針對(duì)活化蛋白C (aPC)的單克隆抗體的制作方法
【專利說明】針對(duì)活化蛋白C(aPC)的單克隆抗體
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年11月29日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/731，294和2013 年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/786, 472的優(yōu)先權(quán)，它們的公開內(nèi)容因此以其 整體作為參考并入本文。 序列表提交 與本申請(qǐng)相關(guān)的序列表以電子形式通過EFS-Web提交，并因此以其整體作為參考并入 說明書。
[0002] 實(shí)施方式領(lǐng)域 提供了分離的單克隆抗體和其片段，其優(yōu)先結(jié)合人蛋白C的活化形式（aPC)。
[0003] 背景 人蛋白C (PC)酶原在肝中作為461個(gè)氨基酸殘基前體合成并分泌到血液中（如SEQ ID NO: 1中所示）。在分泌之前，單鏈多肽前體通過除去二肽（Lysl56-Argl57)和42個(gè) 氨基酸殘基前原前導(dǎo)序列（preproleader)轉(zhuǎn)化成異二聚體。異二聚體形式（417個(gè)殘基） 由通過二硫橋連接的輕鏈（155aa，21 kDa)和重鏈（262aa，41 kDa)組成（如SEQ ID NO: 2中所示）。PC酶原包含凝血酶切割位點(diǎn)，導(dǎo)致"活化肽"的去除和PC活化成活化的 PC (aPC)形式（405個(gè)殘基），其顯示于SEQ ID NO: 3中。圖1提供人PC及其活化形式 aPC的卡通描繪。人PC包含9個(gè)Gla-殘基和4個(gè)用于N-聯(lián)糖基化的潛在的位點(diǎn)。輕鏈 包含Gla結(jié)構(gòu)域和2個(gè)EGF-樣結(jié)構(gòu)域。重鏈帶有活性絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。
[0004] PC通常以3_5ug/ml (~65nM)在健康人血液中循環(huán)且其半衰期為6-8小時(shí)。循環(huán) 型PC酶原的主要形式是異二聚體形式。PC的輕鏈含有一個(gè)富含Y-羧基谷氨酸（Gla)的 結(jié)構(gòu)域（45aa)、兩個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域（46aa)和接頭序列。PC的重鏈帶有12-aa的高度極性 "活化肽"以及具有典型的絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體的催化結(jié)構(gòu)域。
[0005] 人PC經(jīng)歷廣泛的翻譯后修飾，包括糖基化，維生素K依賴性Y _羧基化和丫 _羥 基化（1-2)。它含有23%的碳水化合物（以重量計(jì))和4個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)(一個(gè)在 輕鏈Asn97和三個(gè)在重鏈Asn248/313/329)。 其Gla結(jié)構(gòu)域含有9個(gè)Gla殘基并負(fù)責(zé)PC 鈣依賴性結(jié)合至帶負(fù)電磷脂膜。Gla結(jié)構(gòu)域也可結(jié)合內(nèi)皮蛋白C受體（EPCR)，其在PC活 化期間與內(nèi)皮膜上的凝血酶以及凝血調(diào)節(jié)蛋白密切合作。
[0006] 蛋白C酶原通常轉(zhuǎn)化為它的活性酶-活化蛋白C(aPC)以具有生物效力。PC途 徑的活性是由PC活化以及aPC失活的比率所控制。PC活化以兩步驟過程發(fā)生在內(nèi)皮細(xì)胞 表面上。其需要PC結(jié)合（經(jīng)由Gla結(jié)構(gòu)域）至內(nèi)皮細(xì)胞上的EPCR，然后是PC通過凝血酶 /凝血調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物的蛋白水解活化。由內(nèi)皮細(xì)胞表面上的凝血酶/凝血調(diào)節(jié)蛋白催化 的在人PC重鏈Argl2處的單一切割釋放12-aa的AP并且將酶原PC轉(zhuǎn)化成活性絲氨酸蛋 白酶aPC。因此，PC和的aPC的氨基酸序列之間的主要區(qū)別是PC中存在12-aa活化肽，而 在APC中不存在。PC活化成aPC也誘導(dǎo)構(gòu)象變化；因此只有aPC而不是PC可在其酶活性 位點(diǎn)中被苯甲脒或以氯甲基酮（CMK)肽抑制劑標(biāo)記。近來已解析無Gla-結(jié)構(gòu)域aPC在與 CMK-抑制劑的復(fù)合物中的晶體結(jié)構(gòu)。人血漿中的主要aPC滅活劑為以IOOnM存在于人血漿 中的蛋白C抑制劑（PCI)，其為絲氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族的成員。在生理?xiàng)l件下，aPC 以極低濃度（l-2ng/ml或40pM)循環(huán)于人血液中，半衰期為20-30min。
