專利名稱：一種干細胞分離液及其用于干細胞分離的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細胞分離和純化的領(lǐng)域，尤其是涉及一種干細胞分離液及其用于干細胞分離的方法。
背景技術(shù)：
美國Thomson和Gearhart兩實驗室于1998年分別報道人體胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES細胞)和胚胎生殖干細胞(Embryonic germ cell，EG細胞)建系成功，啟迪和激起人們對ES細胞及其定向分化的研究的熱情。這一科技成就將成為新近的最具發(fā)展和應(yīng)用前景的研究領(lǐng)域。近年來干細胞的研究使人們看到了新的希望。干細胞是正常人體內(nèi)存在的細胞群體，具有高度自我復(fù)制和高度的分化能力。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)利用干細胞可再生各種組織器官，如肝臟、胰腺、神經(jīng)組織、骨骼、肌腱等。
ES細胞也稱多能干細胞，是從早期哺乳類動物胚胎或原始生殖細胞中分離的具有發(fā)育全能性的細胞系，ES細胞具有自我更新能力和高度增殖以及多向分化的潛能，可以定向誘導(dǎo)分化為幾乎所有種類的細胞，甚至可以形成復(fù)雜的組織和器官，其建系體外擴增，定向誘導(dǎo)分化、調(diào)控機制、細胞性能、組織重構(gòu)等方面的研究將在發(fā)育生物學、細胞及組織的分化、基因功能、藥物開發(fā)、細胞治療和組織細胞替代治療等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，并將成為細胞組織和器官移植的新資源。
ES細胞具有潛在的醫(yī)學研究價值(1)它是基因功能研究的有效手段。ES細胞具有種系傳遞功能，根據(jù)同源基因重組的原理，可利用基因打靶技術(shù)進行遺傳操作，實現(xiàn)動物基因組內(nèi)指定基因的失活或替代，可以研究人體重要基因的功能或在生物體內(nèi)特定部位表達重組的目的基因和蛋白質(zhì)藥物。(2)有可能成為今后細胞替代療法和組織，器官移植的最佳來源，ES細胞定向誘導(dǎo)分化成各種有臨床應(yīng)用價值的組織細胞是目前最受人們關(guān)注的研究熱點。
目前，在干細胞領(lǐng)域研究最多和最清楚的仍是造血干細胞(hematopoieticstem cells，HSC)，HSC在基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究現(xiàn)仍處干細胞的最前沿，并不斷為其它干細胞研究提供理論和實踐的指導(dǎo)和依據(jù)。
干細胞可分為長期亞群和短期亞群，長期亞群具有無限的自我更新能力，在個體中持續(xù)終生，短期亞群自我更新能力有限，如短期HSC的自我更新能力僅維持8周左右；根據(jù)分化功能不同，干細胞分為全能性干細胞、多能性干細胞和單能性干細胞，個體形成中最早的干細胞為全能性干細胞，包括受精卵及胚泡的內(nèi)細胞團。全能性干細胞進一步形成原始的生殖干細胞及體干/祖細胞，并最終分化形成各種組織細胞。
骨髓移植，HSC細胞可以擴增約100倍，盡管用飼養(yǎng)層細胞可以長期培養(yǎng)HSC細胞，但其擴增能力同體內(nèi)相比是不可同日而語。因此，研究人員采用了一系列的方法而促進體外增培養(yǎng)中HSC細胞擴增或獲得永生細胞系，如信號途徑的基因干預(yù)，信號分子，轉(zhuǎn)錄分子等，但其結(jié)果卻不理想，要么擴增不成功，要么導(dǎo)致類白血病的產(chǎn)生。
鑒于干細胞在體外擴增的局限性和成瘤性，目前一般采用原代的干細胞進行臨床試驗。雖然胚胎干細胞更具有全能性，理論上可生成任何組織，容易分化為一些組織如心臟等，但胚胎干細胞誘導(dǎo)分化的細胞和組織若用于病人的細胞和組織替代性治療，相當于異體移植，存在免疫排斥的問題，而且胚胎干細胞能否分化為腫瘤樣的組織，尚是個未知數(shù)。成體干細胞可取自于病人的自身組織如骨髓和外周血等，定向誘導(dǎo)分化后移植回給病人，不存在免疫排斥的問題。因此，成體干細胞在臨床應(yīng)用方面可能有更廣闊的前景。
因來源和分離的原因，現(xiàn)階段臨床應(yīng)用的干細胞主要有成人骨髓間充質(zhì)干細胞和造血干細胞，人外周血干細胞，人胚胎來源的干細胞和臍帶血造血干細胞及胎盤或臍帶間充質(zhì)干細胞。按HSC來源分為骨髓移植(BMT)、外周血造血干細胞移植(PBSCT)、臍帶血干細胞移植、純化的CD34+細胞移植、胎肝HSCT。按免疫遺傳學分為異基因干細胞移植、同基因干細胞移植、自體干細胞移植。
目前，分離干細胞的方法主要有以下四種一、貼壁分離法。該法主要利用干細胞具有在塑料培養(yǎng)瓶中貼壁生長的特性將干細胞與其它細胞相分離，這種分離方法分離細胞有限，且干細胞極易分化，因而影響其臨床應(yīng)用價值。而且，分離得到的貼壁細胞中除了有干細胞外，同時含有貼壁的成纖維細胞，從形態(tài)上二者相似不易區(qū)分。
