專利名稱：從人干細(xì)胞中分離高活性干細(xì)胞的方法及由此分離的高活性細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從人干細(xì)胞中分離高活性干細(xì)胞的方法、由該方法分離得到的干細(xì)胞 以及含有該干細(xì)胞的細(xì)胞治療劑和特定的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞能夠分化成構(gòu)成有機(jī)體組織的各種細(xì)胞，其通常指從胚胎、胎兒和成人組 織中獲得的未分化細(xì)胞。干細(xì)胞因特定的分化刺激(環(huán)境)而分化為特定的細(xì)胞；與已經(jīng) 停止細(xì)胞分裂的分化細(xì)胞不同，干細(xì)胞能夠通過(guò)細(xì)胞分裂(自我更新)產(chǎn)生相同的細(xì)胞進(jìn) 行增殖(擴(kuò)增)；其特點(diǎn)是分化的可塑性，即它們能在不同的環(huán)境或分化刺激下可分化為其 他細(xì)胞。干細(xì)胞主要分為胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)和多能性多能成體干細(xì)胞；胚胎干細(xì)胞從 胚胎中獲得，其屬于多能干細(xì)胞，能夠分化為所有類型的細(xì)胞；多能性多能成體干細(xì)胞從組 織中獲得。胚胎發(fā)育早期胚囊期的內(nèi)細(xì)胞群將來(lái)發(fā)育為胎兒，而從內(nèi)細(xì)胞群中分離出的胚 胎干細(xì)胞理論上具有全能性，能夠分化為構(gòu)成有機(jī)體的每一種組織的細(xì)胞。也就是說(shuō)，與成 體干細(xì)胞不同，胚胎干細(xì)胞是未分化的細(xì)胞，其能夠無(wú)限增殖，可分化為所有細(xì)胞種類，而 且可通過(guò)形成生殖細(xì)胞而遺傳給下一代。人胚胎干細(xì)胞是通過(guò)分離和培養(yǎng)人胚囊的內(nèi)細(xì)胞群而制備，全世界所有人胚胎 干細(xì)胞的制備都源自經(jīng)無(wú)菌處理后冷凍保存的胚胎。由于其具備可分化為所有細(xì)胞的多 能性，這類細(xì)胞的特點(diǎn)為其可分化為每一種類型組織的細(xì)胞，而且可通過(guò)形成生殖細(xì)胞 而遺傳給下一代(Thomson 等.，Science，282 1145-1147，1998 ；及 Reubinoff 等，Nat. Biotechnol.，18 :399_404，2000)。使用多能性人胚胎干細(xì)胞作為細(xì)胞治療劑的各種方法仍然均未完全克服如致癌 作用和免疫排斥等問(wèn)題。最近報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用并可成為解決這類問(wèn)題的替代物。間 充質(zhì)干細(xì)胞是多能性細(xì)胞，可分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌 細(xì)胞等，據(jù)報(bào)道其具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用。它們可從多種組織中分離，但是，根據(jù)其來(lái)源 它們的能力和細(xì)胞表面標(biāo)記彼此不同。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞目前確定能夠分化為骨細(xì)胞、軟 骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、螺旋狀細(xì)胞，及SH2 (+)、SH3 (+)、CD34 (-)和CD45 (-)的基本細(xì)胞表面標(biāo)記。細(xì)胞治療或細(xì)胞再生藥物中必需的最小細(xì)胞數(shù)目為約1X109。然而，還需要另外 數(shù)量的細(xì)胞以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定條件和建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。就現(xiàn)有各種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的情 況，獲得這個(gè)細(xì)胞數(shù)量至少需要轉(zhuǎn)代培養(yǎng)10代。那么，這些細(xì)胞就會(huì)老化和改變，如此會(huì)使 得它們不足以用于治療。這是當(dāng)前間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)所涉及的問(wèn)題之一。此外，甚至 當(dāng)使用這些細(xì)胞確定了條件和標(biāo)準(zhǔn)后，在用于治療之前這些細(xì)胞就被耗盡了。這種情況下， 除了使用其他間充質(zhì)干細(xì)胞外，就別無(wú)選擇了，而使用不同的細(xì)胞還需要另外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因 此，人們需要新方法以便有可能使用現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞作為治療劑來(lái)解決上述問(wèn)題。
