專利名稱：用干試劑分離dna的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用干試劑分離DNA的方法。此外本發(fā)明還涉及一種用于實(shí)施該方法的相關(guān)裝置。
在核酸分析要回答如全血的白細(xì)胞中人類基因的問(wèn)題時(shí)，在樣品制備步驟中首先必需破裂細(xì)胞，并接著分離釋放出的DNA。這時(shí)必需去除能阻礙后續(xù)PCR的血液成分如血紅蛋白、免疫球蛋白和乳鐵蛋白。
在實(shí)驗(yàn)室這種操作步驟是按熟知的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行的。除其它方法外，細(xì)胞還可用堿性溶液(NaOH)破裂(所謂溶胞)，并接著將DNA結(jié)合到涂有硅膠的磁-珠上。通過(guò)施加磁場(chǎng)固定載有DNA的磁-珠并洗滌之。其后如此分離出的DNA可以有珠或無(wú)珠地用于PCR(“聚合酶鏈反應(yīng)”)。
在現(xiàn)有技術(shù)中，該結(jié)合DNA的磁-珠以懸浮體混入細(xì)胞-溶解-緩沖液中。所有的操作步驟例如均在1.5ml-反應(yīng)容器(所謂的“Eppendorf”-容器，即微量離心管)中進(jìn)行。將如10μl的全血加到給定體積的珠-懸浮物中(例如，200μl)。由此血細(xì)胞分解并釋出DNA。該磁-珠結(jié)合DNA并形成一種DNA/珠-復(fù)合體。接著該DNA/珠-復(fù)合體通過(guò)磁場(chǎng)固定在“Eppendorf管”的容器壁上，以致可進(jìn)行洗滌步驟以去除阻礙PCR的物質(zhì)。最后可進(jìn)行PCR。
實(shí)施上述方法是依賴于現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備如“Eppendorf”-容量(管)、管-支承-設(shè)備包括磁體、移液管-設(shè)備、適于試劑的冷卻容器，并必需由經(jīng)培訓(xùn)過(guò)的人員在遵守安全規(guī)定(傳染危險(xiǎn)、廢物處置等)下進(jìn)行。部分對(duì)健康有危害的物質(zhì)(如NaOH)的各種容積和高準(zhǔn)確的計(jì)量必需通過(guò)移液管進(jìn)行。這些操作步驟也是很耗時(shí)的。
由US 2002/0022261 A1已知一種適于微型遺傳分析的體系和相關(guān)的操作方法，其中應(yīng)用一種具有至少一個(gè)入口和一個(gè)多孔性輸送道的藥筒，該藥筒應(yīng)有結(jié)合DNA的特性。這時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分解，為此需要時(shí)在容器壁上提供有試劑。此外，該壁的結(jié)構(gòu)區(qū)可配置有結(jié)合DNA的材料，需要時(shí)還有磁珠。總之其中給出了一系列用于進(jìn)行遺傳分析測(cè)量的各種建議，但仍未實(shí)現(xiàn)連續(xù)的方法。此外，由EP 0723549 B1己知一種用于分離DNA的混合物，該混合物特別是含硅膠、玻璃細(xì)粒和至少一種kaotropisches鹽的混合物。
基于最近現(xiàn)有技求，本發(fā)明的目的在于，無(wú)例外地在整合的微型藥筒中實(shí)施DNA-分離，并提供一種相關(guān)的裝置。
本發(fā)明的目的是通過(guò)權(quán)利要求1的措施實(shí)現(xiàn)的。相關(guān)設(shè)備示于權(quán)利要求13。該方法的其他方面和相關(guān)裝置的擴(kuò)展方案列于從屬權(quán)利要求中。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，權(quán)利要求2包括具有含DNA的生物容器如細(xì)胞、細(xì)菌或病毒的分解方法。由此可在特別有利的和實(shí)用的實(shí)踐中以DNA-信息檢測(cè)全血樣品。