二、流式細胞分選法。該法是根據(jù)干細胞體積小、相對缺少顆粒的特性對其加以分離。
三、免疫磁珠法。該法是根據(jù)免疫學原理，利用包備有抗體的磁珠與干細胞表面的一些特殊標志如CD34特異結(jié)合，通過一定強度磁場時被滯留而分選。
采用流式細胞分選法或免疫磁珠法分離得到的干細胞純度較大，但所獲細胞數(shù)量極少，且易造成細胞損傷，細胞存活率極低。
四、密度梯度離心法。該法是根據(jù)干細胞與其它細胞的密度不同，實驗證明間質(zhì)干細胞位于低密度細胞層。所采用的常用梯度分離液有Percoll和Ficoll，F(xiàn)icoll法或Peroll法可有效地將造血干細胞從骨髓中分離出來，且純度較高，細胞存活好。但是，用Ficoll分離的細胞中?；煊衅渌募毎?如成纖維細胞、骨髓或血液中的非單個核細胞)。
上述方法多用于分離骨髓間質(zhì)干細胞，而目前的實驗表明，用上述方法都無法從人類、鼠胎肝中有效地分離出肝干細胞。
我們在實踐中發(fā)現(xiàn)，用淋巴細胞分離液、Ficoll法或Peroll法無法從人類、鼠胎肝中有效地分離出肝干細胞，經(jīng)提高干細胞分離液的比重，可有效地分離出肝干細胞，并將其用于神經(jīng)干細胞和造血干細胞，也獲得了很好的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種干細胞分離液，可通過調(diào)整該分離液中組分的含量來提高分離液的比重，以達到分離特定的干細胞并提高干細胞數(shù)量和純度的目的。
本發(fā)明所述的一種干細胞分離液，按重量份數(shù)包括以下組分泛影葡胺0-10份，羥甲基纖維素 0-10份，氯化銫0-1.0份，聚蔗糖0-10份；由以下方法制備濃縮液將上述成分混合，加入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液配成所述的干細胞分離液的濃縮液；由以下方法制備工作液將所述的濃縮液用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至所需的比重，比重范圍為1.080-1.120g/ml。
優(yōu)選的，所述的泛影葡胺為3份。
優(yōu)選的，所述的羥甲基纖維素為2份。
優(yōu)選的，所述的氯化銫為0.2份。
優(yōu)選的，所述的聚蔗糖為3份。
本發(fā)明所述的干細胞分離液采用泛影葡胺、羥甲基纖維素、氯化銫、聚蔗糖等能提高分離液比重的成分，可配成成型的干粉或液體，用于實驗室操作或臨床干細胞的試驗研究和臨床應(yīng)用。本發(fā)明所述的干細胞分離液可用于骨髓干細胞、肝干細胞、臍血干細胞、神經(jīng)干細胞及相應(yīng)的人類或動物不同組織干細胞的分離純化。
本發(fā)明的另一目的是提供將所述的干細胞分離液用于干細胞分離的方法，其原理是根據(jù)干細胞與紅細胞、淋巴細胞和成熟組織細胞的比重不同，通過提高干細胞分離液的比重來達到分離干細胞的目的。
本發(fā)明所述的干細胞分離液用于肝干細胞分離的方法，包括以下步驟A)鼠胚肝細胞的制備取12-14日齡的鼠胚，將肝臟剪碎，置0.06％IV型膠原酶溶液中，37℃下振蕩消化30分鐘；B)過濾，在0-4℃下以200r/min離心10分鐘，傾去上清液，用F12培養(yǎng)液懸浮細胞，得細胞懸液；C)按細胞懸液分離液體積比為1∶2的比例將細胞懸液加入到所述的干細胞分離液的最上層，于0-4℃下以1000r/min離心10分鐘；D)吸取第二層細胞，該層為肝干細胞層，用Hanks液洗細胞1-3次；E)0-4℃以1000r/min離心15分鐘，棄上清液；將細胞團沉淀懸浮于培養(yǎng)液中，臺盼藍染色，計算活細胞率；F)用肝干細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)并進行觀察和肝干細胞染色。
本發(fā)明所述的干細胞分離液用于哺乳動物骨髓干細胞分離的方法，包括以下步驟A)骨髓的采集按常規(guī)方法抽取哺乳動物骨髓；B)將骨髓加入磷酸鹽緩沖液PBS中輕勻，按細胞懸液∶分離液體積比為2∶1的比例將細胞懸液加入到所述的干細胞分離液中；
C)常溫離心機中以1500r/min進行密度梯度離心15分鐘；D)小心吸取富含有核細胞的中間細胞層；E)將獲取的單個核細胞加入到含10％小牛血清的高糖DM EM培養(yǎng)基中，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)中，在37℃、5％CO2孵育箱連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
