專利名稱：在大腸桿菌中制備豬丹毒桿菌表面保護性抗原變體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以大腸桿菌(Escherichia coli)為宿主，制備豬丹毒桿菌表面保護性抗原(以下也稱為“SpaA”)變體的方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種通過引入氨基酸取代制備SpaA變體或SpaA去除一部分后得到的縮短型SpaA(以下也稱為“ΔSpaA”)變體的方法，其中所述變體在大腸桿菌細胞內(nèi)表達時，可以不溶性包涵體形式表達；以及涉及用該方法得到的重組SpaA或ΔSpaA蛋白的變體。
背景技術(shù)：
豬丹毒是由感染豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的豬病，被感染的豬呈現(xiàn)急性敗血癥、亞急性蕁麻疹或慢性心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎等癥狀。據(jù)報道，每年約有3,000頭豬患病，給畜牧業(yè)者造成巨大損失。除了豬以外，豬丹毒桿菌對野豬、鯨、雞和火雞等食用動物具有致病性，是家畜疾病預(yù)防法指定的監(jiān)控性傳染病之一。豬丹毒也是導(dǎo)致人類丹毒的動物傳染病，是肉類衛(wèi)生學(xué)重視的疾病。豬丹毒桿菌有多種血清型，大多數(shù)豬丹毒由其中的血清型1和2引起。
為防止豬丹毒傳染，到目前為止已采用減毒活疫苗(即，由小金井菌株制備的凍干活疫苗，小金井菌株是豬丹毒桿菌減毒株，由豬丹毒桿菌強毒株在添加了吖啶黃素的培養(yǎng)基中長期繼代培養(yǎng)制得)；滅活疫苗(即，用福爾馬林處理豬丹毒桿菌強毒株的培養(yǎng)菌液，用氫氧化鋁凝膠吸收全細胞和胞外產(chǎn)物所制備的菌苗)和成分疫苗(即，含有少許用堿的水溶液從全細胞中萃取得到的非純化細胞表面蛋白的成分疫苗)。由于只需一次性少量接種就能起效，因此減毒活疫苗被認為是十分經(jīng)濟的。但是，它們也存在問題，因為它們是誘發(fā)小鼠關(guān)節(jié)炎的病原；對豬存在嚴重的副作用，產(chǎn)生抗體水平低的豬或無特定病原豬；從患有豬丹毒的豬的病灶中分離到疫苗株。
作為一種新型疫苗，人們正在利用基因重組技術(shù)對重組疫苗進行研究與開發(fā)。Galan和Timony用表達豬丹毒桿菌基因組的一部分基因的重組噬菌體轉(zhuǎn)染大腸桿菌，用其裂解物對小鼠進行免疫，并用豬丹毒桿菌進行攻擊試驗，觀察到免疫小鼠中有14-17％逃脫了感染后死亡。另外，他們指出，根據(jù)與抗裂解物的免疫血清的反應(yīng)性，被這些基因編碼的蛋白質(zhì)是分子量為66、64和43Kda的蛋白質(zhì)，并指出這些蛋白質(zhì)可以成為抗豬丹毒桿菌感染的保護性抗原(例如，見非專利文獻1)。
Makino等使編碼分子量為64Kda的來自2型豬丹毒桿菌多摩96菌株的表面蛋白(稱為“SpaA”)的基因在大腸桿菌中表達，用所得到的重組大腸桿菌的活細胞對小鼠進行免疫，并用豬丹毒桿菌進行攻擊試驗以說明SpaA蛋白具有抗感染的保護活性。他們還揭示SpaA蛋白具有606個氨基酸殘基的序列，其中N末端為由29個氨基酸組成的信號肽，C末端為8個重復(fù)同源序列，除第8個重復(fù)序列由19個氨基酸組成外，每個重復(fù)序列由20氨基酸組成(例如，見非專利文獻2)。
Imada等對與上述SpaA蛋白相當(dāng)?shù)膩碜?型菌藤澤菌株的SpaA蛋白以及編碼該蛋白質(zhì)的基因進行了研究，發(fā)現(xiàn)來自1型菌藤澤菌株的SpaA蛋白的分子量為69Kda，具有626個氨基酸殘基的序列，與2型菌的SpaA蛋白相比，該序列C末端的重復(fù)同源序列多一個，即為9個，其中第9個重復(fù)序列由19個氨基酸組成。他們指出，由全長SpaA、除去C末端的重復(fù)同源序列的SpaA或除去N末端的一部分和C末端的重復(fù)同源序列的SpaA與組氨酸六聚體形成的融合蛋白呈現(xiàn)抵御感染的效果(例如，見非專利文獻3和4)。
Watanabe等也報道了通過除去豬丹毒桿菌的SpaA蛋白C末端的重復(fù)同源序列和N末端的分泌信號序列制得的46.5kDa的多肽是抗感染的保護性抗原(46.5kDa保護性抗原；稱為“46.5KPA”)(例如，見專利文獻1)。
另一方面，對于提高疫苗候選蛋白質(zhì)生產(chǎn)率方面，已開展研究。例如，有報道稱以短芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)為宿主細胞，能成功地分泌表達46.5KPA到菌胞外(例如，見專利文獻2)。在這種表達系統(tǒng)下，表達的蛋白質(zhì)中約有50％因在培養(yǎng)液中凝集而呈不溶性。根據(jù)該報道，該不溶性46.5KPA的純化操作為用超濾膜過濾培養(yǎng)液，將膜上回收的不可溶物質(zhì)懸浮于堿溶液中，回收溶解的46.5KPA。這樣，該純化操作至少需要三個步驟(1)在中性至弱堿性條件下(pH7-9.5)，通過超濾進行濃縮；(2)在強堿性條件下(pH10.0-12.0)，通過超濾回收過濾級份(filteration fraction)；和(3)用離子交換層析純化超濾分數(shù)。
當(dāng)SpaA基因在大腸桿菌中表達時，大部分蛋白質(zhì)以可溶性蛋白的形式表達，因此可能不適用上述不溶性物質(zhì)的純化方法。除了目標SpaA蛋白以外，培養(yǎng)液中可能還含有各種污染物，如大腸桿菌的細胞碎屑、培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物等。不容易從這種含多種污染物的混合物中有效地回收和純化所要的可溶性SpaA蛋白。一般地，動物用疫苗不同于人用疫苗，除非價廉質(zhì)優(yōu)且高純度，很難被畜牧業(yè)者接受。因此，常常要求動物用疫苗的生產(chǎn)商改進大規(guī)模處理的生產(chǎn)方法和回收及純化方法，降低生產(chǎn)成本。
專利文獻1日本公開專利No.2000-279179專利文獻2日本公開專利No.2002-34568非專利文獻1Garan，J.E.et al.，(1990)Infect.Immun.，58.p.3116-3121非專利文獻2Makino，S.et al.，(1998)Microb.Pathog.25，p.101-109非專利文獻3Imada，Y.et al.(1999)Proc.Jpn.Pig.Vet.Soc.34，p.12-非專利文獻4Imada，Y.et al.(1999)Infect.Immun.67(9)，p.4376-4382發(fā)明內(nèi)容(本發(fā)明要解決的技術(shù)問題)如上所述，當(dāng)來自豬丹毒桿菌的SpaA基因在大腸桿菌或短芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)宿主中表達時，蛋白質(zhì)以可溶性SpaA蛋白或可溶性蛋白與不溶性蛋白的混合物的形式表達，這使得其制備方法麻煩，無法預(yù)期高產(chǎn)率。
鑒于上述技術(shù)或工業(yè)背景的必要性，實現(xiàn)本發(fā)明。因此本發(fā)明的一個目的是提供一種制備SpaA或SpaA除去一部分后得到的縮短型SpaA(ΔSpaA)的方法，它包括在SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入氨基酸取代，從而使本身可溶的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白可以包涵體的形式在大腸桿菌細胞中表達，以及回收和純化包涵體。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種由所述方法得到的高純度的重組SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。
(解決問題的手段)為達到上述目的，本發(fā)明人進行了勤勉的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在表達SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的大腸桿菌細胞內(nèi)存在著可形成不溶性包涵體的克??；在形成包涵體的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列的特定位置上發(fā)生了氨基酸取代；人為引入該氨基酸取代可使可溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白以包涵體的形式在菌胞內(nèi)蓄積。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白即使在形成包涵體后仍保持免疫原性，從而完成本發(fā)明。例如，當(dāng)來自SE-9菌株的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的第69位氨基酸被甘氨酸取代；第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；第278位氨基酸被甘氨酸取代；第531位氨基酸被甘氨酸取代；第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸和蘇氨酸取代；第214位和第253位氨基酸分別被谷氨酰胺和蘇氨酸取代；或第69位、第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸、甘氨酸和蘇氨酸取代時可形成包涵體。
一般地，本發(fā)明提供一種制備豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或其中SpaA蛋白被除去一部分后得到的縮短型SpaA(ΔSpaA)的變體的方法，該變體具有免疫原性，以包涵體形式在大腸桿菌中表達，該方法包括使編碼該SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因發(fā)生突變，以便在該SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入氨基酸取代；讓所得到的突變基因在大腸桿菌中表達；從所表達的變體中挑選形成包涵體的變體。因此本發(fā)明方法的特征在于，通過氨基酸取代制備能以不溶性包涵體形式表達的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白變體，使因本身的可溶性質(zhì)而難以回收和純化的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白能以不溶性包涵體的形式在大腸桿菌中表達，從而使該蛋白質(zhì)的回收和純化容易化。
一種實施方式下，本發(fā)明方法包括下列(A)到(D)步驟(A)在編碼可溶性豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因中引入突變，以便引入氨基酸取代；(B)用含有所得到的突變基因的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞；(C)從上述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞中挑選形成不溶性包涵體的大腸桿菌細胞；和(D)培養(yǎng)所挑選的大腸桿菌細胞，回收細胞內(nèi)的包涵體。
為了證實用本發(fā)明方法得到的重組SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體保留抗豬丹毒桿菌感染的保護活性(免疫原性)，可進一步對變體進行下列(E)-(F)步驟(E)給豬丹毒桿菌易感動物施用包涵體或用增溶劑處理的包涵體，然后用豬丹毒桿菌的強毒株攻擊該動物；和(F)觀察該豬丹毒桿菌易感動物的存活率或死亡率，從而評判是否具有抗豬丹毒桿菌感染的保護活性(免疫原性)。
