一種同步分離臍血prp、臍血血漿和臍血細(xì)胞的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于細(xì)胞血漿分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同步分離臍血PRP、臍血血漿和 臍血細(xì)胞試劑盒及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 高濃度血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)，是利用血液制作的富含血小板 的高濃度血漿，一般用自體外周血制備。人體的血小板在高濃度狀態(tài)下，能夠產(chǎn)具有細(xì)胞粘 合功能的蛋白質(zhì)(fibrin，中文名稱:纖維連接蛋白、纖粘蛋白），可以促進(jìn)血小板大量分泌 有促進(jìn)傷口、組織愈合及細(xì)胞再生的多種生長因子，所以PRP也叫做富含生長因子血漿 (plasma-rich growth factorsARGFsDlRP具有迅速止血、止痛、加速傷口愈合的作用， 可極大程度減輕術(shù)后疤痕的形成，從上世紀(jì)九十年代中期開始，被廣泛應(yīng)用于各種外科手 術(shù)、心臟手術(shù)以及整形手術(shù)，目前亦廣泛用于醫(yī)學(xué)美容方面。PRP抗衰老修復(fù)的原理，是根據(jù) 生長因子的強(qiáng)大再生力量，促使肌膚新生而成。PRP中主要生長因子成分為① TGF(變形生長 因子）：促進(jìn)血管上皮細(xì)胞修復(fù)再生;②FGF(纖維細(xì)胞生長因子）：激發(fā)新活細(xì)胞，加速組織 修復(fù);③EGF(表皮生長因子）：修復(fù)上皮細(xì)胞，加速血管生長，加快組織修復(fù);④H)GF(血小板 衍生生長因子）：產(chǎn)生膠原蛋白，促進(jìn)血管生長，激活細(xì)胞再生；⑤VEGF(血管內(nèi)皮生長因 子）：強(qiáng)力修復(fù)組織，產(chǎn)生膠原蛋白，激生透明質(zhì)酸。臍血PRP分泌各種因子含量能力更強(qiáng)及 臍血血漿富含的生長因子更強(qiáng)大，同一血型的臍血PRP止血、止痛、加速傷口愈合的作用及 醫(yī)學(xué)美容方面會(huì)慢慢體現(xiàn)。
[0003] 《科學(xué)》雜志公布的2014年年度十大科學(xué)突破第二項(xiàng)為:年輕者的血液修復(fù)年邁者 的健康問題。研究人員證明，來自年輕小鼠的血液，甚或只是來自年輕小鼠血液中的一個(gè)叫 做GDF11的因子，能夠讓較老邁的小鼠的肌肉和大腦"返老還童"，而⑶F11因子是血漿中的 一種成分，此項(xiàng)發(fā)現(xiàn)開啟了阿爾茨海默氏癥患者接受年輕捐贈(zèng)人的血漿等多項(xiàng)臨床試驗(yàn)。 相對(duì)于年輕人血漿，臍血血漿富含更多、更原始的各種因子，治療效果毋庸置疑比年輕人血 漿效果好。近期在細(xì)胞培養(yǎng)上很多用臍血血清代替胎牛血清，并取得非常滿意的效果。臍血 血漿臨床及科研應(yīng)用會(huì)越來越廣，所以在分離臍血細(xì)胞時(shí)高質(zhì)量分離出臍血血漿非常有價(jià) 值。
[0004] 臍血中含有大量的干細(xì)胞，干細(xì)胞是具有自我更新、高度增殖和多項(xiàng)分化潛能的 細(xì)胞群體。這些細(xì)胞可以通過分裂維持自身細(xì)胞的特性和數(shù)量，又可進(jìn)一步分化為各種組 織細(xì)胞，從而在組織修復(fù)等方面發(fā)揮積極作用。隨著科技的發(fā)達(dá)，利用臍帶血中的干細(xì)胞可 治療多種疾病。臍帶血中含有非常豐富的造血干細(xì)胞(HSC)，可以重建人體造血和免疫系 統(tǒng)，可用于造血干細(xì)胞移植，治療血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，以及遺傳代謝性及先天性疾病。因 此，臍血已成為造血干細(xì)胞的重要來源，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于臨床，是寶貴的人類生物資 源。
[0005] 在分離臍血細(xì)胞同時(shí)分離分離出臍血PRP、臍血血漿，具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值， 現(xiàn)有技術(shù)中尚沒有涉及同步分離三種成分的技術(shù)，本試劑盒滿足了同步分離臍血PRP、臍血 血漿和臍血細(xì)胞，填補(bǔ)了技術(shù)上的空白。采用本申請(qǐng)所述的分離試劑盒以及分離方法，不僅 可使臍血PRP中血小板濃度增加一倍多，紅細(xì)胞數(shù)成數(shù)量級(jí)較少;并且分離獲得的臍血血漿 純度高，鏡檢下幾乎沒有紅細(xì)胞、血小板、單個(gè)核細(xì)胞和粒細(xì)胞;再者，分離獲得的臍血細(xì)胞 純度可達(dá)到95%以上，紅細(xì)胞和血小板殘留率小，極大地避免了由于上述組分導(dǎo)致的過敏 風(fēng)險(xiǎn);而且與常規(guī)分離技術(shù)相比，在分離臍血細(xì)胞步驟中降低了一半分離試劑的使用劑量， 有效降低分離成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種同步分離臍血PRP、臍血血漿和臍血細(xì)胞試劑盒及使用 方法，采用本試劑盒同步分離臍血PRP、臍血血漿和臍血細(xì)胞，填補(bǔ)了技術(shù)上的空白。