本發(fā)明所述的干細胞分離液用于人骨髓干細胞分離的方法，包括以下步驟A)骨髓的采集采集臨床志愿者髂骨內(nèi)骨髓，按臨床常規(guī)骨髓穿刺操作取得紅骨髓；B)將骨髓加入磷酸鹽緩沖液PBS中輕勻，按細胞懸液∶分離液體積比為2∶1的比例將細胞懸液加入到所述的干細胞分離液中，低溫離心機0-4℃以1500r/min進行密度梯度離心15分鐘；C)小心吸取富含有核細胞的中間細胞層；D)將獲取的單個核細胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)中，在37℃、5％CO2、飽和濕度孵育箱連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
本發(fā)明所述的干細胞分離液用于臍血干細胞分離的方法，包括以下步驟A)按常規(guī)方法抽取健康足月順產(chǎn)新生兒臍帶血，按細胞懸液∶分離液體積比為1∶2的比例將細胞懸液緩慢加入所述的干細胞分離液中；B)常溫離心機20℃以2500r/min離心15分鐘；C)離心管中液體分為四層，吸取血清層和分離層之間的呈白色云霧狀的有核細胞層；D)以磷酸鹽緩沖液PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘；E)棄上清，加入培養(yǎng)基充分吹打混勻制成單細胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶，在37℃、5％CO2、飽和濕度孵箱中連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
與現(xiàn)有的常規(guī)密度梯度離心方法相比，利用本發(fā)明所述的干細胞分離液，對于各種干細胞的分離效果均有明顯的提高，見以下實施例的具體分析。所得的干細胞可用于人類各種干細胞領(lǐng)域的技術(shù)研究和肝病、糖尿病、動脈粥樣硬化及心、腦疾病等各種相關(guān)疾病的治療。


圖1為用淋巴細胞分離液分離所得的細胞，40×10倍(顯微鏡下)；圖2為用干細胞分離液分離所得的細胞，40×10倍(顯微鏡下)。
具體實施例方式
實施例一干細胞分離液的配制一、材料1、泛影葡胺(Sigma)、羥甲基纖維素(Sigma)、氯化銫(Sigma)、聚蔗糖(Ficoll400，phamacia)2、磷酸二氫鉀，氫氧化鈉(廣州化學試劑廠)3、比重計(1.000-1.100、1.100-1.200)二、方法稱取泛影葡胺3g、羥甲基纖維素2g、氯化銫0.2g、聚蔗糖3g。將上述組分依次加入100ml的量筒中，加0.01mol/L磷酸鹽緩沖液至100ml，即得干細胞分離液的濃縮液。用比重計測得其比重為1.123g/ml。
使用時，將上述干細胞分離液的濃縮液用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至所需的比重，即為工作液。
本實施例所用的上述原料，主要以最終比重為限量，至于各種的用于增加比重的添加原料如泛影葡胺、羥甲基纖維素、氯化銫、聚蔗糖等的比例可以不一樣。對各組份的具體比例也不加限定。通常，各組分的用量是一個范圍泛影葡胺0-10份，羥甲基纖維素0-10份，氯化銫0-1.0份，聚蔗糖0-10份。并且，對上述用于增加比重的原料也可不予以限定，還可增加其它原料(如淀粉、聚乙二醇等)用于增加比重。
本實施例所配制的干細胞分離液將用于以下各分離實施例的實驗。
實施例二鼠肝干細胞的分離本實施例利用實施例一所得的干細胞分離液。
一、材料1、孕12-14天的BALB/C小鼠。
2、進口特級胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco)、進口FBS和國產(chǎn)新生小牛血清(newborn calf serum，NCS；由杭州四季青生物工程材料研究所提供)。DM EM/F12(sigma)，非必需氨基酸(×100，Gibco)，人堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，10ug，Gibco)，β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME；Nacalai Tesoue INC Kyota，Japan)，牛血清白蛋白(BSA)，伴白蛋白(Conalbumin，Sigma)。四氯化碳(carbontetrachloride，CCl4)、D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-Galn)。
3、肝干細胞培養(yǎng)基5％FBS(國產(chǎn)或進口)，10％國產(chǎn)NCS，0.14mM的β-ME，40ng.ml-1伴白蛋白，10ng.ml-1的人bFGF，1％非必需氨基酸的DMEM/F12培養(yǎng)基。
4、快藍BB鹽(Fast blue BB salt，Sigma，Lot No 118H5081)和萘酚-AS-MX(Naphthol ASMX phosphate，Sigma，Lot No 20K5227)。