本發(fā)明方法的特征在于本來可溶性的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白轉(zhuǎn)變成能以不溶性包涵體形式在大腸桿菌中表達的變體，從而使該蛋白質(zhì)的回收和純化容易化。根據(jù)本發(fā)明方法，為使SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白表達為不溶性包涵體，使編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因發(fā)生突變從而可在該SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入氨基酸取代。在這種用引入氨基酸取代制備的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體中包含那些可以通過形成包涵體得到表達的變體，然后將它們挑選出來。因此，只要能產(chǎn)生以形成包涵體進行表達的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體，編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因所發(fā)生的突變或該SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列發(fā)生的氨基酸取代可以是任何突變或氨基酸取代。
一個這種氨基酸取代的例子包括選自下述(1)-(7)中的一種或多于一種的組合(1)含有信號序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；(2)含有信號序列的N末端起第154位氨基酸被甘氨酸取代；(3)含有信號序列的N末端起第203位氨基酸被蘇氨酸取代；(4)含有信號序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；(5)含有信號序列的N末端起第253位氨基酸被蘇氨酸取代；(6)含有信號序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；和
(7)含有信號序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代；這種氨基酸取代的另一位例子包括含有信號序列的N末端起第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸和蘇氨酸取代；含有信號序列的N末端起第214位和第253位氨基酸分別被谷氨酰胺和蘇氨酸取代；含有信號序列的N末端起第69位、第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸、甘氨酸和蘇氨酸取代。
SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列可以為SEQ ID NO2所述序列或除去C末端的SEQ ID NO2所述序列，該序列中可引入所需要的氨基酸取代，尤其是引入上述氨基酸取代。
另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種具有免疫原性，以包涵體形式在大腸桿菌中表達的豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體。本發(fā)明SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體優(yōu)選由本文記載的方法制備。術(shù)語“豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體”在這里指通過特定的氨基酸取代，由可溶性豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白突變得到的不溶性蛋白質(zhì)。術(shù)語“免疫原性”或“免疫原性的”指誘導(dǎo)產(chǎn)生保護性抗體的能力或防止感染豬丹毒桿菌的能力。
又一個實施方式中，本發(fā)明提供一種含有本發(fā)明豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體作為活性成分的組合物。所述組合物中含有的本發(fā)明SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體優(yōu)選用本文描述的方法制備。
再一個實施方式中，本發(fā)明提供一種編碼具有免疫原性，以包涵體形式在大腸桿菌中表達的豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體的基因。本發(fā)明編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體的基因優(yōu)選用本文描述的方法制備。與編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因相比，本發(fā)明編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體的基因包括至少一個核苷酸取代。然而，所述至少一個核苷酸取代不應(yīng)該為沉默突變，而必須在SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白中引起至少一個氨基酸取代(點突變)。
本發(fā)明編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體的基因的一個例子包括一種核苷酸序列或除去一部分3’末端的核苷酸序列，它包括在SEQID NO1中發(fā)生選自下述(1)-(7)中的一種或多于一種的組合的核苷酸取代(1)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第206位核苷酸為G；(2)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第461位核苷酸為G；(3)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第608位核苷酸為C；(4)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第642位核苷酸為G；(5)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第758位核苷酸為C；(6)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第833位核苷酸為G；和(7)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第1591位核苷酸為G。
本發(fā)明編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體的基因的另一個例子包括一種核苷酸序列或除去一部分3’末端的核苷酸序列，它包括在SEQ ID NO1中發(fā)生選自下述(a)-(h)中的任何一種核苷酸取代(a)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第206位核苷酸為G；(b)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第608位核苷酸為C；(c)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第642位核苷酸為G；(d)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第833位核苷酸為G；(e)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第1591位核苷酸為G；(f)SEQ ID NO 1所述核苷酸序列中第461位和第608位核苷酸分別為G和C；(g)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第642位和第758位核苷酸分別為G和C；以及(h)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第206位、第461位和第608位核苷酸分別為G、G和C。
另一個實施方式中，本發(fā)明提供一種用本發(fā)明豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體作為豬丹毒疫苗的方法。該方法所用的本發(fā)明SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體優(yōu)選用本文描述的方法制備。
制備本發(fā)明豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的變體所使用的豬丹毒桿菌的例子包括藤澤菌株、小金井菌株等1型菌，多摩96菌株、SE-9菌株或靜岡63菌株等2型菌，但來自豬丹毒桿菌的任何菌株的SpaA基因都可用于本發(fā)明。
(有益效果)
本發(fā)明提供了一種將可溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白以不溶性包涵體的形式在大腸桿菌中表達的方法。以包涵體形式在大腸桿菌中表達使得僅僅通過離心和洗滌操作就可以簡單地純化得到高純度的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。這樣得到的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的包涵體在溶解后，具有足夠的純度和免疫原性，只要經(jīng)過稀釋就能用作疫苗。因此提供了一種簡單而有效的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白疫苗的制備方法。與以豬丹毒桿菌為起始材料制備滅活疫苗或成分疫苗的方法相比，用本方法得到的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白能降低人感染豬丹毒桿菌的機會。本發(fā)明還避免了豬丹毒桿菌恢復(fù)病原性以及出現(xiàn)抗體滴度低的豬或無特定病原豬等嚴重副作用問題。
附圖的簡單說明

圖1表示SpaA蛋白及ΔSpaA蛋白的表達載體。a插入了編碼來自豬丹毒桿菌SE-9菌株的SpaA蛋白的基因的質(zhì)粒pET11d/SpaA。b插入了編碼ΔSpaA蛋白的基因的質(zhì)粒pET11d/ΔSpaA。
圖2A表示來自豬丹毒桿菌SE-9菌株的SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果。M標記；電泳泳道1不表達外源蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液；電泳泳道2表達SpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液；電泳泳道3表達ΔSpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液。
圖2B表示來自豬丹毒桿菌的ΔSpaA蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果。M標記；電泳泳道1不表達外源蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液；電泳泳道2表達來自藤澤菌株的ΔSpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液；電泳泳道3表達來自多摩96菌株的ΔSpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液；電泳泳道4表達來自小金井菌株的ΔSpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液；電泳泳道5表達來自SE-9菌株的ΔSpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液。