韓國(guó)專利公開No. 2008-3418教導(dǎo)了一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞成為胰細(xì)胞的方法，韓 國(guó)專利No. 10-593397公開了一種含有間充質(zhì)干細(xì)胞和/或P物質(zhì)的愈傷或促愈傷制劑，或 細(xì)胞治療劑。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的設(shè)計(jì)滿足上述需求，其目的是提供一種制備用于細(xì)胞治療和細(xì)胞 再生藥物的細(xì)胞，該方法克服了以前離體培養(yǎng)擴(kuò)增人干細(xì)胞的局限，保持對(duì)老化細(xì)胞恢復(fù) 活力，應(yīng)用于具有各種遺傳背景的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，其提供用于從人干細(xì)胞中分離高活性干細(xì)胞的方法。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供所述方法分離的高活性干細(xì)胞。此外，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供包含所述干細(xì)胞的細(xì)胞治療劑。再進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供一種用于從人干細(xì)胞中分離高活 性干細(xì)胞的特定培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，由于該方法可用于以前建立的間充質(zhì)干細(xì)胞，以及目前提供的作為 間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的、其他不同條件培養(yǎng)的各種來(lái)源人間充質(zhì)干細(xì)胞，該方法在研制細(xì)胞 治療劑方面非常有用。


結(jié)合附圖分別所示，通過(guò)以下描述，本發(fā)明的上述及其他目的和特征將更加明 顯圖1 該照片顯示由本發(fā)明方法產(chǎn)生的干細(xì)胞球。圖2 對(duì)本發(fā)明方法分離的干細(xì)胞，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選法(FACS)做細(xì)胞周期 測(cè)定，其證實(shí)了表明旺盛增殖的S(合成)期增長(zhǎng)。圖3 本發(fā)明方法分離的干細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌測(cè)定，其顯示IL-6、GM_CSF、VEGF、 HGF、IL-8、IFN-g 和 bGFG 的大幅增長(zhǎng)。圖4 通過(guò)本發(fā)明方法增強(qiáng)干細(xì)胞特性，其顯示0CT-4和E-鈣粘連蛋白作為多能 細(xì)胞標(biāo)記的增長(zhǎng)。圖5 該圖示出本發(fā)明方法的過(guò)程。發(fā)明詳述以下詳述本發(fā)明。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種從人干細(xì)胞中分離高活性干細(xì)胞的方法，其 包括培養(yǎng)人干細(xì)胞以形成干細(xì)胞球。更特別地，該方法包括如下步驟(a)培養(yǎng)人干細(xì)胞以形成干細(xì)胞球；以及(b)將所述干細(xì)胞球與其他未形成球的細(xì)胞分離。在本發(fā)明方法中，步驟(a)可以使用低吸附皮氏培養(yǎng)皿在無(wú)牛血清培養(yǎng)基中實(shí) 施。所述無(wú)牛血清培養(yǎng)基可優(yōu)選含有無(wú)牛血清DMEM(達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基， Dulbecco's Modified Eagle's Medium)和20% SR(血清替代物)。所述低吸附皮氏培養(yǎng) 皿是導(dǎo)致其吸附貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞時(shí)吸附效率小于5%的皮氏培養(yǎng)皿。優(yōu)選地，步驟(a)可通過(guò)用蛋白質(zhì)酶處理人干細(xì)胞和將處理過(guò)的細(xì)胞懸浮于含有 無(wú)牛血清DMEM(達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基)和20% SR的培養(yǎng)基中20 28h來(lái)實(shí)施，優(yōu)選使用低吸附皮氏培養(yǎng)皿培養(yǎng)24h。所述蛋白質(zhì)酶為，但不限于，胰蛋白酶。步驟(b)可通過(guò)使用，但不限于，過(guò)濾器來(lái)將所述干細(xì)胞球與其他未形成球的細(xì) 胞分離。所述干細(xì)胞優(yōu)選為間充質(zhì)干細(xì)胞。本文所用術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”是指主細(xì)胞(master cell)，其可無(wú)限增殖以形成組織和 器官的特化細(xì)胞。干細(xì)胞是多能性或多能細(xì)胞。一個(gè)干細(xì)胞分裂為兩個(gè)子干細(xì)胞，或分裂 為一個(gè)子干細(xì)胞和一個(gè)過(guò)渡細(xì)胞，并不斷增殖成為一個(gè)成熟、完全的組織類型細(xì)胞。本文所用術(shù)語(yǔ)“間充質(zhì)干細(xì)胞”是指其可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和其 他細(xì)胞，特征為其漩渦形狀和其標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞表面標(biāo)記SH2 (+)、SH3 (+)、CD34 (-)和CD45 (-)的 表達(dá)量。本發(fā)明方法包括使用吸附率的皮氏培養(yǎng)皿在無(wú)牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)人干細(xì)胞以 形成干細(xì)胞球。在所述步驟中，所述用于形成干細(xì)胞球的無(wú)牛血清培養(yǎng)基是DMEM標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng) 基和血清替代物(SR)的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，根據(jù)情況多種細(xì)胞因子可以被加 入其中。本發(fā)明方法使用的血清替代物(SR)被用于替代FBS，在人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)中其目 的是去除源自動(dòng)物的因素。