5、C34，OV6等的抗體及免疫組化檢測試劑盒，LSAB免疫組化檢測試劑盒。
6、淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)，比重為1.076g/ml。
二、方法1、鼠胚肝細胞的制備取鼠胚(12-14日齡)，將肝臟剪碎，置0.06％IV型膠原酶溶液中，37℃下振蕩消化30分鐘。
2、過濾。在0-4℃下，以200r/min離心10分鐘。傾去上清液，用F12培養(yǎng)液懸浮細胞。
3、將干細胞分離液濃縮液(實施例一)配成比重為1.120、1.096、1.091、1.086和1.080的肝干細胞離心液(工作液)，將2ml細胞懸液置于4ml肝干細胞分離液的最上層。同時于將2ml細胞懸液置于另一管4ml淋巴細胞分離液(比重為1.076)的最上層。0-4℃下，以1000r/min離心10分鐘。
4、小心吸取第二層細胞，該層為肝干細胞層。用Hanks洗細胞2次。細胞計數(shù)。
5、離心(1000r/min)，棄上清液。將細胞團重懸浮于培養(yǎng)液中，臺盼藍染色，拒染細胞為活細胞，計算活細胞率。
6、將細胞用肝干細胞培養(yǎng)基稀釋，細胞數(shù)為1×105個/ml，用Castar 24孔板進行培養(yǎng)，內(nèi)置蓋玻片，用于堿性磷酸酶和C34、OV6等的免疫組化染色。
三、結(jié)果1、細胞生長情況觀察鼠胚肝細胞在肝干細胞培養(yǎng)液中能貼壁生長，約在第三天能長出干細胞團。肝干細胞集落，細胞小，排列緊密，界限不清，集落呈團狀或鳥巢狀生長。經(jīng)堿性磷酸酶和C34，OV6等的免疫組化染色證實為肝干細胞團。
2、不同比重干細胞分離液所獲細胞數(shù)見表1。
表1不同比重干細胞分離液分離肝細胞所獲細胞數(shù)

結(jié)果顯示，比重為1.120的分離液所獲細胞數(shù)最多，經(jīng)細胞涂片、瑞氏染色和顯微鏡下觀察為淋巴細胞、肝細胞和部分紅細胞。
3、不同比重干細胞分離液所獲細胞在肝干細胞培養(yǎng)基中生成肝干細胞團的數(shù)量見表2。
表2不同比重干細胞分離液所得細胞形成肝干細胞團的數(shù)量

結(jié)果顯示，經(jīng)堿性磷酸酶和C34、OV6等的免疫組化染色證實，比重為1.120的分離液所獲肝干細胞團數(shù)最多。
四、結(jié)論采用比重為1.081-1.120的干細胞分離液均可成功分離胎鼠肝中的肝干細胞，其中，比重為1.120的干細胞分離液的分離效果最好。
實施例三豬骨髓干細胞的分離本實施例利用實施例一所得的干細胞分離液。
一、材料1、設(shè)備超凈工作臺，水平離心機，倒置顯微鏡和普通顯微鏡。離心管和平衡天平，骨髓穿剌針和采血袋。流式細胞儀，干燥箱，手套和手術(shù)衣。
2、試劑泛影葡胺(Sigma公司)，羥甲基纖維素(Sigma公司)，氯化銫(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(均為廣州化學試劑廠)，羅丹明123(Sigma公司)。
3、BD Procount progenitor Cell Enumeration Kit(BD公司，干細胞計數(shù)試劑盒，批號NO.340498)。
4、淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)，比重為1.076g/ml。
5、細胞培養(yǎng)基含10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)。
6、實驗用的試驗豬均為雌性，體重10kg，由廣州市芳村屠宰場提供。
二、方法1、實驗豬進行骨髓抽取手術(shù)，其步驟如下按每公斤實驗豬體重使用30mg/kg量的戊巴比妥鈉，對實驗豬進行腹腔麻醉，對所有手術(shù)器械進行高壓滅菌，手術(shù)間紫外消毒，用電推剪將實驗豬腿部體表的毛發(fā)剪去，用75wt％酒精對實驗豬進行體表消毒，鋪巾，利多卡因局部麻醉后抽取豬髂骨內(nèi)骨髓30ml。
2、骨髓成功抽取后按以下方法分離豬骨髓細胞將骨髓加入到磷酸鹽緩沖液(PBS)中輕勻，常溫離心機中以1500r/min離心15分鐘，棄上清，將沉淀物用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕懸浮，得細胞懸液。
將干細胞分離液濃縮液(實施例一)配成比重為1.080、1.083、1.086、1.089和1.092的肝干細胞離心液(工作液)。
將細胞懸液按2∶1比例緩慢加入上述不同比重的干細胞分離液和淋巴細胞分離液(比重為1.076)中，20℃以2500r/min離心10分鐘。離心管中液體分為四層，小心吸取富含有核細胞的中間細胞層，以PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘。細胞計數(shù)。胎盤藍染色，活細胞計數(shù)。瑞氏染色和有核細胞分析。