本發(fā)明除了基于上述現(xiàn)有技求外還基于WO 02/072262 A1中的“分析設(shè)備”附圖。其中描述了干式儲(chǔ)存在“嵌片”的微通道或微空腔中的在室溫下穩(wěn)定的試劑，該試劑在使用前加水而變成溶液。該干試劑按預(yù)定劑量提供，以在溶解后產(chǎn)生定量的分析介質(zhì)。與此相反，在本發(fā)明中涉及一種生物容器的細(xì)胞分解，例如從全血-樣品中分離DNA以進(jìn)行其后的PCR和/或分析。由樣品中分離出的DNA以合適的方法提供。
與至今應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室方法相比，用本發(fā)明方法具有下列優(yōu)點(diǎn)·所有物質(zhì)和方法完全整合在一個(gè)密封的一次性使用的藥筒中；·確保該試劑以安全、對(duì)健康無(wú)害及在室溫下可穩(wěn)定儲(chǔ)存的方式儲(chǔ)存；·除注入血液樣品外，無(wú)需手工操作步驟；·與有害健康的物質(zhì)即在藥筒中的血液和試劑-廢物無(wú)直接接觸；該藥筒是小量并可低成本批量生產(chǎn)。
本發(fā)明的裝置具有下列特征·存在至少一個(gè)微通道或微空腔。
·在微通道或微空腔中，該溶解-介質(zhì)特別是在有適于DNA的基底的成膜劑包體下安置在通道的壁上。
引入到微通道或微空腔中的溶解試劑具有下列特性·適于白細(xì)胞和/或其它細(xì)胞、細(xì)菌、病毒的溶解特性；·具有可忽略的蒸汽壓的固體或液體；·在室溫下穩(wěn)定；·在微通道壁上或微空腔壁上的優(yōu)良粘附性。
本發(fā)明中重要的是，在連貫的方法鏈中釋放出含于樣品中的DNA，收集分離的DNA并以合適的方法送到PCR或測(cè)定的地點(diǎn)。
本發(fā)明的其它詳情和優(yōu)點(diǎn)由下面按實(shí)施例的附圖描述并結(jié)合權(quán)利要求給出。
附圖簡(jiǎn)介

圖1示出分析設(shè)備(藥筒)的俯視2-圖6各為圖1中沿線II-II的截面圖，用于說(shuō)明由全血中的DNA-分離，其中圖2-6各包括不同的功能階段。
下面的描述是闡明含DNA的樣品。這類樣品可以是在液體中的DNA的溶液，但是也可以是含DNA的生物容器的懸浮物。在本文中例如細(xì)胞、細(xì)菌或病毒均視為生物容器。為釋放DNA必需分解該生物容器。如果相應(yīng)于人類基因目的使用全血樣品，則需對(duì)DNA位于其中的白細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分解。
圖1中示出分析設(shè)備圖，隨后也可形成“藥筒”和作為集中的或分散的測(cè)量設(shè)備。特別是形成嵌片(“嵌片實(shí)驗(yàn)室”)類的分析設(shè)備，該嵌片含有用于處理和分析測(cè)量樣品的所有介質(zhì)，本設(shè)備按規(guī)定操作所需要的相關(guān)控制設(shè)備/讀出設(shè)備在本文中未給出。
詳述之，該設(shè)備由塑料制成的嵌片體1組成，其具有流體的入口和出口。特別是有引入水的入口2(孔)和引入測(cè)量樣品如血液的入口3(孔)。重要的是通過(guò)合適的液流設(shè)備2-10，特別是不同幾何形狀的通道和空腔以傳輸和匯集測(cè)量樣品和溶液介質(zhì)。
詳述之，該液流-設(shè)備除上述水入口和樣品入口2，3外還包括兩個(gè)試劑通道4，4’以及有出口6的流道5、廢物收集通道8和其它液流通道9。用10表示適于樣品處理的流道5中的集中混合區(qū)。
該樣品在混合段10中經(jīng)處理并經(jīng)分離含于測(cè)量樣品中的DNA后，收集釋放出的DNA，并送入PCR-腔20以進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng))。
在圖1裝置中特別是用干試劑進(jìn)行PCR的方法詳述于本申請(qǐng)人的具有同樣申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)的同時(shí)申請(qǐng)并名稱為“借助用干試劑的PCR的擴(kuò)增DNA的方法和裝置”中。
該嵌片1(“藥筒”)除含用于PCR的介質(zhì)外，還包含具有入口32和出口31的探測(cè)模塊30以及相關(guān)的用于傳感器信號(hào)讀出的電連接。此外，還有用于接納探測(cè)用的試劑的手段如通道4和4’以及用于接納廢物如血和用過(guò)的試劑溶液的手段如通道8和9。因此保證了整合性，這樣無(wú)有害健康的物質(zhì)向外排出。