在本發(fā)明中，SR用于提供營(yíng)養(yǎng)和懸浮細(xì)胞，而FBS是有助于貼 壁細(xì)胞的吸附率。本發(fā)明還提供由所述方法分離的高活性干細(xì)胞。所述分離的干細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的 細(xì)胞因子分泌，以及增強(qiáng)的干細(xì)胞基因表達(dá)、細(xì)胞存活和細(xì)胞生長(zhǎng)(參見圖2 4)。熒光激活細(xì)胞分選法(FACS)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和實(shí)時(shí)PCT擴(kuò)增證實(shí)，本 發(fā)明方法分離的干細(xì)胞與不同來(lái)源的干細(xì)胞顯示相似的結(jié)果。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供包含有本發(fā)明方法分離的干細(xì)胞的細(xì)胞治療劑。特別地，所述細(xì)胞治療劑可用于產(chǎn)生脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì) 胞、心肌細(xì)胞和其他細(xì)胞。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞治療劑”是指包含經(jīng)分離、培養(yǎng)和特定操作制備的人細(xì)胞 或組織并用于治療、診斷和預(yù)防(美國(guó)FDA指南)的藥物；更特別地，是指任何方法制備的 用于治療、診斷和預(yù)防的藥物，該方法包括在體外對(duì)自體、同源或異源的細(xì)胞進(jìn)行增殖或分 選，或修改細(xì)胞的生物學(xué)特性以恢復(fù)細(xì)胞或組織的功能。根據(jù)其分化水平，細(xì)胞治療劑主要 分為體細(xì)胞治療劑和干細(xì)胞治療劑，而本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞治療劑。本發(fā)明還提供一種含有SR等的、用于從干細(xì)胞中分離高活性干細(xì)胞的培養(yǎng)基。所 述培養(yǎng)基優(yōu)選地可含有無(wú)牛血清DMEM(達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基)和20% SR。所述 干細(xì)胞優(yōu)選為間充質(zhì)干細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述培養(yǎng)基還可含有其他支持性組分以從所述干細(xì)胞 中分離高活性干細(xì)胞。本發(fā)明由下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明。可以理解，這些實(shí)施例輔以圖示的方式展示的 僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并非旨在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例干細(xì)胞球的形成將離體培養(yǎng)維持的人干細(xì)胞用蛋白質(zhì)酶(0.25%胰蛋白酶/EDTA)處理，并懸浮 于使用低吸附皮氏培養(yǎng)皿(SPL)、含有無(wú)牛血清DMEM(達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基)和 20% SR(GIBCO)的培養(yǎng)基中 24h。干細(xì)胞球的分離使用過(guò)濾器將通過(guò)懸浮所述細(xì)胞24h形成的干細(xì)胞球與其他未形成球的干細(xì)胞 分離。分離細(xì)胞的特件測(cè)定1)用實(shí)時(shí)PCT擴(kuò)增進(jìn)行基因表達(dá)量測(cè)定從分離細(xì)胞的總RNA合成了 cDNA，使用與干細(xì)胞基因相關(guān)的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCT擴(kuò)增。2)通過(guò)抗原_抗體反應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞因子測(cè)定在分離細(xì)胞的培養(yǎng)基中使用抗體測(cè)定各種細(xì)胞因子分泌能力。3)通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選法(FACS)進(jìn)行細(xì)胞周期測(cè)定通過(guò)細(xì)胞核染色確定分離細(xì)胞的細(xì)胞周期。實(shí)施例1 從源自人臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞分離高活件干細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明方法，高活性的間充質(zhì)干細(xì)胞分離自源于人臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞。 將離體培養(yǎng)維持的所述干細(xì)胞用蛋白質(zhì)酶(0. 25%胰蛋白酶/EDTA)處理，并懸浮于使用 低吸附皮氏培養(yǎng)皿(SPL)、含有無(wú)牛血清DMEM(達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基)和20% SR(GIBCO)的培養(yǎng)基中24h。使用過(guò)濾器將通過(guò)懸浮所述細(xì)胞24h形成的干細(xì)胞球與其他 未形成球的干細(xì)胞分離。從分離細(xì)胞的總RNA合成了 cDNA，使用與干細(xì)胞基因相關(guān)的引物 進(jìn)行實(shí)時(shí)PCT擴(kuò)增，測(cè)定與所述干細(xì)胞標(biāo)記相關(guān)的基因表達(dá)的水平。