3、將獲取的細胞加入到特殊的DMEM培養(yǎng)基中，接種于50mL培養(yǎng)瓶內(nèi)中。在37℃飽和濕度條件下，5％CO2孵育箱中連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
4、用羅丹明拒染實驗鑒定豬骨髓干細胞羅丹明染色步驟如下新鮮分離的細胞以1×106接種在培養(yǎng)板上培養(yǎng)2小時，加入1μg羅丹明123，37℃孵育1小時后，用PBS洗去細胞外羅丹明123，流式細胞儀觀察羅丹明123在細胞內(nèi)的分布情況。
5、用干細胞計數(shù)試劑盒和流式細胞儀鑒定豬骨髓干細胞將新鮮分離的細胞加入Eppendoff管(106細胞/管)，以1500rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘，PBS洗1次，加入冷丙酮1ml，0-4℃固定8分鐘；離心，棄上清后加入一抗(CD34、CD45)，混勻后37℃反應(yīng)45分鐘，1500rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，PBS洗3次，離心棄上清后加入帶二抗標記的IgG，混勻后37℃反應(yīng)30分鐘，PBS洗滌兩次，離心后視沉淀物的量加入PBS，制備成細胞懸液，流式細胞儀進行檢測。
三、結(jié)果1、各種分離液所得細胞經(jīng)胎盤藍染色顯示，細胞存活率均達90％以上，均未顯示對豬骨髓細胞有毒性作用。細胞計數(shù)
計算公式

注本實驗中，每離心管所加骨髓血量為5ml。
經(jīng)計算后細胞計數(shù)結(jié)果如表3所示表3干細胞分離液分離豬骨髓細胞所獲細胞數(shù)

管1為淋巴細胞分離液。
管2-6為本發(fā)明所述的干細胞分離液(配制方法見實施例一)。
結(jié)果顯示比重為1.092的干細胞分離液所得的細胞數(shù)比淋巴細胞分離液的細胞數(shù)多5倍。
2、用瑞氏染色法鑒定，淋巴細胞分離液獲得的細胞主要為淋巴細胞，細胞核較大(如圖1所示)，而用干細胞分離液分離所得細胞主要為干細胞，細胞小，如紅細胞大小，核染色深，胞質(zhì)很少(如圖2所示)。
3、羅丹明123拒染試驗結(jié)果根據(jù)干細胞不主動吸收熒光染料羅丹明123的特點，可用羅丹明123拒染試驗鑒定骨髓血中的干細胞。
用不同比重干細胞分離液分離豬骨髓細胞中羅丹明123拒染細胞的比例見表4。
表4干細胞分離液分離豬骨髓細胞羅丹明123拒染細胞比例


管1為淋巴細胞分離液。
管2-6為本發(fā)明所述的干細胞分離液(配制方法見實施例一)。
結(jié)果顯示用比重為1.092的干細胞分離液所得的羅丹明123拒染細胞比例為5.18％，而淋巴細胞分離液所得細胞羅丹明拒染細胞僅為0.43％。比重為1.092的干細胞分離液所得的羅丹明123拒染細胞數(shù)為淋巴細胞分離液所得細胞羅丹明拒染細胞的12倍。
4、用干細胞標志試劑盒和流式細胞儀鑒定豬骨髓干細胞的結(jié)果干細胞標志試劑盒主要用于鑒定骨髓造血干細胞，其中CD34用于標志造血干細胞，CD45用于標志淋巴細胞，PI主要用于標志有核細胞。
經(jīng)流式細胞儀測定，經(jīng)干細胞分離液所得細胞懸液中CD34、CD45和有核細胞比例見表5。
表5干細胞分離液分離豬骨髓細胞各種標志的細胞比例

管1為淋巴細胞分離液。
管2-3為本發(fā)明所述的干細胞分離液(配制方法見實施例一)。
結(jié)果提示用比重為1.086的干細胞分離液所得的CD34陽性細胞數(shù)比淋巴細胞分離液所得的CD34陽性數(shù)多12倍。
5、細胞經(jīng)培養(yǎng)1-7天，在相差顯微鏡觀察，結(jié)果如下新鮮分離的的骨髓單個核細胞呈圓球狀分散懸浮于培養(yǎng)液中，有少量造血細胞。換液去除非黏附細胞后，留下來的細胞的形態(tài)大多和骨髓基質(zhì)細胞接近，貼壁生長，呈梭形。非黏附細胞經(jīng)離心換液，繼續(xù)培養(yǎng)7天，可見成團細胞生長。其中以干細胞分離液所得的細胞，細胞成團生長活躍。
四、結(jié)論采用本發(fā)明所述的干細胞分離液(比重為1.081-1.092)均可成功分離豬骨髓干細胞。該干細胞分離液所得骨髓細胞數(shù)比淋巴細胞分離液多5倍，而CD34+細胞比例增加13.6倍，兩者相乘，干細胞分離液所得的干細胞數(shù)為淋巴細胞分離液所得干細胞數(shù)的80倍。說明該干細胞分離液能有效地分離和富集骨髓血中的干細胞。
實施例四干細胞分離液對骨髓干細胞分離回收率的影響本實施例測定干細胞分離液對骨髓血中有核細胞回收率。
本實施例利用實施例一所得的干細胞分離液。
一、材料1、設(shè)備超凈工作臺，水平離心機，普通顯微鏡。離心管，骨髓穿剌針和采血袋。
2、試劑泛影葡胺(Sigma公司)，羥甲基纖維素(Sigma公司)，氯化銫(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(均為廣州化學試劑廠)。