圖3表示來自豬丹毒桿菌SE-9菌株的可溶性及不溶性(包涵體)ΔSpaA蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果。M標記；電泳泳道1超聲處理的表達可溶性ΔSpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液的離心上清液；電泳泳道2超聲處理的表達可溶性ΔSpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液的離心沉淀物；電泳泳道3超聲處理的表達不溶性ΔSpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液的離心上清液；電泳泳道4超聲處理的表達不溶性ΔSpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液的離心沉淀物。
圖4A表示與SEQ ID NO7相比，從表達不溶性(包涵體)ΔSpaA蛋白的大腸桿菌轉(zhuǎn)化細胞(三個克隆，No.1、No.2和No.3)中提取的質(zhì)粒中SpaA基因中發(fā)現(xiàn)的突變位點和限制性酶切位點。
圖4B表示與SEQ ID NO7相比，從表達不溶性(包涵體)SpaA蛋白的大腸桿菌轉(zhuǎn)化細胞(一個克隆，No.4)中提取的質(zhì)粒中SpaA基因中發(fā)現(xiàn)的突變位點和限制性酶切位點。
圖5表示來自豬丹毒桿菌SE-9菌株的可溶性及不溶性(包涵體)SpaA蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果。M標記；電泳泳道1超聲處理的表達可溶性SpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液的離心上清液；電泳泳道2超聲處理的表達可溶性SpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液的離心沉淀物；電泳泳道3超聲處理的表達不溶性SpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液的離心上清液；電泳泳道4超聲處理的表達不溶性SpaA蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)菌液的離心沉淀物。
圖6表示經(jīng)純化的來自豬丹毒桿菌SE-9菌株的不溶性(包涵體)SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果。M標記；電泳泳道1SpaA蛋白；電泳泳道2ΔSpaA蛋白。
本發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明的特征在于一種用特定的氨基酸取代SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中特定位點的氨基酸殘基使該蛋白以包涵體的形式在大腸桿菌中表達的方法，以及一種結(jié)合本方法制備SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的方法。
(1)克隆編碼paA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因?qū)τ谪i丹毒桿菌，主要有兩種血清型對豬呈現(xiàn)強致病性，它們被分類為1型菌和2型菌。1型菌包括藤澤菌株和小金井菌株，而2型菌包括多摩96菌株、SE-9菌株和靜岡63菌株。然而來自豬丹毒桿菌任何菌株的SpaA基因都可以用于本發(fā)明?？梢杂檬惺叟囵B(yǎng)基，按照所附帶的說明書增殖這些菌體細胞。例如，將一定量的細胞懸浮于添加了0.1％吐溫80的腦心浸液肉湯中，在37℃下培養(yǎng)懸浮液16-48小時。
可以通過PCR方法得到編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因，PCR的模板為從上述菌胞提取的DNA，引物設(shè)計自Imada，Y等(1999)Infect.Immun.67(9)，p.4376-4382描述的序列(SEQ IDNO1)。SEQ ID NO1記載了來自藤澤菌株的SpaA基因的全長核苷酸序列，而SEQ ID NO2記載了來自藤澤菌株的含有信號肽的全長SpaA蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO7記載了來自SE-9菌株的SpaA基因的全長核苷酸序列的一部分，相當(dāng)于SEQ ID NO1中第107位-第1854位核苷酸殘基的序列。模板DNA可以用市售的DNA提取試劑盒(例如Isoplant(日本基因有限公司))，按照其附帶的說明書進行制備。通過DNA合成承包商(如QIAGEN)的服務(wù)，很容易得到PCR引物，根據(jù)需要，優(yōu)選在5’末端附加合適的限制性酶切位點的序列。具體地，可以使用在SEQ ID NO2中附加NcoI位點或在SEQ ID NO4或SEQ ID NO5中附加BamHI位點的合成DNA。SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所述引物可用于編碼SpaA蛋白的DNA片段的擴增，而SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所述引物可用于編碼ΔSpaA蛋白的DNA片段的擴增。所得到的編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的DNA片段將附加十二個核苷酸，這些核苷酸編碼來自限制酶NcoI的Met和C末端的三個氨基酸(Ala-Phe-Ala)。編碼ΔSpaA蛋白的DNA片段具有直至第1260位核苷酸的部分SpaA基因，編碼除去了C末端207個氨基酸殘基的縮短型SpaA蛋白。可以根據(jù)實際需要，通過變化引物序列的位置來任意設(shè)定SpaA蛋白除去一部分得到的ΔSpaA蛋白的大小和位點?？捎檬惺鄣腖A-Taq試劑盒(寶酒造公司)、Advantage HF-2PCR試劑盒(BC Bioscience)等，參照所附帶的說明進行PCR反應(yīng)。在用TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆后可以用ABI PRISM310基因分析儀(PEBiosystems)等DNA測序儀確定PCR得到的DNA片段的核苷酸序列。
克隆這樣得到的編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因。具體地，用限制酶NcoI和BamHI消化上述PCR產(chǎn)物，將切下的片段插入預(yù)先經(jīng)相同限制酶消化的合適的質(zhì)粒(如pET11d(Novagen))中，將所得到的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中。在大腸桿菌菌落中挑選具有編碼目標蛋白質(zhì)的DNA的克隆。HB101、JM109、LE392、TB1、BL21等可用作大腸桿菌宿主，優(yōu)選JM109?；虻膶?dǎo)入方法包括電穿孔法、原生質(zhì)體法、PEG法等，這些技術(shù)中任何一種都可以用。目標基因的克隆可以通過質(zhì)粒純化和核苷酸序列的確定來證實?；蛑亟M的一系列程序可以按照Sambrook等描述的基因重組的一般技術(shù)(分子克隆，實驗室手冊(第二版)，Cold Spring Harbor Laoratory出版社N.Y.，1989)進行操作。實際上，可以用市售試劑盒，按照其附帶的說明書進行操作。
(2)不溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的表達和純化通過使編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的克隆基因在特定位點上發(fā)生點突變將所得到的突變基因?qū)氪竽c桿菌，本來可溶性的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白可以不溶性包涵體的形式進行表達。
可用定點誘變法來實施點突變。實際上可以用Takara的定點誘變系統(tǒng)(Mutan-Super Express Km、Mutan-Express Km、Mutan-K等)、Stratagene的QuickChange Multi定點誘變試劑盒或QuickChange XL定點誘變試劑盒或Invitrogen的GeneTailor定點誘變系統(tǒng)等市售試劑盒，按照其附帶的說明書進行操作。也可以通過在引入點突變的位置上對適當(dāng)大小的核酸片段進行取代來產(chǎn)生點突變。
或者，由于在進行正常的PCR時，在擴增的基因中可能會以一定的速度在不特定的位點上發(fā)生不特定數(shù)目的核苷酸取代，該方法可用于導(dǎo)入核苷酸取代。若取代的核苷酸影響氨基酸密碼子，則可能發(fā)生氨基酸突變，這樣就有可能出現(xiàn)形成包涵體的克隆。挑選這些克隆就可以得到包涵體。
當(dāng)可溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白發(fā)生例如含有信號序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；第154位氨基酸被甘氨酸取代；第203位氨基酸被蘇氨酸取代；第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；第253位氨基酸被蘇氨酸取代；第278位氨基酸被甘氨酸取代；和/或第531位氨基酸被甘氨酸取代時在大腸桿菌中以包涵體的形式表達。這樣SpaA基因發(fā)生點突變以便可以發(fā)生這些氨基酸取代。通過在上述位點中的至少一個位點上引入氨基酸突變來形成包涵體，但在所得到的突變體保持免疫原性的限度內(nèi)，有可能在所有這些位點上引入氨基酸突變。優(yōu)選地，SpaA基因發(fā)生點突變，從而SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的第69位氨基酸被甘氨酸取代；第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；第278位氨基酸被甘氨酸取代；第531位氨基酸被甘氨酸取代；第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸和蘇氨酸取代；第214位和第253位氨基酸分別被谷氨酰胺和蘇氨酸取代；或第69位、第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸、甘氨酸和蘇氨酸取代。
只要ΔSpaA蛋白保持免疫原性并在引入氨基酸取代時能形成包涵體，并不限制SpaA蛋白除去一部分后得到的ΔSpaA蛋白的區(qū)域和大小。本發(fā)明可使用除去至少約三分之一SpaA蛋白C末端得到的ΔSpaA蛋白。優(yōu)選的ΔSpaA蛋白，從具有信號序列的N末端起含有420個氨基酸殘基，在C末端除去了207個氨基酸。
或者，采用與上述方法相反的方式進行氨基酸取代有可能使不溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白逆轉(zhuǎn)化成可溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。因此，利用本發(fā)明方法，可以根據(jù)實際需要自由地獲得可溶性的或不溶性的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。
可以用上述基因克隆的方法實現(xiàn)編碼發(fā)生點突變的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因表達。表達載體可用市售商品，選擇合適的大腸桿菌作為載體。例如BL21(DE3)或DH5α(DE3)可用作具有T7啟動子的載體；HB101、DH5α或JM109可用作具有色氨酸啟動子的載體。優(yōu)選將能進行伴隨克隆和表達目標蛋白質(zhì)的pET11d(Novagen)和大腸桿菌BL21菌株結(jié)合使用。