在分離細(xì)胞的培養(yǎng)基 中使用抗體測(cè)定各種細(xì)胞因子分泌能力，并通過(guò)細(xì)胞核染色確定分離細(xì)胞的細(xì)胞周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在干細(xì)胞球形成后與干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的水平增加了，在S(合成) 期與干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的水平也大大增加了。同樣與血管生成和生長(zhǎng)相關(guān)的細(xì)胞因子也 大大增加了。實(shí)施例2 從源自人胚胎干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞分離高活性干細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明方法，高活性的間充質(zhì)干細(xì)胞分離自源于人胚胎干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì) 胞。將離體培養(yǎng)維持的所述干細(xì)胞用蛋白質(zhì)酶(0.25%胰蛋白酶/EDTA)處理，并懸浮于使 用低吸附皮氏培養(yǎng)皿、含有無(wú)牛血清DMEM(達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基)和20% SR的 培養(yǎng)基中24h。使用過(guò)濾器將通過(guò)懸浮所述細(xì)胞24h形成的干細(xì)胞球與其他未形成球的干 細(xì)胞分離。從分離細(xì)胞的總RNA合成cDNA，使用與干細(xì)胞基因相關(guān)的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCT擴(kuò) 增，測(cè)定與所述干細(xì)胞標(biāo)記相關(guān)的基因表達(dá)的水平。在分離細(xì)胞的培養(yǎng)基中使用抗體測(cè)定 各種細(xì)胞因子分泌能力，并通過(guò)細(xì)胞核染色確定分離細(xì)胞的細(xì)胞周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在干細(xì)胞球形成后與干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的水平增加了，在S(合成) 期與干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的水平也大大增加了。同樣與血管生成和生長(zhǎng)相關(guān)的細(xì)胞因子也 大大增加了。盡管本發(fā)明已通過(guò)上述特定實(shí)施方式針進(jìn)行了描述，但應(yīng)能理解，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可對(duì)本發(fā)明做出各種修改和變化，其也應(yīng)落入本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種從人干細(xì)胞中分離高活性干細(xì)胞的方法，其包括步驟(a)培養(yǎng)人干細(xì)胞以形成干細(xì)胞球；以及(b)將所述干細(xì)胞球與其他未形成球的細(xì)胞分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(a)是通過(guò)利用低吸附皮氏培養(yǎng)皿在無(wú)牛血清培 養(yǎng)基中實(shí)施的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述無(wú)牛血清培養(yǎng)基含有無(wú)牛血清的DMEM和 20% SR (血清替代物)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(a)是通過(guò)利用低吸附皮氏培養(yǎng)皿，用蛋白 質(zhì)酶處理人干細(xì)胞及將處理過(guò)的細(xì)胞懸浮于含有無(wú)牛血清的DMEM和20% SR的培養(yǎng)基中 20 28h來(lái)實(shí)施的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
6.通過(guò)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述方法分離的高活性干細(xì)胞。
7.用于產(chǎn)生脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或心肌細(xì)胞的細(xì)胞治療劑， 其包含權(quán)利要求6所述的高活性干細(xì)胞。
8.用于由人干細(xì)胞中分離高活性干細(xì)胞的培養(yǎng)基，其含有無(wú)牛血清的DMEM和20%SR。
全文摘要
本發(fā)明涉及從人干細(xì)胞中分離高活性干細(xì)胞的方法、通過(guò)該方法分離得到的干細(xì)胞、含有該干細(xì)胞的細(xì)胞治療劑，以及用于由含有特定細(xì)胞因子的干細(xì)胞中分離高活性干細(xì)胞的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，該方法可用于從各種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞中分離高活性干細(xì)胞。此外，由于本發(fā)明的方法可應(yīng)用于在不同條件下培養(yǎng)的、各種來(lái)源的干細(xì)胞，其在開發(fā)高活性的細(xì)胞治療劑方面非常有用。基于體外數(shù)次轉(zhuǎn)代培養(yǎng)增加的老化干細(xì)胞可被有效地挑選出來(lái)，因而本發(fā)明的方法可用于活化干細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK102112599SQ200980129793
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月28日
發(fā)明者姜炫在, 李銀珠, 金孝洙 申請(qǐng)人:首爾大學(xué)醫(yī)院