3、淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)，比重為1.076g/ml。
4、細胞培養(yǎng)基含10％小牛血清的高糖DM EM培養(yǎng)基(Gibco公司)。
5、實驗用的試驗豬為雌性，體重10kg，由廣州市芳村屠宰場提供。
二、方法1、實驗豬進行骨髓抽取手術(shù)，其步驟如下按每公斤實驗豬體重使用30mg/kg量的戊巴比妥鈉，對實驗豬進行腹腔麻醉，對所有手術(shù)器械進行高壓滅菌，手術(shù)間紫外消毒，用電推剪將實驗豬腿部體表的毛發(fā)剪去，用75wt％酒精對實驗豬進行體表消毒，鋪巾，利多卡因局部麻醉后抽取豬髂骨內(nèi)骨髓30ml。
2、將骨髓血加入到磷酸鹽緩沖液(PBS)中輕勻，常溫離心機中以1500r/min離心1 5分鐘，棄上清，將沉淀物用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕懸浮，細胞懸液按2∶1比例緩慢加入到比重為1.12的干細胞分離液中，20℃以2500r/min離心10分鐘。離心管中液體分為四層，小心吸取富含有核細胞的中間細胞層，以PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘。
3、將沉淀物再用15ml磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕懸浮，細胞計數(shù)。將干細胞分離液濃縮液(實施例一)配成比重為1.080、1.083、1.086、1.089和1.092的肝干細胞離心液(工作液)。將細胞懸液按2∶1比例緩慢加入到上述不同比重的干細胞分離液和淋巴細胞分離液中，每管加細胞懸液2ml，20℃以1500r/min離心10分鐘后，用2mlPBS收集管底細胞，細胞計數(shù)，計算細胞損失率。瑞氏染色和有核細胞分析。
三、結(jié)果1、不同比重干細胞分離液對骨髓有核細胞回收率的影響(表6)回收率＝(懸液細胞數(shù)-管底細胞數(shù))/所加細胞懸液細胞數(shù)×100％表6干細胞分離液對豬骨髓細胞回收率的影響

管1為淋巴細胞分離液管2-6為本發(fā)明所述的干細胞分離液(配制方法見實施例一)2、管底細胞涂片檢查，主要為小核細胞，細胞數(shù)隨干細胞分離液的比重增加而減少，至比重為1.089和1.092的干細胞分離液的管底有核細胞很少見。
四、結(jié)論采用本發(fā)明所述的干細胞分離液可有效地提高骨髓造血干細胞的回收率。
實施例五人骨髓干細胞的分離本實施例利用實施例一所得的干細胞分離液。
一、材料1、設(shè)備超凈工作臺，水平離心機，倒置顯微鏡和普通顯微鏡。離心管和平衡天平，骨髓穿剌針和采血袋。流式細胞儀，干燥箱，手套和手術(shù)衣。
2、試劑泛影葡胺(Sigma公司)，羥甲基纖維素(Sigma公司)，氯化銫(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(均為廣州化學試劑廠)。
3、細胞培養(yǎng)基含10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)。
4、淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)，比重為1.076g/ml。
二、方法1、采集臨床志愿者髂骨內(nèi)骨髓，按臨床常規(guī)骨髓穿刺操作每次取得紅骨髓200ml。
2、將20ml骨髓加入到磷酸鹽緩沖液(PBS)中輕勻，常溫離心機中以1500r/min進行離心15分鐘，棄上清，將沉淀物用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕懸浮，細胞懸液按2∶1比例緩慢加入到比重為1.089的干細胞分離液(配制方法見實施例一)和淋巴細胞分離液中，20℃以2500r/min離心10分鐘。離心管中液體分為四層，小心吸取富含有核細胞的中間細胞層，以PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘。細胞計數(shù)。胎盤藍染色，活細胞計數(shù)。瑞氏染色和有核細胞分析。
3、用羅丹明拒染實驗鑒定骨髓干細胞羅丹明染色步驟如下新鮮分離的細胞以1×106接種在培養(yǎng)板上培養(yǎng)2小時，加入1μg羅丹明123，37℃孵育1小時后，用PBS洗去細胞外羅丹明123，流式細胞儀觀察羅丹明123在細胞內(nèi)的分布情況。
三、結(jié)果1、各種分離液所得細胞經(jīng)胎盤藍染色顯示，細胞存活率均達90％以上，均未顯示對骨髓細胞有毒性作用。細胞計數(shù)計算公式

注本實驗中，每離心管所加骨髓血量為5ml。
經(jīng)計算后細胞計數(shù)結(jié)果如表7所示表7干細胞分離液分離骨髓細胞所獲細胞數(shù)

