細(xì)菌收集、破碎，離心取上清。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，所述純化為親和層析純化及離子交換純化。
[0018] 本發(fā)明提供了一種對人體無刺激性并且抑菌效果好的抗菌蛋白LYS-ABP，具有如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。同時(shí)提供了在LYS-ABP蛋白N末端添加有MBP的融合目 的蛋白，即抗菌蛋白MBP-LYS-ABP，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明所述抗菌蛋 白LYS-ABP和抗菌蛋白MBP-LYS-ABP對人體無刺激性并且抑菌效果好，抑菌效果明顯優(yōu)于 單獨(dú)的溶菌酶和抗菌肽蛋白，生物活性穩(wěn)定性好。本發(fā)明還提供了所述抗菌蛋白LYS-ABP 和抗菌蛋白MBP-LYS-ABP的制備方法。本發(fā)明所述抗菌蛋白MBP-LYS-ABP通過體外重組表 達(dá)獲得，易于制備，成本較低，同時(shí)抗菌蛋白MBP-LYS-ABP可溶性表達(dá)產(chǎn)量高，適于抗菌蛋 白MBP-LYS-ABP的大量制備。本發(fā)明所述抗菌蛋白LYS-ABP通過凝血酶對重組表達(dá)制備的 MBP-LYS-ABP融合蛋白進(jìn)行酶切得到，易于制備，成本較低，適于抗菌蛋白LYS-ABP的大量 制備。
【附圖說明】
[0019] 圖1為實(shí)施例4目的蛋白的商效表達(dá)，其中；泳道A為空菌對照；泳道B為 MBP-LYS-ABP融合蛋白；泳道C為分子量Marker，從上到下分別為97. 4kD、66. 2kD、43kD、 31kD、20. lkD ;箭頭所指目標(biāo)蛋白為抗菌蛋白MBP-LYS-ABP。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明公開了一種抗菌蛋白，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝 參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見 的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人 員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組 合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0021] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0022] 溶菌酶（lysozyme,LYS)又稱胞壁質(zhì)酶（muramidase)或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解 酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。溶菌 酶主要通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的0 -1，4糖苷鍵，使細(xì) 胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解，從而達(dá) 到殺死細(xì)菌的目的。溶菌酶還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白 形成復(fù)鹽，使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，且無毒、無副作用。
[0023] 抗菌肽（antimicrobial peptide, ABP)是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物 活性的小分子多肽，分子量在2000~7000左右，由20~60個(gè)氨基酸殘基組成，抗菌肽的 抗菌作用機(jī)理是抗菌肽分子可以在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜上穿孔而形成離子孔道，造成細(xì)菌細(xì)胞膜 結(jié)構(gòu)破壞，引起胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出，而最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡?？咕木哂袕?qiáng)堿性、熱穩(wěn) 定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)。抗菌肽對細(xì)菌，尤其是對某些耐藥性病原菌有很強(qiáng)的殺傷作用。 此外，某些抗菌肽對部分病毒、真菌、原蟲和癌細(xì)胞等有殺滅作用，甚至能提高免疫力、加速 傷口愈合過程。
[0024] 溶菌酶可以從蛋清中提取而大量得到，但這種方法存在著原材料質(zhì)量不易控制， 有潛在病菌污染的危險(xiǎn)。抗菌肽可以從果蠅中提取得到，但這種方法原材料的來源不易控 制，提取得到的抗菌肽產(chǎn)量低，活性差，質(zhì)量不穩(wěn)定也不易控制。此外，溶菌酶和抗菌肽生物 穩(wěn)定性很差，室溫放置幾天活性就下降至原來的50%以下，因此，溶菌酶或抗菌肽無法單獨(dú) 作為創(chuàng)傷消毒劑使用。
[0025] 本發(fā)明通過基因工程技術(shù)將溶菌酶與抗菌肽融合得到一種抗菌蛋白LYS-ABP，其 具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。本發(fā)明所述抗菌蛋白LYS-ABP既具有溶菌酶破壞 細(xì)胞壁功能又具有抗菌肽破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的功能，同時(shí)溶菌酶與抗菌肽產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)大大 增強(qiáng)了抗菌蛋白的殺菌效果。本發(fā)明所述抗菌蛋白LYS-ABP具有殺菌譜廣、殺菌效果好、種 屬特異性高，無刺激性的特點(diǎn)，從而達(dá)到對人體無刺激性并且抑菌效果好的目的，適合用于 創(chuàng)傷消毒。
[0026] 由于抗菌肽和溶菌酶的分子量較小，直接進(jìn)行表達(dá)存在著表達(dá)量很低、極易形成 包涵體的問題，從而提高了純化的難度，增加了生產(chǎn)成本。本發(fā)明進(jìn)一步通過基因工程技 術(shù)將上述抗菌蛋白與伴侶蛋白進(jìn)行融合得到一種溶菌酶、抗菌肽與伴侶蛋白融合的抗菌蛋 白。
[0027] 伴侶蛋白（c