[0007] 本發(fā)明首先提供一種臍血細(xì)胞分離液，是將40%聚蔗糖液或粉狀Fi-coll-400以 Hank's液配制成濃度為9%聚蔗糖液;再將60%復(fù)方泛影葡胺注射液以Hank's液配制成濃 度為34%的復(fù)方泛影葡胺溶液，最后將聚蔗糖液和復(fù)方泛影葡胺溶液按體積比50:19.11的 比例混合，0.22μπι過濾除菌制成臍血細(xì)胞分離液。
[0008] 作為優(yōu)選，分離液的質(zhì)量濃度為1.075±0.001g/ml，
[0009] 上述的臍血細(xì)胞分離液用于制備用于臍帶血分離的試劑盒；
[00?0]上述的試劑盒，包含有A號(hào)稀釋液、B號(hào)分離液和C號(hào)液為洗滌液；
[0011] 上述的試劑盒還包含有耗材；
[0012] 所述A號(hào)稀釋液，是PBS溶液，其pH 7 · 4±0 · 1;
[0013] 作為優(yōu)選，A號(hào)稀釋液還添加有人血白蛋白，其中人血白蛋白添加的體積比終濃度 為 1-3% ;
[0014] 其中臍血血漿的制備方法，是將臍帶血在2000-2500rpm離心20-30分鐘后，吸取上 層血漿獲得的。
[0015] 所述(：號(hào)洗滌液為0.9%生理鹽水或?!17.4±0.1不含0&2+和1%2+的？83溶液。
[0016]利用上述的試劑盒可同步分離臍血中的臍血PRP、臍血血漿和臍血細(xì)胞，包括如下 的步驟：
[0017] 1)血漿初分離：
[0018] 將臍帶血分裝到離心管a中，2000-2500rpm離心20-30分鐘后，吸取上層血漿和少 量血小板層到離心管b中；
[0019] 2)臍血細(xì)胞初分離：
[0020] 向步驟1)的離心管a中加入A號(hào)液，充分混勻后，再沿管壁加入到加有B號(hào)液的離心 管中，2000-2500rpm離心20-30分鐘后使溶液分成四層;收集第一層到離心管c中，把第二層 細(xì)胞放入離心管d中，用C號(hào)液混勻離心管d后，以1800-2000rpm離心5-10分鐘，棄去上清留 沉淀重新用C號(hào)液懸起，重復(fù)洗滌得臍血細(xì)胞；
[0021] 3)血漿二次純化：
[0022] 將離心管b和離心管c以2000-2500rpm離心5-10分鐘后，吸取離心管b上清液即為 臍血血漿
[0023] 4)臍血PRP的濃縮：
[0024]去除離心管c的上清液，將離心管b和離心管c的沉淀用臍血血漿懸浮即為臍血 PRP〇
[0025]作為優(yōu)選，步驟2)制備的臍血細(xì)胞進(jìn)行二次純化：向步驟2中獲得的臍血細(xì)胞的離 心管d中加入A號(hào)稀釋液，吸管吹打均勻后沿管壁加入到事先加有B號(hào)液的離心管中，2000-2500rpm離心20-30分鐘后使溶液分成四層，收集第二層細(xì)胞放入離心管中，加入C號(hào)液充分 混勾，以1800-2000rpm離心5-10分鐘，棄去上清留沉淀重新懸起，重復(fù)洗滌既得所需二次純 化臍血細(xì)胞。
[0026]本發(fā)明通過臍血PRP兩部分濃縮，血小板濃度增加一倍多，紅細(xì)胞數(shù)成數(shù)量級(jí)較 少;通過血漿二次純化，分離獲得的臍血血漿純度高，鏡檢下幾乎沒有紅細(xì)胞、血小板、單個(gè) 核細(xì)胞和粒細(xì)胞;通過臍血細(xì)胞二次純化，分離獲得的臍血細(xì)胞純度可達(dá)到95 %以上，紅細(xì) 胞和血小板殘留率小，極大地避免了由于上述組分導(dǎo)致的過敏風(fēng)險(xiǎn)；分離第一步血漿初分 離，與常規(guī)分離技術(shù)相比，在分離臍血細(xì)胞步驟中降低了一半分離試劑的使用劑量，有效降 低分離成本。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0028]實(shí)施例1:制備用于同步分離臍血PRP、臍血血漿和臍血細(xì)胞的試劑盒
[0029] 1、試劑配制
[0030] 本發(fā)明用于分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的試劑盒包括以下試劑：
[0031] (1)A號(hào)液:稀釋液為PBS pH 7.4±0.1，不含Ca2+和Mg2+，其中加入1-3%人血白蛋 白；其中PBS溶液的配制方法如下：
[0032]母液的配制：
[0033] 0.2M Na2HP〇4:稱取71.6g Na2HP〇4-12H2〇,溶于 1000ml水
[0034] 0.2M NaH2P〇4:稱取31.2g NaH2P〇4-2H2〇,溶于 1000ml水
[0035] 先配0.21?8(口!1 = 7.4，1001111):取1911110.2111〇1/1的恥!12?04,8111110.2111〇1/1的 Na2HP〇4,即可。
[0036] 然后將0.2M ΡΒ(ρΗ=7·4)按如下稀釋即0.01M ΡΒ(ΡΗ=7·4):取50ml 0.2M PB，加 入NaC