管1為淋巴細胞分離液。
管2為本發(fā)明所述的干細胞分離液(配制方法見實施例一)。
結(jié)果顯示比重為1.089的干細胞分離液所得的細胞數(shù)比淋巴細胞分離液的細胞數(shù)多6倍。
2、用瑞氏染色法鑒定，淋巴細胞分離液獲得的細胞主要為淋巴細胞，細胞核較大，而用干細胞分離液分離所得細胞主要為干細胞，細胞小，如紅細胞大小，核染色深，胞質(zhì)很少。
3、羅丹明123拒染試驗結(jié)果根據(jù)干細胞不主動吸收熒光染料羅丹明123的特點，可用羅丹明123拒染試驗鑒定骨髓血中的干細胞。
用不同比重干細胞分離液分離骨髓細胞中羅丹明123拒染細胞的比例見表8。
表8骨髓細胞羅丹明123拒染細胞比例

管1為淋巴細胞分離液。
管2為本發(fā)明所述的干細胞分離液(配制方法見實施例一)。
結(jié)果顯示用比重為1.089的干細胞分離液所得的羅丹明123拒染細胞比例為3.62％，而淋巴細胞分離液所得細胞羅丹明拒染細胞僅為0.16％。比重為1.089的干細胞分離液所得的羅丹明123拒染細胞數(shù)為淋巴細胞分離液所得細胞羅丹明拒染細胞的22倍。
四、結(jié)論采用本發(fā)明所述的干細胞分離液(比重為1.089)可成功分離人骨髓干細胞。該干細胞分離液所得骨髓細胞數(shù)比淋巴細胞分離液多6倍，而羅丹明123拒染細胞比例增加20倍，兩者相乘，干細胞分離液所得的干細胞數(shù)為淋巴細胞分離液所得干細胞數(shù)的120倍。說明干細胞分離能有效地分離和富集人骨髓血中的干細胞。
實施例六人的臍血干細胞的分離本實施例利用實施例一所得的干細胞分離液。
一、材料1、設(shè)備超凈工作臺，水平離心機，倒置顯微鏡和普通顯微鏡。離心管和平衡天平，采血袋。
2、試劑泛影葡胺(Sigma公司)，羥甲基纖維素(Sigma公司)，氯化銫(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，phamacia公司)，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(均為廣州化學試劑廠)。
3、淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)，比重為1.076g/ml。
4、細胞培養(yǎng)基含10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)。
二、方法采集健康足月順產(chǎn)新生兒臍帶血20ml。分別緩慢加入20ml淋巴細胞分離液和20ml自制的干細胞分離液(實施例一)之上，每管加10ml。20℃以1500r/min離心15分鐘，離心管中液體分為四層，吸取血清層和分離層之間的白色云霧狀有核細胞層。以PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘，細胞計數(shù)。胎盤藍染色，活細胞計數(shù)。瑞氏染色和有核細胞分析。
三、結(jié)果兩種分離液所得細胞經(jīng)胎盤藍染色顯示，細胞存活率均達90％以上，均未顯示對細胞有毒性作用。細胞計數(shù)計算公式

注本實驗中，每離心管所加骨髓血量為10ml。
經(jīng)計算后細胞計數(shù)結(jié)果如表9所示表9干細胞分離液分離臍帶血所獲細胞數(shù)

管1為淋巴細胞分離液。
管2為本發(fā)明所述的干細胞分離液(配制方法見實施例一)。
四、結(jié)論采用本發(fā)明所述的干細胞分離液(比重為1.083)均可成功分離臍帶血干細胞。該干細胞分離液所得臍帶血有核細胞數(shù)比淋巴細胞分離液多3倍。
權(quán)利要求
1.一種干細胞分離液，其特征在于，按重量份數(shù)包括以下組分泛影葡胺 0-10份，羥甲基纖維素 0-10份，氯化銫0-1.0份，聚蔗糖0-10份；由以下方法制備濃縮液將上述成分混合，加入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液配成所述的干細胞分離液的濃縮液；由以下方法制備工作液將所述的濃縮液用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至所需的比重，比重范圍為1.080-1.120g/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細胞分離液，其特征在于所述的泛影葡胺為3份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細胞分離液，其特征在于所述的羥甲基纖維素為2份。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細胞分離液，其特征在于所述的氯化銫為0.2份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細胞分離液，其特征在于所述的聚蔗糖為3份。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之一所述的干細胞分離液，其特征在于所述的干細胞分離液配成成型的干粉。