由圖2-6可看出，圖1的具有水入口2和血液入口3的塑料嵌片1包含穿流通道5，通過(guò)該通道，可將作為沖洗液的水和作為測(cè)量樣品的例如血或DNA-溶液或細(xì)胞懸浮液/細(xì)菌懸浮液/病毒懸浮液引入其它封閉的體系中。經(jīng)出口6可將廢物轉(zhuǎn)送到廢物-通道8或廢物空腔中。穿流通道5是在塑料嵌片1上，其相對(duì)面通過(guò)膠粘膜7所覆蓋。在穿流通道5的中心區(qū)形成混合段10，其中特別是制備用于從全血中DNA-分離的測(cè)量樣品。
從全血中的DNA-分離是通過(guò)白細(xì)胞的分解而實(shí)現(xiàn)。為此，該細(xì)胞用分解-試劑進(jìn)行化學(xué)破裂，并將其中所含的DNA釋出和收集。特別是利用已知的前述方法即經(jīng)所謂的磁-珠，它至少暫時(shí)結(jié)合細(xì)胞分解后的DNA，并通過(guò)外磁場(chǎng)濃集。
特別是由圖2可看出，在塑料嵌片1的穿流通道5的區(qū)域10中安置一個(gè)有可溶于水的儲(chǔ)存穩(wěn)定的干試劑11。本文中儲(chǔ)存穩(wěn)定性意指該固體在室溫下可儲(chǔ)存幾個(gè)月并還保持對(duì)樣品起分解作用的特性。
在圖2和3中，該干物質(zhì)11具有在穿流通道壁上的優(yōu)良粘附性。例如這可通過(guò)加入成膜劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。詳述之，在混合段10中呈大面積地安置由含磁-珠13的己知分解-試劑組成的混合物11。此外，磁鐵15以圖例表示，其表明應(yīng)用磁性以收集其上結(jié)合有DNA的磁-珠13。
由圖3和圖4看出，在圖2的裝置中經(jīng)移液管尖17將全血12加入到測(cè)量體系中。加入樣品后，該入口3用膠粘膜18封閉。
經(jīng)入口2引入水或緩沖溶液。水或緩沖溶液沿混合段與血液樣品12混合，以同樣方式溶解或懸浮包括磁-珠13的分解-試劑11，并發(fā)生作用。為此該白細(xì)胞的細(xì)胞壁首先通過(guò)溶降-試劑而破裂，接著將這時(shí)釋放出的DNA結(jié)合在磁-珠的表面。
圖4是通過(guò)水/緩沖溶液稀釋該血液樣品，并同時(shí)溶解該分解-試劑，該分解-試劑用于確保白細(xì)胞分解。以同樣方式還使存在于通道壁上混合物11的磁-珠進(jìn)入或懸浮于溶液中，并經(jīng)磁-珠13結(jié)合DNA。由此下列4個(gè)重要的方法步驟可在單一過(guò)程中實(shí)現(xiàn)·樣品稀釋，·試劑溶解/磁珠懸浮，·細(xì)胞分解，
·DNA結(jié)合。
最后按圖5進(jìn)行說(shuō)明。這時(shí)可收集經(jīng)磁-珠13可受磁性作用的DNA，而PCR-阻礙物質(zhì)由水或緩沖溶液洗去，并經(jīng)出口6以廢物排出。
作為上述措施的結(jié)果，圖6中通過(guò)磁-珠13結(jié)合的DNA在磁鐵的磁極上的濃集。該DNA可用于分析，這時(shí)首先特別要進(jìn)行PCR。
另外，在與磁場(chǎng)組合下作為結(jié)合DNA的介質(zhì)可應(yīng)用移動(dòng)的即懸浮的磁粒，也可使用不移動(dòng)的即定位在細(xì)胞分解-通道的出口的位置固定的結(jié)合DNA的介質(zhì)。在此實(shí)施方案中，由細(xì)胞釋出的DNA在離開細(xì)胞分解通道時(shí)通過(guò)溢流越過(guò)位置固定的結(jié)合DNA的介質(zhì)由液體流中引出，并結(jié)合在結(jié)合DNA的介質(zhì)上。作為結(jié)合NDA的介質(zhì)可使用如有結(jié)合DNA的捕集分子的水凝膠或類似物質(zhì)。
通過(guò)本發(fā)明的方法和相關(guān)裝置特別可以以一步法實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單而快速的DNA-分離，這僅需要最小的微流體介質(zhì)、試劑和方法步驟。