可用下述方法篩選表達SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的重組大腸桿菌。在表達誘導(dǎo)劑(對于本發(fā)明所用的表達系統(tǒng)，使用IPTG)的存在下，低速離心收集所培養(yǎng)和增殖的細胞，使之懸浮于一定量的蒸餾水中。用超聲處理方法或用弗氏細胞壓碎器、Manton Galling等勻漿器破碎細胞，高速離心(15,000rpm，15分鐘)，從沉淀物中回收包涵體。蒸餾水中可適當(dāng)添加表面活性劑(如Triton X100)、螯合劑(如EDTA)、溶菌酶等。再次將沉淀物懸浮于適量蒸餾水中，對一定量的懸浮液進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。用考馬斯亮蘭染色后，通過分子大小和染色影像來證實SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的表達。通過比較上述離心后的上清液和沉淀物中SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的量來確定包涵體的形成量。根據(jù)本發(fā)明，沉淀物中約能檢出90％或以上的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。除了基于分子大小的方法，諸如ELISA、蛋白質(zhì)印跡、點印跡等基于抗原-抗體反應(yīng)的方法也可用于證實(或檢測)SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。這些方法通常用于檢測在大腸桿菌中表達的外源蛋白，根據(jù)實際需要選擇任何一種合適的方法。
可采用日本公開專利No.2002-34568記載的方法或蛋白質(zhì)化學(xué)常用的方法，(如離心、鹽析、超濾、等電沉淀、電泳、離子交換層析、親和層析、疏水層析、羥磷灰石層析或它們的組合方法)純化來自如此得到的表達SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的大腸桿菌細胞的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。根據(jù)本發(fā)明方法，用酶(如溶菌酶)和/或超聲波(如聲波照射型細胞勻漿器(sound beam type cell homogenizer))處理表達SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的大腸桿菌細胞培養(yǎng)菌液，然后重復(fù)離心(如15,000rpm，15分鐘)和懸浮于洗滌緩沖液(如20mM Tris-HclpH7.5，10mMEDTA，1％Triton X-100)能得到90％或以上純度的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白。
(3)SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的免疫原性可用這樣得到的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白對感染了豬丹毒桿菌的小鼠或其它動物進行免疫并用豬丹毒桿菌強毒株對該動物進行攻擊試驗的方法來確定這些蛋白質(zhì)的免疫原性。免疫方法(如皮下、肌肉或腹膜內(nèi)等給藥途徑、免疫期等)用疫苗免疫原性調(diào)查的常用方法來確定。更具體地，用5倍的添加了25％(vol/vol)氫氧化鋁凝膠的鹽水連續(xù)稀釋抗原蛋白制成連續(xù)稀釋液，每一稀釋液皮下給予5-10只小鼠(ddy，5周齡，雌性)進行免疫。免疫3周后給小鼠皮內(nèi)注射紅斑丹毒絲菌強毒株藤澤菌株的活細胞，觀察10日內(nèi)小鼠的存活或死亡情況。用半數(shù)保護量(PD50)來評判抗原蛋白的免疫效果。
本發(fā)明SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白以不溶性形式純化后可以用尿素、鹽酸胍、精氨酸鹽酸鹽等增溶劑溶解，用膜濾器等無菌過濾，作為原料，制備疫苗以防止野豬、鯨、雞、火雞等敏感動物和人感染豬丹毒桿菌或其它病原體。這樣制備的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白適當(dāng)與氫氧化鋁、磷酸鋁、礦物油或非礦物油等免疫佐劑、聚山梨醇酯80等穩(wěn)定劑、氨基酸、乳糖或蔗糖等糖、福爾馬林、硫柳汞(thimerosal)、2-苯氧基乙醇、苯甲醇、苯索氯銨或苯扎氯銨等防腐劑混合配制成藥物組合物。當(dāng)添加糖(如乳糖或蔗糖)作為有效賦形劑時，還可以配制成凍干制劑。
以下實施例對本發(fā)明做更詳細說明，但不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。在下述實施例中，除非另有說明，采用和光純藥公司、寶酒造公司或Difco公司生產(chǎn)的試劑。
實施例1(1)編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因的克隆在37℃下，用添加了0.1％吐溫80的腦心浸液肉湯(Difo)培養(yǎng)豬丹毒桿菌的1型菌藤澤菌株和小金井菌株以及2型菌多摩96菌株和SE-9菌株16-48小時。離心培養(yǎng)菌液(約1.5-3.0mL)，用DNA提取試劑盒(Isoplant，日本基因公司.)從所得到的沉淀物(約0.03g或以上)中提取全基因組DNA。
以該全基因組DNA為模板，使用基于核苷酸序列SEQ ID NO1制備的合成引物(SEQ ID NO3和4序列對，SEQ ID NO3和5序列對)和LAPCR試劑盒(寶酒)進行PCR。反應(yīng)液在94℃下保持3分鐘后，然后以94℃-60秒、56℃-30秒和72℃-60秒進行循環(huán)，重復(fù)30循環(huán)。引物SEQ ID NO3被設(shè)計用于擴增SpaA基因的第79位核苷酸起的下游區(qū)域，其5’末端附加了NcoI位點。引物SEQ ID NO4和5分別被設(shè)計用于擴增SpaA基因中直至第1260位核苷酸和直至1881位核苷酸(SpaA基因的終止密碼子)的區(qū)域，其5’末端附加了BamHI位點。PCR提供了具有第79位到第1881位的核苷酸序列的SpaA基因和具有第79位-第1260位的核苷酸序列的ΔSpaA基因。
用NcoI和BamHI雙重消化PCR擴增的DNA片段，用T4DNA連接酶將所得到的消化產(chǎn)物與預(yù)先經(jīng)NcoI和BamHI雙重消化的質(zhì)粒pET11d(novagen)連接。該反應(yīng)液與大腸桿菌JM109混合。混合物在冰上放置數(shù)十秒后涂布在添加了50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂(1.0％胰蛋白凍、0.5％酵母提取物、1.0％NaCl、1.5％瓊脂，pH7.0)上，37℃放置過夜。在1-5mL添加了50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中接種單個菌落，在30-37℃下振蕩培養(yǎng)基后用常規(guī)方法從菌胞中提取含有編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因的質(zhì)粒(圖1-a和1-b)。
(2)SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的表達如實施例1-(1)所述方法，將來自各不同菌株的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)以獲得轉(zhuǎn)化體的單個菌落。在1-5mL添加了50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中接種單個菌落，在30-37℃下振蕩培養(yǎng)直至培養(yǎng)菌液的OD600nm達到0.6-1.0。在培養(yǎng)菌液中加入1/100(體積)IPTG(100mM)溶液，繼續(xù)在37℃下振蕩培養(yǎng)2-3小時。將培養(yǎng)液與等體積的2xSDS樣品緩沖液混合，100℃加熱2分鐘后，對混合物進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并用考馬斯亮蘭(nacalai tesque)染色。所有的菌株均檢測到70-45KD附近的電泳帶，其染色影像證實了SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的表達。圖2A顯示了來自SE-9菌株的SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的SDS-PAGE結(jié)果；圖2B顯示了來自藤澤菌株、多摩96菌株、小金井菌株和SE-9菌株的SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的SDS-PAGE結(jié)果。
(3)SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的形狀按下述方法調(diào)查是否形成了SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的包涵體。將實施例1-(2)的培養(yǎng)菌液以10,000rpm離心5分鐘，在所得到的沉淀物中加入培養(yǎng)菌液體積的1/5-1/10的洗滌緩沖液(20mM Tris-HClpH7.5，10mM EDTA，1％Triton X-100)或蒸餾水，懸浮細胞至均勻。懸浮液中加入1/100體積量的溶菌酶溶液(10mg/ml)，30℃下反應(yīng)15分鐘。冰冷條件下，用輕便超聲處理器(生產(chǎn)商Tomy；型號UR-20P；輸出5；時間15秒，2-4次)超聲處理混合物，以15,000rpm離心15分鐘。回收上清液后，在沉淀物中加入與離心前的超聲處理混合物相同體積的洗滌緩沖液，再次懸浮菌胞至均勻。在回收的上清液和沉淀物中各加入等體積的2xSDS樣品緩沖液。加熱后，對各混合物進行SDS-PAGE并用考馬斯亮蘭染色。如果在沉淀物懸浮液中發(fā)現(xiàn)ΔSpaA蛋白，則判定該ΔSpaA蛋白形成了包涵體(圖3)。結(jié)果在數(shù)個SE-9菌株的克隆中檢測到包涵體的形成(表1)。表1表示形成包涵體的克隆數(shù)占調(diào)查克隆數(shù)的比例。ND表示“沒有檢測”表1

(4)形成包涵體的克隆的核苷酸序列測定然后，從表1中形成包涵體的SE-9菌株的4個克隆(No.1，No.2，No.3和No.4)中提取質(zhì)粒，委托TAKARA BIO INC.客服中心分析編碼ΔSpaA蛋白的基因的核苷酸序列。與SEQ ID NO7相比，觀察到核苷酸突變引起的氨基酸取代，如表2所示。
表2

實施例2(1)ΔSpaA蛋白的氨基酸取代引起的包涵體形式表達蛋白質(zhì)質(zhì)粒構(gòu)建方法為用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈顏碜詫嵤├?-(4)中形成包涵體的克隆的質(zhì)粒，將所得到的含表2所述核苷酸取代的DNA片段插入編碼從表達可溶性ΔSpaA蛋白的克隆(SE-9菌株)中提取的質(zhì)粒中ΔSpaA蛋白的基因中的相應(yīng)區(qū)域。
具體地，(a)來自克隆No.1的質(zhì)粒經(jīng)限制酶EcoI和ClaI雙重消化后，進行瓊脂糖電泳以分離EcoI-ClaI片段(圖4A-1)，該片段含有編碼ΔSpaA蛋白的基因中第587位-第1152位核苷酸的序列。將所得到的片段插入來自預(yù)先用EcoI和ClaI處理的表達可溶性ΔSpaA蛋白的克隆(SE-9菌株)的質(zhì)粒，從而構(gòu)建含有第642位-第758位核苷酸發(fā)生取代的編碼ΔSpaA蛋白的基因的質(zhì)粒。