7.如權(quán)利要求1所述的干細胞分離液用于肝干細胞分離的方法，其特征在于，包括以下步驟A)鼠胚肝細胞的制備取12-14日齡的鼠胚，將肝臟剪碎，置0.06％IV型膠原酶溶液中，37℃下振蕩消化30分鐘；B)過濾，在0-4℃下以200r/min離心10分鐘，傾去上清液，用F12培養(yǎng)液懸浮細胞，得細胞懸液；C)按細胞懸液∶分離液體積比為1∶2的比例將細胞懸液加入到所述的干細胞分離液的最上層，于0-4℃下以1000r/min離心10分鐘；D)吸取第二層細胞，該層為肝干細胞層，用Hanks液洗細胞1-3次；E)0-4℃以1000r/min離心15分鐘，棄上清液；將細胞團沉淀懸浮于培養(yǎng)液中，臺盼藍染色，計算活細胞率；F)用肝干細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)并進行觀察和肝干細胞染色。
8.如權(quán)利要求1所述的干細胞分離液用于哺乳動物骨髓干細胞分離的方法，其特征在于，包括以下步驟A)骨髓的采集按常規(guī)方法抽取哺乳動物骨髓；B)將骨髓加入磷酸鹽緩沖液PBS中輕勻，按細胞懸液∶分離液體積比為2∶1的比例將細胞懸液加入到所述的干細胞分離液中；C)常溫離心機中以1500r/min進行密度梯度離心15分鐘；D)小心吸取富含有核細胞的中間細胞層；E)將獲取的單個核細胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)中，在37℃、5％CO2孵育箱連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
9.如權(quán)利要求1所述的干細胞分離液用于人骨髓干細胞分離的方法，其特征在于，包括以下步驟A)骨髓的采集采集臨床志愿者髂骨內(nèi)骨髓，按臨床常規(guī)骨髓穿刺操作取得紅骨髓；B)將骨髓加入磷酸鹽緩沖液PBS中輕勻，按細胞懸液∶分離液體積比為2∶1的比例將細胞懸液加入到所述的干細胞分離液中，低溫離心機0-4℃以1500r/min進行密度梯度離心15分鐘；C)小心吸取富含有核細胞的中間細胞層；D)將獲取的單個核細胞加入到合10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)中，在37℃、5％CO2、飽和濕度孵育箱連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
10.如權(quán)利要求1所述的干細胞分離液用于臍血干細胞分離的方法，其特征在于，包括以下步驟A)按常規(guī)方法抽取健康足月順產(chǎn)新生兒臍帶血，按細胞懸液∶分離液體積比為1∶2的比例將細胞懸液緩慢加入所述的干細胞分離液中；B)常溫離心機20℃以2500r/min離心15分鐘；C)離心管中液體分為四層，吸取血清層和分離層之間的呈白色云霧狀的有核細胞層；D)以磷酸鹽緩沖液PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘；E)棄上清，加入培養(yǎng)基充分吹打混勻制成單細胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶，在37℃、5％CO2、飽和濕度孵箱中連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
全文摘要
本發(fā)明涉及干細胞分離和純化的領(lǐng)域，尤其是涉及一種干細胞分離液及其用于干細胞分離的方法。本發(fā)明所述的一種干細胞分離液，按重量份數(shù)包括以下組分泛影葡胺0－10份，羥甲基纖維素0－10份，氯化銫0－1.0份，聚蔗糖0－10份；由以下方法制備濃縮液將上述成分混合，加入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液配成所述的干細胞分離液的濃縮液；由以下方法制備工作液將所述的濃縮液用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至所需的比重，比重范圍為1.080－1.120g/ml。與現(xiàn)有的常規(guī)密度梯度離心方法相比，利用本發(fā)明所述的干細胞分離液，對于各種干細胞的分離效果均有明顯的提高。
文檔編號C12N5/08GK101089176SQ200610035900
公開日2007年12月19日 申請日期2006年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月12日
發(fā)明者鄒清雁, 孔祥平, 鄭業(yè)華, 楊聯(lián)萍, 劉惠平 申請人:中國人民解放軍第四五八醫(yī)院全軍肝病中心