接著可對(duì)經(jīng)分離的DNA進(jìn)行PCR。采用PCR可將DNA濃度提高到可分析可檢測(cè)值的水平。這時(shí)可將PCR組合到分析過(guò)程中。該分析在相應(yīng)于圖1的探測(cè)模塊30中進(jìn)行，有關(guān)這方面這里不再詳述。
總之在本發(fā)明中實(shí)現(xiàn)了下列措施·在微通道或微空腔中引入的物質(zhì)具有結(jié)合DNA的特性。為此應(yīng)用例如結(jié)合DNA的磁-珠；·該分解-試劑和磁-珠特別是一同包含在一個(gè)單一的干基體中；·有適于全血-樣品、細(xì)胞懸浮物/細(xì)菌懸浮物/病毒懸浮物的入口；·有加水的手段。例如可以是連接到外水源上的輸入口；·需要時(shí)存在用于計(jì)量加入如調(diào)節(jié)所確定的離子強(qiáng)度用的鹽的手段；·需要時(shí)存在用于稀釋血液樣品的手段；·需要時(shí)存在其它手段，特別是通道和空腔，以用于制備所確定的鹽溶液/緩沖溶液以洗滌所結(jié)合的DNA，如DNA-磁-珠-復(fù)合體；·優(yōu)選在藥筒外部存在以血或血/水混合物、血/緩沖液混合物通流具有分解試劑/珠-試劑涂敷過(guò)的微通過(guò)或微空腔的手段；·存在產(chǎn)生磁場(chǎng)以例如在微通道的出口處固定DNA/磁-珠-復(fù)合體的手段，該手段優(yōu)選存在于藥筒的外部。
由此確保包括樣品制備的整個(gè)分析過(guò)程是在封閉的體系中完成，該體系是由環(huán)境相容的塑料制成的一次性藥筒。
權(quán)利要求
1.一種在去除后續(xù)PCR的干擾成分情況下分離DNA的方法，其具有下列措施·所有物質(zhì)和方法步驟完全整合在一個(gè)一次性使用的單元(所謂的藥筒)中，該單元允許加入含DNA的樣品；·應(yīng)用干試劑釋放DNA；·應(yīng)用結(jié)合DNA的基底以分離該釋出的DNA；·收集分離的DNA，并將其輸送到后續(xù)的PCR的位置。
2.權(quán)利要求1的方法，其中分解含DNA的生物容器，特別是細(xì)胞、細(xì)菌或病毒，為實(shí)施分解和其它的方法步驟所需的試劑以在室溫下穩(wěn)定的形式儲(chǔ)存在該單元中，其特征在于，為分解含DNA的生物容器，使干儲(chǔ)存的分解-試劑與生物容器，特別是細(xì)胞、細(xì)菌或病毒相接觸，并結(jié)合所釋出的DNA并將其輸送到PCR的位置。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于，應(yīng)用白細(xì)胞作為含DNA的容器。
4.權(quán)利要求3的方法，其特征在于，該干儲(chǔ)存的和儲(chǔ)存穩(wěn)定的分解-試劑借助于水而和白細(xì)胞接觸。
5.權(quán)利要求1和2的方法，其特征在于，樣品的稀釋、干試劑的溶解或懸浮、生物容器的分解和DNA的結(jié)合是在一個(gè)單一的方法步驟中完成。
6.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，應(yīng)用所謂的磁-珠作為結(jié)合DNA的基底。
7.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，應(yīng)用一種在細(xì)胞分解通道出口處的不移動(dòng)的含DNA-捕集物質(zhì)的水凝膠作為結(jié)合DNA的基底。
8.權(quán)利要求6的方法，其特征在于，該釋出的DNA通過(guò)磁-珠結(jié)合，并輸送到收集位置或反應(yīng)位置。
9.權(quán)利要求6的方法，其特征在于，該磁-珠通過(guò)應(yīng)用磁場(chǎng)收集。
10.權(quán)利要求9的方法，其特征在于，流動(dòng)的磁-珠通過(guò)位置固定的磁場(chǎng)收集。
11.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在反應(yīng)位置該P(yáng)CR是通過(guò)與干儲(chǔ)存的水可溶的試劑的熱循環(huán)來(lái)進(jìn)行。
12.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，稀釋加入到單元中的血樣品，并通過(guò)試劑通道泵入適于PCR的反應(yīng)通道。