[0007] 蛋白C途徑充當(dāng)對(duì)抗血栓的天然防御機(jī)制。其不同于其它抗凝劑，因?yàn)樗且环N 按需系統(tǒng)（〇n-demand system)，當(dāng)凝血反應(yīng)增強(qiáng)時(shí)其能夠放大抗凝反應(yīng)。在受傷之后，產(chǎn)生 凝血酶用于凝血。同時(shí)，凝血酶也通過結(jié)合至排列在血管表面上的凝血調(diào)節(jié)蛋白而觸發(fā)抗 凝反應(yīng)，這促使蛋白C活化。因此，aPC生成大體上與凝血酶濃度以及PC水平成比例。
[0008] 蛋白C途徑作為凝血過程的主要調(diào)解者的生理學(xué)重要性通過三個(gè)臨床發(fā)現(xiàn)顯 示：（a)與蛋白C缺乏相關(guān)的嚴(yán)重血栓并發(fā)癥以及通過蛋白C補(bǔ)充糾正該缺陷的能力； (b)與蛋白C輔因子（蛋白S)缺乏相關(guān)的家族性血栓形成傾向；以及（c)與在其底物 (因子V Leidei R506Q)中的遺傳性突變有關(guān)的血栓風(fēng)險(xiǎn)，使其對(duì)于被aPC切割具有抗性 (Bernard, GR et.al. N Engl J Med 2001,344:699-709 綜述）〇
[0009] 相對(duì)于其它維生素K依賴性凝血因子，aPC作為抗凝劑通過兩種凝血輔因子-因 子Va以及VIIIa的蛋白水解失活來發(fā)揮作用，從而抑制凝血酶生成。作為降低的凝血酶水 平的結(jié)果，由凝血酶誘導(dǎo)的炎癥、促凝血以及抗纖維蛋白溶解反應(yīng)降低。aPC也通過與纖溶 酶原活化因子抑制劑（PAI)形成復(fù)合物而直接促成增強(qiáng)的纖維蛋白溶解反應(yīng)。
[0010] 除了其抗凝功能以外，aPC也引起細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，包括抗炎癥以及抗凋亡活性，以 及內(nèi)皮屏障功能的保護(hù)。aPC對(duì)細(xì)胞的這些直接細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)需要EPCR以及G蛋白偶聯(lián)受 體，蛋白酶活化受體-l(PAR-l)。因此，aPC促進(jìn)纖維蛋白溶解作用并抑制血栓與炎癥。aPC 的抗凝以及細(xì)胞保護(hù)功能似乎是可分開的。大多數(shù)的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)主要與aPC的抗凝活性 無關(guān)，且已生成帶有最小抗凝活性以及正常細(xì)胞保護(hù)活性的aPC突變體。同樣地，也已報(bào)導(dǎo) 高抗凝但非細(xì)胞保護(hù)性aPC突變體。
[0011] aPC輕鏈的C端也是高度帶電區(qū)域，其在蛋白酶結(jié)構(gòu)域中的活性位點(diǎn)的相反側(cè)上 含有殘基Glyl42-Leul55。E149A-aPC具有與野生型aPC不可區(qū)別的酰胺分解活性，但于活 化部分凝血活酶時(shí)間（aPTT)凝血分析中因?yàn)閷?duì)蛋白S輔因子活性的敏感性增加而在抗凝 活性方面增加超過3倍。E149A-aPC顯示在血漿凝血分析中有高活性的抗凝活性以及在體 內(nèi)有高活性的抗血栓效力。該突變體在LPS誘發(fā)的致死內(nèi)毒素血癥鼠模型中也具有降低的 細(xì)胞保護(hù)以及死亡率降低活性。這暗示，需要aPC的細(xì)胞保護(hù)活性來降低鼠模型中的死亡 率。與之相比，aPC的抗凝活性對(duì)于死亡率降低既非必要也非足夠。aPC已用于治療敗血 癥，一種危及生命的與高凝血性以及綜合性炎癥反應(yīng)相關(guān)的狀況。在敗血癥中，aPC療法的 嚴(yán)重副作用為在2%患者中所發(fā)生的大出血。這一嚴(yán)重的副作用限制其臨床使用。