同樣的方法下，構(gòu)建(b)插入了來自克隆No.3的EcoI-ClaI片段(圖4A-b)的質(zhì)粒(第833位核苷酸發(fā)生取代)，該片段含有編碼ΔSpaA蛋白的基因中第587位-第1152位核苷酸；(c)插入了來自克隆No.2的KpnI-ClaI片段(圖4A-c)的質(zhì)粒(第461位-第608位核苷酸發(fā)生取代)，該片段含有編碼ΔSpaA蛋白的基因中第266位-第1152位核苷酸；和(d)插入了來自克隆No.2的EcoI-ClaI片段(圖4A-d)的質(zhì)粒(第608位核苷酸發(fā)生取代)，該片段含有編碼SpaA蛋白的基因中第587位-第1152位核苷酸。
(e)將含有編碼可溶性ΔSpaA蛋白的基因中第266位-第1152位核苷酸的KpnI-ClaI片段(圖4A-e)插入來自經(jīng)KpnI和ClaI處理的No.2克隆的質(zhì)粒中構(gòu)建含有第206位核苷酸發(fā)生取代的編碼ΔSpaA蛋白的基因的質(zhì)粒。
(f)用定點誘變構(gòu)建含有第642位核苷酸發(fā)生取代的編碼ΔSpaA蛋白的基因的質(zhì)粒(Takara，Mutan-Super Express Km)。具體地，來自表達可溶性ΔSpaA蛋白的克隆(SE-9菌株)的質(zhì)粒經(jīng)限制酶EcoRI和HindIII雙重消化，將所得到的含有編碼ΔSpaA蛋白的基因中第587位-第1260位核苷酸和質(zhì)粒pET11d的一部分的EcoRI-HindIII片段(967bp)克隆至載體質(zhì)粒pKF18k(Takara)。按照實施例1-(1)所述方法進行PCR，以該質(zhì)粒作為模板，使用SEQ IDNNO6突變用的合成寡核苷酸(含有編碼ΔSpaA蛋白的基因中第632位-第657位核苷酸的序列，其中第642位核苷酸T被G取)、寶酒生產(chǎn)的Mutan-Super Express Km試劑盒所附帶的5pmol選擇引物、5μl 10xLAPCR緩沖液(+Mg2+)、8μldNTP混合液、0.5μl LA-Taq聚合酶溶液以及無菌蒸餾水，使總體積為50μl。所得到的PCR反應(yīng)液經(jīng)乙醇沉淀/洗滌后克隆至大腸桿菌MV1184菌株(寶酒)。所得到的導(dǎo)入突變的質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI雙重消化以分離出EcoRI-BamHI片段，該片段含有編碼ΔSpaA蛋白基因中的第587位-第1260位核苷酸。將該片段作為起始材料插入來自表達可溶性ΔSpaA蛋白的克隆(SE-9菌株)的質(zhì)粒的相應(yīng)區(qū)域，以得到目標質(zhì)粒。同樣地，用同樣的方法構(gòu)建含有來自藤澤菌株和多摩96菌株的第642位核苷酸T被G取代的編碼ΔSpaA蛋白的基因的質(zhì)粒。
這樣得到的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，調(diào)查所表達的ΔSpaA蛋白的形狀。結(jié)果發(fā)現(xiàn)每一種來自任何質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體的ΔSpaA蛋白均形成包涵體。
(2)全長SpaA蛋白的氨基酸取代引起的包涵體形式蛋白質(zhì)表達質(zhì)粒構(gòu)建方法為用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈顏碜詫嵤├?-(4)中形成包涵體的克隆的質(zhì)粒，將所得到的含表2所述核苷酸取代的DNA片段插入從表達可溶性ΔSpaA蛋白的克隆(SE-9菌株)中提取的質(zhì)粒中編碼SpaA蛋白的基因中的相應(yīng)區(qū)域。
具體地，(a)來自克隆No.4的質(zhì)粒經(jīng)限制酶ClaI和BamHI雙重消化后，進行瓊脂糖電泳以分離ClaI-BamHI片段(圖4B-a)，該片段含有編碼SpaA蛋白的基因中第1152位-第1881位核苷酸(編碼SpaA蛋白的基因的終止密碼子)的序列。將所得到的片段插入預(yù)先用ClaI和BamHI處理的來自克隆(SE-9菌株)的表達可溶性全長SpaA蛋白的質(zhì)粒，從而構(gòu)建含有第1591位核苷酸發(fā)生取代的編碼SpaA蛋白的基因的質(zhì)粒。
(b)實施例2-(1)-(a)制備的質(zhì)粒經(jīng)PstI和ClaI雙重消化后，進行瓊脂糖電泳以分離PstI-ClaI片段(圖4A-f)，該片段含有編碼ΔSpaA蛋白基因中第611位-第1152位核苷酸的序列。將所得到的片段插入預(yù)先用PstI和ClaI處理的來自克隆(SE-9菌株)的表達可溶性全長SpaA蛋白的質(zhì)粒，從而構(gòu)建含有第642位和第758位核苷酸發(fā)生取代的編碼SpaA蛋白的基因的質(zhì)粒。
這樣得到的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，調(diào)查所表達的SpaA蛋白的形狀。結(jié)果發(fā)現(xiàn)每一種來自任何質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體的SpaA蛋白均形成包涵體。
實施例3(1)形成包涵體的SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的純化對每一個實施例2-(1)得到的以包涵體形式表達ΔSpaA蛋白的大腸桿菌細胞和實施例2-(2)得到的以包涵體形式表達SpaA蛋白的大腸桿菌細胞進行培養(yǎng)。各取培養(yǎng)菌液100ml，以10,000rpm離心5分鐘，在所得到的沉淀物中加入培養(yǎng)菌液的1/5-1/10體積量的洗滌緩沖液(20mM Tris-Hcl pH7.5，10mMEDTA，1％Triton X-100)，懸浮菌胞至均勻。在懸浮液中加1/100體積量的溶菌酶溶液(10mg/ml)，30℃下反應(yīng)15分鐘。冰冷條件下，用聲波照射型細胞勻漿器(生產(chǎn)商Barnson Sonic Power公司；型號350；輸出4；Duty cycle30％；時間5-15分鐘)超聲處理混合物，以15,000rpm離心15分鐘?；厥丈锨逡汉?，在沉淀物中加入與離心前的超聲處理混合物相同體積的洗滌緩沖液(或無菌蒸餾水)，再次懸浮菌胞至均勻。懸浮液以15,000rpm離心15分鐘。回收上清液后，在沉淀物中加入洗滌緩沖液(或無菌蒸餾水)。重復(fù)這種離心/洗滌操作3-5次。最后的洗滌操作中，將離心后的沉淀物懸浮于無菌蒸餾水中，懸浮液再次以15,000rpm離心15分鐘?；厥丈锨逡汉?，沉淀物懸浮于10ml的8M尿素中。室溫下輕輕振蕩2小時，然后在5℃下輕輕振蕩18小時。包涵體蛋白質(zhì)得到溶解，得到純化的SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白。SDS-PAGE之后用考馬斯亮蘭對凝膠進行染色。光密度計檢測表明這樣得到的SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白的純度為90％或以上(圖6)。
(2)SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的免疫原性按下述方法確定SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的免疫原性。在4ml實施例3-(1)純化的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白溶液中加入11ml生理鹽水和5ml氫氧化鋁凝膠佐劑(ALHYDROGEL“85”，SuperfosBiosector)，室溫下攪拌混合物2小時，得到疫苗溶液。用5倍量添加了25％(vol/vol)氫氧化鋁凝膠的生理鹽水連續(xù)稀釋該疫苗溶液，制成連續(xù)稀釋液，對10只小鼠(ddy，5周齡，雌性)進行免疫，每一稀釋度皮下給予0.5ml。免疫3周后給小鼠皮內(nèi)注射約1,000個紅斑丹毒絲菌強毒株藤澤菌株活細胞，進行攻擊。觀察10日內(nèi)小鼠的存活或死亡情況，確定純化的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的半數(shù)保護量(PD50)。如表3所示，純化的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白表現(xiàn)出極高的免疫原性，即半數(shù)保護量(PD50)為0.0621-0.1885μg。按Behrens-Karber法(Karber GBeitrag zur kollektiven Behandlungpharmakologischer Reihenversuche.Arch.Exp.Path.Pharm.，162480，1931；“Saikingaku Jisshu Teiyo”[Summary Practice inBacteriology]，5th ed.，Ed.by“alumni association ofIkagakukenkyusho”[Medical Science Laboratory]，Maruzen，p.564-565)，根據(jù)下列方程式計算小鼠的半數(shù)保護量(50％有效量)
小鼠的半數(shù)保護量(μg)＝10m，m＝X4-[(h0+h1)(X1-X0)×1/2+(h1+h2)(X2-X1)×1/2+(h2+h3)(X3-X2)×1/2+(h4+h3)(X4-X3)×1/2]其中，X0、X1、...X4各代表各接種量的對數(shù)，h0、h1、...h4各代表相應(yīng)的實測有效率(存活數(shù)/攻擊數(shù))。各接種量的對數(shù)(X)可由方程式X＝Log10[樣品的蛋白質(zhì)濃度(μg/ml)×小鼠的注射量(ml)÷稀釋倍數(shù)]。
表3

工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供了一種在大腸桿菌中將可溶性SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白制成不溶性包涵體的方法。本發(fā)明方法應(yīng)用于可溶性蛋白的制備中，可建立一種實用的制備SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的方法，該方法確保了SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白在商業(yè)市場上的穩(wěn)定供應(yīng)。本發(fā)明方法得到的重組SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白保留了與原始可溶性蛋白等同的免疫原性，可單獨或與穩(wěn)定劑、保護劑、防腐劑等多種添加劑混合用作抗豬丹毒桿菌感染的疫苗的制備材料。它還可以用作制備單克隆抗體/多克隆抗體的抗原，或用作調(diào)查抗SpaA蛋白抗體或抗ΔSpaA蛋白抗體與豬丹毒桿菌的結(jié)合性的研究材料。同樣地，用本發(fā)明方法得到的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白將為醫(yī)療及研究領(lǐng)域做出巨大貢獻。