13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于，經(jīng)DNA-分離后，殘余的血、血成分和試劑廢物保留在單元中，以致不可能發(fā)生與有害健康的物質(zhì)相接觸。
14.上述權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，應(yīng)用一次性產(chǎn)品作為實(shí)施反應(yīng)的單元，該單元可以小量并低成本批量制備。
15.一種實(shí)施權(quán)利要求1或權(quán)利要求2-14之一的裝置，其具有接受樣品和/或試劑的單元，其中有至少一個(gè)微通道(5)以接受試劑，在微通道(5)中的試劑以具有可忽略蒸汽壓的干混合物存在，其在室溫下形成穩(wěn)定物質(zhì)。
16.權(quán)利要求15的裝置，其特征在于，通過(guò)加入成膜劑該干試劑以層(11)結(jié)合。
17.權(quán)利要求15的裝置，其特征在于，該含DNA的生物容器特別是細(xì)胞、細(xì)菌、病毒。
18.權(quán)利要求17的裝置，其特征在于，為實(shí)施生物容器的分解，在微通道(5)中的具有可忽略蒸汽壓的干物質(zhì)是分解-試劑，其具有適于白細(xì)胞的特異性質(zhì)。
19.權(quán)利要求18的裝置，其特征在于，適于分解-物質(zhì)的通道(5)通到PCR-空腔(20)內(nèi)。
20.權(quán)利要求19的裝置，其特征在于，在微通道(5)或微空腔(20)中存在具有結(jié)合DNA的特性的基底。
21.權(quán)利要求20的裝置，其特征在于，該結(jié)合DNA的基底是所謂的磁-珠(10)。
22.權(quán)利要求21的裝置，其特征在于，該分解-試劑(11)和磁-珠(13)包含于一個(gè)共同的干基體中。
23.權(quán)利要求15-22之一的裝置，其特征在于，存在一種用于全血-樣品的入口(3)。
24.權(quán)利要求15-23之一的裝置，其特征在于，存在用于加入水的手段(2)。
25.權(quán)利要求15-24之一的裝置，其特征在于，存在用于調(diào)節(jié)開確定的離子強(qiáng)度的干緩沖物質(zhì)。
26.權(quán)利要求15-25之一的裝置，其特征在于，存在用于混合血液樣品和水或緩沖溶液的手段。
27.權(quán)利要求15-26之一的裝置，其特征在于，存在具有血、血/水混合物或血/緩沖液混合物通流用的以分解試劑/珠試劑涂敷過(guò)的微通道(5)或微空腔(20)的手段。
28.權(quán)利要求15-27之一的裝置，其特征在于，存在用于產(chǎn)生磁場(chǎng)以在PCR-空腔(20)中固定DNA/磁-珠-復(fù)合體的手段。
29.權(quán)利要求15-28之一的裝置，其特征在于，存在用于熱循環(huán)的手段。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在去除后續(xù)PCR的干擾成分情況下分離DNA的方法，其具有下列措施所有物質(zhì)和方法步驟完全整合在一個(gè)密閉的一次性使用的單元(所謂的藥筒)中，該單元允許加入含DNA的樣品；為分離該釋出的DNA使用結(jié)合DNA的基底。特別是在應(yīng)用通過(guò)白細(xì)胞的細(xì)胞分解從全血中分離DNA的方法時(shí)，用于實(shí)施細(xì)胞分解和其它反應(yīng)所需的試劑以室溫下穩(wěn)定的形式儲(chǔ)存，并且為分解白細(xì)胞和分離DNA，使干儲(chǔ)存的分解－試劑溶于水溶液中，并與白細(xì)胞接觸。在相關(guān)的裝置中包括用于接受含DNA的生物容器和/或試劑的單元，因而至少提供一個(gè)微通道(5)以容納試劑，而在微通道中試劑以具有可忽略蒸汽壓的干混合物存在，其在室溫下形成穩(wěn)定物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1950520SQ200580013761
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月30日
發(fā)明者沃爾特·岡布雷克特, 彼得·波利卡, 曼弗萊德·斯坦?jié)蔂?申請(qǐng)人:西門子公司