[0012] 概述 提供針對(duì)人活化蛋白C (aPC)的單克隆抗體。在至少一個(gè)實(shí)施方式中，該抗-aPC單克 隆抗體對(duì)aPC的酶原蛋白C表現(xiàn)最小結(jié)合。
[0013] 在一些實(shí)施方式中，所提供針對(duì)aPC的單克隆抗體已被最佳化，例如增加親和力、 增加功能活性或降低來自種系序列的差異。
[0014] 也提供分離的單克隆抗體所結(jié)合的人aPC上的特異性表位。進(jìn)一步提供編碼該特 異性表位的分離的核酸分子。
[0015] 也提供包含抗-aPC單克隆抗體的藥物組合物以及治療遺傳性與后天性凝血缺乏 或缺陷諸如A型及B型血友病的方法。也提供通過將抗-aPC單克隆抗體施用給有需要的 患者而縮短出血時(shí)間的方法。也提供生產(chǎn)結(jié)合人aPC的單克隆抗體的方法。
[0016] 附圖簡(jiǎn)述 技術(shù)人員將理解，下述圖僅供說明目的。附圖不意欲以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。
[0017] 圖1顯示人活化蛋白C以其成熟異二聚體形式的卡通圖。
[0018] 圖2顯示，重鏈以及輕鏈⑶R的氨基酸序列比對(duì)在由人Fab抗體庫所鑒定的10個(gè) 抗-aPC Fab中顯示。
[0019] 圖3描繪通過直接ELISA表征抗-APC Fab的圖。ELISA板以每孔IOOng包被 人PC (hPC)、人aPC (hAPC)、犬a(chǎn)PC (dAPC)、小鼠aPC (mAPC)。在X軸上標(biāo)出的經(jīng)純化Fab以 20nM(lug/ml)被添加至板。通過二次抗體（抗-人Fab-HRP)、繼而HRP底物AmplexRed來 檢測(cè)結(jié)合的Fab。經(jīng)純化Fab優(yōu)先結(jié)合至人aPC，并且除了 Fab R41C17以外顯示較少至不 結(jié)合人PC。一個(gè)Fab T46J23也顯示與小鼠aPC的一些結(jié)合。
[0020] 圖4顯示利用ELISA的抗-PC Fab的結(jié)合選擇性。
[0021] 圖5描繪顯示利用aPTT通過在人aPC中跟蹤標(biāo)定（spiking)而以劑量依賴性方 式抑制正常人血漿血塊形成的圖。50%混合的人正常血漿在52秒內(nèi)形成血塊。100、200、 400、800或1600ng/ml的人aPC與血漿的預(yù)溫育以劑量依賴性方式延長(zhǎng)凝血時(shí)間。觀察到 重組人aPC (rh-APC)以及血漿衍生人aPC (pdh-APC)有近乎相同的效力。
[0022] 圖6描繪顯示在人正常血漿中抗-aPC Fab抑制人aPC并且引起血塊形成的圖。 400ng/ml的人aPC將血漿凝血時(shí)間從52秒延長(zhǎng)至180秒。0、0? 5、1、2、5、10或20ug/ml的 對(duì)照抗體（對(duì)照）或其Fab (對(duì)照-Fab)或選定Fab與aPC的溫育以劑量依賴性方式降低 凝血時(shí)間（上圖）。也在40ug/ml測(cè)試三種Fab(R41E3、C22J13、對(duì)照-Fab)尋求更高效應(yīng) (下圖）。
[0023] 圖7顯示在aPTT中抗-aPC Fab抑制犬a(chǎn)PC并且引起血塊形成。
[0024] 圖8顯示抗-aPC Fab對(duì)于aPC的酰胺分解活性的影響。人aPC蛋白（20nM)首 先與等體積抗-aPC Fab(l-3000nM)在室溫預(yù)溫育20分鐘，然后將最多ImM的顯色底物 SPECTROZYME PCa添加至反應(yīng)混合物。在Fab存在下測(cè)量最終濃度為IOnM的人aPC的酰胺 分解活性。水解率在Fab存在下受到抑制，達(dá)到80%的最大降低。
[0025] 圖9顯示抗-aPC Fab對(duì)于aPC的因子Va (FVa)失活活性的影響。
[0026] 圖10顯示利用ELISA抗-aPC人IGl的結(jié)合特異性并顯示抗-aPC人IgGl的物種 交叉反應(yīng)性。ELISA板以lug/ml包被人PC(hPC)、人aPC(hAPC)、犬a(chǎn)PC、小鼠aPC、兔aPC。 將純化IgG (20nM)添加至板。通過二次抗體（抗-人IgG-HRP)、繼而為HRP底物AmplexRed 來檢測(cè)結(jié)合的IgG。五個(gè)抗-aPC人IgGl與犬和兔aPC交叉反應(yīng)而一個(gè)IgGl也結(jié)合小鼠 aPC〇
[0027] 圖11顯示抗-aPC IgG對(duì)于物種aPC的酰胺分解活性的影響-(a)人、（b)兔、（c) 犬與（d)小鼠。a