序列表序列表<110>財團法人化學(xué)及血清療法研究所<120>一種在大腸桿菌中制備豬丹毒桿菌表面保護性抗原的方法<130>664968<140>JP 2004-53882<141>2004-02-27<160>7<170>PatentIn 3.1版<210>1<211>1881<212>DNA<213>豬丹毒桿菌<400>1atgaaaaaga aaaaacacct atttccgaaa gtaagtctta tgtcgtgctt acttttaaca 60gcaatgccac tacaaacagc ttttgctgat tcgacagata tttctgtgat tccactaatc 120ggtgaacaag ttggattgct cccagtttta cctgggacag gggtacatgc tcaggaatac 180aacaaaatga ctgatgctta tattgaaaaa ttggtatctc taattaatca aaaagtgaag 240ccgtttctta taaatgagcc aaaggggtac caaagtttcg aagcagtgaa tgaagagatt 300aactcgattg taagtgaact taaaaatgaa ggaatgagtc ttcaaaacat tcaccatatg 360tttaaacaaa gcatccaaaa cctagcaact agaatcggct acagaagttt tatgcaggat 420gctatgtatc ttgaaaattt tgaaagatta acgattcctg aacttgatga agcatacgtt 480gatttactcg tgaattacga ggtgaaacac cgtattttag taaaatatga aggtaaagtt 540aaaggtagag ctcccttaga agcatttata gttcctctaa gagatagaat tcgtagtatg 600aatgaaattg ctgcagaagt aaattattta cctgaagcgc atgaggattt cttagtttca 660gattcaagcg agtataatga caaactaaat aatatcaact ttgctttggg tctaggggtc 720agcgagttta ttgactataa ccggctcgaa aatatgatgg aaaaagaact tcatccactg 780tatcttgaac tttatgctat gcggagaaat cgccaaattc aagttgtaag agatgtatat 840ccaaacttgg aacgtgcgaa cgcggttgtt gaatccttaa agacaattaa agatataaaa 900caaagaggga agaaactaca ggaacttctt gaaatttata tccaaagaag tggagatgtt 960cgaaaaccag atgtactcca acgatttatt ggaaaatatc aatcagtagt tgatgaagaa1020aaaaataaac ttcaagatta tttagaatca gatatttttg attcatatag tgtggatggc1080gagaaaataa gaaataaaga aattacactc atcaatagag atgcatactt atctatgatt1140tacagagctc aatcgatttc ggaaattaag acgattcgtg cagatttaga atcacttgtc1200
aaatcattcc aaaatgaaga aagtgactct aaagtagagc ctgaaagtcc cgttaaagta1260gaaaaaccag ttgatgaaga aaaacctaaa gatcaaaaga agctagttga tcaatcaaaa1320cccgaatcga attcaaaaga agggtggatt aagaaagata ataagtggtt ctatattgag1380aaatcaggtg gaatggcaac aggttggaag aaggtagcag acaaatggta ctacctcgat1440aatacgggtg ctatagttac gggttggaag aaggtagcaa acaaatggta ctatcttgaa1500aaatcaggtg cgatggcaac aggatggaag aaagtatcaa acaagtggta ctaccttgaa1560aactcaggtg caatggcaac aggatggaag aaagtatcaa acaagtggta ctaccttgaa1620aattcaggcg caatggctac aggatggaaa aaggtagcaa acaaatggta ctaccttgaa1680aactcaggtg cgatggcaac aggatggaag aaagtatcga acaagtggta ctaccttgaa1740aactcaggcg caatggctac aggatggaaa aaggtagcaa acaaatggta ctaccttgat1800aaatcaggaa tgatggttac aggttcaaaa tctattgatg gtaaaaagta tgcatttaag1860aacgatggaa gtttaaaata g 1881<210>2<211>626<212>PRT<213>豬丹毒桿菌<400>2Met Lys Lys Lys Lys His Leu Phe Pro Lys Val Ser Leu Met Ser Cys1 5 10 15Leu Leu Leu Thr Ala Met Pro Leu Gln Thr Ala Phe Ala Asp Ser Thr20 25 30Asp Ile Ser Val Ile Pro Leu Ile Gly Glu Gln Val Gly Leu Leu Pro35 40 45Val Leu Pro Gly Thr Gly Val His Ala Gln Glu Tyr Asn Lys Met Thr50 55 60Asp Ala Tyr Ile Glu Lys Leu Val Ser Leu Ile Asn Gln Lys Val Lys65 70 75 80Pro Phe Leu Ile Asn Glu Pro Lys Gly Tyr Gln Ser Phe Glu Ala Val85 90 95Asn Glu Glu Ile Asn Ser Ile Val Ser Glu Leu Lys Asn Glu Gly Met100 105 110Ser Leu Gln Asn Ile His His Met Phe Lys Gln Ser Ile Gln Asn Leu115 120 125Ala Thr Arg Ile Gly Tyr Arg Ser Phe Met Gln Asp Ala Met Tyr Leu130 135 140Glu Asn Phe Glu Arg Leu Thr Ile Pro Glu Leu Asp Glu Ala Tyr Val145 150 155 160Asp Leu Leu Val Asn Tyr Glu Val Lys His Arg Ile Leu Val Lys Tyr165 170 175Glu Gly Lys Val Lys Gly Arg Ala Pro Leu Glu Ala Phe Ile Val Pro180 185 190
Leu Arg Asp Arg Ile Arg Ser Met Asn Glu Ile Ala Ala Glu Val Asn195 200 205Tyr Leu Pro Glu Ala His Glu Asp Phe Leu Val Ser Asp Ser Ser Glu210 215 220Tyr Asn Asp Lys Leu Asn Asn Ile Asn Phe Ala Leu Gly Leu Gly Val225 230 235 240Ser Glu Phe Ile Asp Tyr Asn Arg Leu Glu Asn Met Met Glu Lys Glu245 250 255Leu His Pro Leu Tyr Leu Glu Leu Tyr Ala Met Arg Arg Asn Arg Gln260 265 270Ile Gln Val Val Arg Asp Val Tyr Pro Asn Leu Glu Arg Ala Asn Ala275 280 285Val Val Glu Ser Leu Lys Thr Ile Lys Asp Ile Lys Gln Arg Gly Lys290 295 300Lys Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ile Tyr Ile Gln Arg Ser Gly Asp Val305 310 315 320Arg Lys Pro Asp Val Leu Gln Arg Phe Ile Gly Lys Tyr Gln Ser Val325 330 335Val Asp Glu Glu Lys Asn Lys Leu Gln Asp Tyr Leu Glu Ser Asp Ile340 345 350Phe Asp Ser Tyr Ser Val Asp Gly Glu Lys Ile Arg Asn Lys Glu Ile355 360 365Thr Leu Ile Asn Arg Asp Ala Tyr Leu Ser Met Ile Tyr Arg Ala Gln370 375 380Ser Ile Ser Glu Ile Lys Thr Ile Arg Ala Asp Leu Glu Ser Leu Val385 390 395 400Lys Ser Phe Gln Asn Glu Glu Ser Asp Ser Lys Val Glu Pro Glu Ser405 410 415Pro Val Lys Val Glu Lys Pro Val Asp Glu Glu Lys Pro Lys Asp Gln420 425 430Lys Lys Leu Val Asp Gln Ser Lys Pro Glu Ser Asn Ser Lys Glu Gly435 440 445Trp Ile Lys Lys Asp Asn Lys Trp Phe Tyr Ile Glu Lys Ser Gly Gly450 455 460Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Leu Asp465 470 475 480Asn Thr Gly Ala Ile Val Thr Gly Trp Lys Lys Val Ala Asn Lys Trp485 490 495Tyr Tyr Leu Glu Lys Ser Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val500 505 510Ser Asn Lys Trp Tyr Tyr Leu Glu Asn Ser Gly Ala Met Ala Thr Gly515 520 525Trp Lys Lys Val Ser Asn Lys Trp Tyr Tyr Leu Glu Asn Ser Gly Ala530 535 540Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val Ala Asn Lys Trp Tyr Tyr Leu Glu
545 550 555 560Asn Ser Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val Ser Asn Lys Trp565 570 575Tyr Tyr Leu Glu Asn Ser Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val580 585 590Ala Asn Lys Trp Tyr Tyr Leu Asp Lys Ser Gly Met Met Val Thr Gly595 600 605Ser Lys Ser Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Ala Phe Lys Asn Asp Gly Ser610 615 620Leu Lys625<210>3<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR擴增制備SpaA蛋白和ΔSpaA蛋白設(shè)計的正義引物<400>3catgccatgg ctttcgctga ttcgacagat atttctg 37<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR擴增制備ΔSpaA蛋白設(shè)計的反義引物<400>4cgcggatcct tatactttaa cgggactttc agg 33<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>為PCR擴增制備SpaA蛋白設(shè)計的反義引物<400>5cgcggatccg tctattttaa acttccatcg ttcttaaa 38<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為定點誘變法制備點突變SpaA蛋白設(shè)計的寡核苷酸<400>6ctgaagcgca ggaggatttc ttag 24<210>7<211>1748<212>DNA<213>豬丹毒桿菌<400>7tgattccact aatcggtgaa caagttggat tgctcccagt tttacctggg acagggatac 60atgctcagga atacaacaaa atgactgatg cttatattga aaatttggta tctctaatta 120atcaaaaagt gaagccgttt cttataaatg aaccaaaggg gtaccaaagt ttcgaagcag 180tgaatgaaga gattaactcg attgtaagtg aacttaaaca tgaaggaatg agtcttcaaa 240acattcacca tatgtttaaa caaagcatcc aaaacctagc aactagaatc ggctacagaa 300gttttatgca ggatgctatg tatcttgaaa attttgaaag attaacgatt cctgaacttg 360atgaagcata cgttgattta ctcgtgaatt acgaggtgaa acaccgtatt ttagtaaaat 420atgaagataa agttaaaggt agagctccat tagaagcatt tatagttcct ctaagaaata 480gaattcgtag tatgaatgaa attgctgcag aagtaaatta tttacctgaa gcgcatgagg 540atttcttagt ttcagattca agcgagtata atgacaaact aaataatatc aactttgctt 600tgggtctagg ggtcagcgag tttattgact ataaccggct cgaaaatatg atggaaaaag 660aaattcatcc attgtatctt gaactttatg ctatgcggag aaatcgccaa attcaagttg 720taagagatgt atatccaaac ttggaacgtg cgaacgcggt tgttgaatcc ttaaagacaa 780ttaaagatat aaaacaaaga gagaagaaac tacaggaact tcttgaaatt tatatccaaa 840gaagtggaga tgttcgaaaa ccagatgtac tccaacgatt tattggaaaa tatcaatcag 900
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權(quán)利要求
1.一種制備豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或其中SpaA蛋白被除去一部分后得到的縮短型ΔSpaA蛋白的變體的方法，所述變體具有免疫原性，以包涵體形式在大腸桿菌中表達，該方法包括使編碼所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因發(fā)生突變，以便在所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入氨基酸取代，使突變了的基因在大腸桿菌中表達，在所表達的變體中挑選形成包涵體的變體。
2.權(quán)利要求1所述的方法，包括下列(A)-(D)步驟(A)在編碼可溶性豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因中引入突變，以便引入氨基酸取代；(B)用含有所得到的突變基因的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞；(C)從上述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞中挑選形成不溶性包涵體的大腸桿菌細胞；和(D)培養(yǎng)所挑選的大腸桿菌細胞，回收細胞內(nèi)的包涵體。
3.權(quán)利要求2所述的方法，(D)步驟之后，進一步包括下列(E)-(F)步驟(E)給豬丹毒桿菌易感動物施用包涵體或用增溶劑處理的包涵體，然后用豬丹毒桿菌的強毒株攻擊該動物；(F)觀察該豬丹毒桿菌易感動物的存活率或死亡率，從而評判是否具有抗豬丹毒桿菌感染的保護活性(免疫原性)。
4.權(quán)利要求1-3中任何一項所述的方法，其中所述氨基酸取代是選自下述(1)-(7)中的一種或多于一種的組合(1)含有信號序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；(2)含有信號序列的N末端起第154位氨基酸被甘氨酸取代；(3)含有信號序列的N末端起第203位氨基酸被蘇氨酸取代；(4)含有信號序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；(5)含有信號序列的N末端起第253位氨基酸被蘇氨酸取代；(6)含有信號序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；和(7)含有信號序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代。
5.權(quán)利要求1-3中任何一項所述的方法，其中所述氨基酸取代選自下述(a)-(h)中的一種(a)含有信號序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；(b)含有信號序列的N末端起第203位氨基酸被蘇氨酸取代；(c)含有信號序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；(d)含有信號序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；(e)含有信號序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代；(f)含有信號序列的N末端起第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸和蘇氨酸取代；(g)含有信號序列的N末端起第214位和第253位氨基酸分別被谷氨酰胺和蘇氨酸取代；和(h)含有信號序列的N末端起第69位、第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸、甘氨酸和蘇氨酸取代。
6.權(quán)利要求1-5中任何一項所述的方法，其中所述豬丹毒桿菌選自藤澤菌株、小金井菌株、多摩96菌株、SE-9菌株和靜岡63菌株。
7.權(quán)利要求1-6中任何一項所述的方法，其中在引入所述氨基酸取代之前，SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白分別具有SEQID NO2所述氨基酸序列或除去C末端的SEQID NO2所述序列。
8.一種豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白的變體或其中SpaA蛋白被除去一部分后得到的縮短型ΔSpaA蛋白的變體，它具有免疫原性，以包涵體形式在大腸桿菌中表達。
9.權(quán)利要求8所述的變體，它具有引入了氨基酸取代的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求8或9所述的變體，用使編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因發(fā)生突變，以便在所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入氨基酸取代，使突變的基因在大腸桿菌中表達，從所表達的變體中挑選形成包涵體的變體的方法來制備。
11.權(quán)利要求8-10中任何一項所述的變體，由下列(A)-(D)步驟制備(A)在編碼可溶性豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因中引入突變，以便引入氨基酸取代；(B)用含有所得到的突變基因的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞；(C)從上述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞中挑選形成不溶性包涵體的大腸桿菌細胞；和(D)培養(yǎng)所挑選的大腸桿菌細胞，回收細胞內(nèi)的包涵體。
12.權(quán)利要求11所述的變體，其是在(D)步驟之后，進一步由下列(E)-(F)步驟制備(E)給豬丹毒桿菌易感動物施用包涵體或用增溶劑處理的包涵體，然后用豬丹毒桿菌的強毒株攻擊該動物；和(F)觀察該豬丹毒桿菌易感動物的存活率或死亡率，從而評判是否具有抗豬丹毒桿菌感染的保護活性(免疫原性)。
13.權(quán)利要求8-12中任何一項所述的變體，其中所述氨基酸取代是選自下述(1)-(7)中的一種或多于一種的組合(1)含有信號序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；(2)含有信號序列的N末端起第154位氨基酸被甘氨酸取代；(3)含有信號序列的N末端起第203位氨基酸被蘇氨酸取代；(4)含有信號序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；(5)含有信號序列的N末端起第253位氨基酸被蘇氨酸取代；(6)含有信號序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；和(7)含有信號序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代。
14.權(quán)利要求8-12中任何一項所述的變體，其中所述氨基酸取代選自下述(a)-(h)中的一種(a)含有信號序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；(b)含有信號序列的N末端起第203位氨基酸被蘇氨酸取代；(c)含有信號序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；(d)含有信號序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；(e)含有信號序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代；(f)含有信號序列的N末端起第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸和蘇氨酸取代；(g)含有信號序列的N末端起第214位和第253位氨基酸分別被谷氨酰胺和蘇氨酸取代；和(h)含有信號序列的N末端起第69位、第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸、甘氨酸和蘇氨酸取代。
15.權(quán)利要求8-14中任何一項所述的變體，它具有在SEQIDNO2所述氨基酸序列或除去C末端的SEQID NO2所述序列中引入了氨基酸取代的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求8-15中任何一項所述的變體，其中所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白來自選自藤澤菌株、小金井菌株、多摩96菌株、SE-9菌株和靜岡63菌株中的一種菌株。
17.一種組合物，它包含具有免疫原性，以包涵體形式在大腸桿菌中表達的豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白的變體或其中SpaA蛋白被除去一部分后得到的縮短型ΔSpaA蛋白的變體作為活性成分。
18.權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述變體具有引入氨基酸取代的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列。
19.權(quán)利要求17或18所述的組合物，其中所述變體用使編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因發(fā)生突變，以便在所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入氨基酸取代，使突變的基因在大腸桿菌中表達，從所表達的變體中挑選形成包涵體的變體的方法來制備。
20.權(quán)利要求17-19中任何一項所述的組合物，其中所述變體由下列(A)-(D)步驟制備(A)在編碼可溶性豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因中引入突變，以便引入氨基酸取代；(B)用含有所得到的突變基因的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞；(C)從上述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞中挑選形成不溶性包涵體的大腸桿菌細胞；和(D)培養(yǎng)所挑選的大腸桿菌細胞，回收細胞內(nèi)的包涵體。
21.權(quán)利要求20所述的組合物，其中在(D)步驟之后，所述變體進一步由下列(E)-(F)步驟制備(E)給豬丹毒桿菌易感動物施用包涵體或用增溶劑處理的包涵體，然后用豬丹毒桿菌的強毒株攻擊該動物；和(F)觀察該豬丹毒桿菌易感動物的存活率或死亡率，從而評判是否具有抗豬丹毒桿菌感染的保護活性(免疫原性)。
22.權(quán)利要求17-21中任何一項所述的組合物，其中所述變體發(fā)生的氨基酸取代是選自下述(1)-(7)中的一種或多于一種的組合(1)含有信號序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；(2)含有信號序列的N末端起第154位氨基酸被甘氨酸取代；(3)含有信號序列的N末端起第203位氨基酸被蘇氨酸取代；(4)含有信號序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；(5)含有信號序列的N末端起第253位氨基酸被蘇氨酸取代；(6)含有信號序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；和(7)含有信號序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代。
23.權(quán)利要求17-21中任何一項所述的組合物，其中所述變體發(fā)生的氨基酸取代選自下述(a)-(h)中的一種(a)含有信號序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；(b)含有信號序列的N末端起第203位氨基酸被蘇氨酸取代；(c)含有信號序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；(d)含有信號序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；(e)含有信號序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代；(f)含有信號序列的N末端起第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸和蘇氨酸取代；(g)含有信號序列的N末端起第214位和第253位氨基酸分別被谷氨酰胺和蘇氨酸取代；和(h)含有信號序列的N末端起第69位、第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸、甘氨酸和蘇氨酸取代。
24.權(quán)利要求17-23中任何一項所述的組合物，其中所述變體具有在SEQID NO2所述氨基酸序列或除去C末端的SEQID NO2所述序列中引入了氨基酸取代的氨基酸序列。
25.權(quán)利要求17-24中任何一項所述的組合物，其中所述變體來源于選自藤澤菌株、小金井菌株、多摩96菌株、SE-9菌株和靜岡63菌株中的一種菌株。
26.一種基因，它編碼具有免疫原性，以包涵體形式表達在大腸桿菌中的豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或其中SpaA蛋白被除去一部分后得到的縮短型ΔSpaA蛋白的變體。
27.權(quán)利要求26所述的基因，它編碼引入了氨基酸取代的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列。
28.權(quán)利要求26或27所述的基因，它用使編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因發(fā)生突變，以便在所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入氨基酸取代，使這樣突變的基因在大腸桿菌中表達，在所表達的變體中挑選形成包涵體的變體的方法制備。
29.權(quán)利要求26-28中任何一項所述的基因，由下列(A)-(D)步驟制備(A)在編碼可溶性豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因中引入突變，以便引入氨基酸取代；(B)用含有所得到的突變基因的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞；(C)從上述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞中挑選形成不溶性包涵體的大腸桿菌細胞；和(D)培養(yǎng)所挑選的大腸桿菌細胞，回收細胞內(nèi)的包涵體。
30.權(quán)利要求29所述的基因，繼(D)步驟之后，進一步由下列(E)-(F)步驟制備(E)給豬丹毒桿菌易感動物施用包涵體或用增溶劑處理的包涵體，然后用豬丹毒桿菌的強毒株攻擊該動物；和(F)觀察該豬丹毒桿菌易感動物的存活率或死亡率，從而評判是否具有抗豬丹毒桿菌感染的保護活性(免疫原性)。
31.權(quán)利要求26-30中任何一項所述的基因，其中所述變體發(fā)生的氨基酸取代選自下述(1)-(7)中的一種或多于一種的組合(1)含有信號序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；(2)含有信號序列的N末端起第154位氨基酸被甘氨酸取代；(3)含有信號序列的N末端起第203位氨基酸被蘇氨酸取代；(4)含有信號序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；(5)含有信號序列的N末端起第253位氨基酸被蘇氨酸取代；(6)含有信號序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；和(7)含有信號序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代。
32.權(quán)利要求26-30中任何一項所述的基因，其中所述變體發(fā)生的氨基酸取代選自下述(a)-(h)中的一種(a)含有信號序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；(b)含有信號序列的N末端起第203位氨基酸被蘇氨酸取代；(c)含有信號序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；(d)含有信號序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；(e)含有信號序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代；(f)含有信號序列的N末端起第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸和蘇氨酸取代；(g)含有信號序列的N末端起第214位和第253位氨基酸分別被谷氨酰胺和蘇氨酸取代；和(h)含有信號序列的N末端起第69位、第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸、甘氨酸和蘇氨酸取代。
33.權(quán)利要求26-32中任何一項所述的基因，它編碼在SEQID NO2所述氨基酸序列或除去C末端的SEQID NO2所述序列中引入了氨基酸取代的氨基酸序列。
34.權(quán)利要求26-33中任何一項所述的基因，它來源于選自藤澤菌株、小金井菌株、多摩96菌株、SE-9菌株和靜岡63菌株中的一種菌株。
35.權(quán)利要求26-34中任何一項所述的基因，具有一種核苷酸序列或除去一部分3’末端的核苷酸序列，它包括在SEQ ID NO1中發(fā)生選自下述(1)-(7)中的一種或多于一種的組合的核苷酸取代(1)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第206位核苷酸為G；(2)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第461位核苷酸為G；(3)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第608位核苷酸為C；(4)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第642位核苷酸為G；(5)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第758位核苷酸為C；(6)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第833位核苷酸為G；和(7)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第1591位核苷酸為G。
36.權(quán)利要求26-34中任何一項所述的基因，具有一種核苷酸序列或除去一部分3’末端的核苷酸序列，它包括在SEQ ID NO1中發(fā)生選自下述(a)-(h)中的任何一種核苷酸取代(a)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第206位核苷酸為G；(b)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第608位核苷酸為C；(c)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第642位核苷酸為G；(d)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第833位核苷酸為G；(e)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第1591位核苷酸為G；(f)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第461位和第608位核苷酸分別為G和C；(g)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第642位和第758位核苷酸分別為G和C；以及(h)SEQ ID NO1所述核苷酸序列中第206位、第461位和第608位核苷酸分別為G、G和C。
37.具有免疫原性，以包涵體形式在大腸桿菌中表達的豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或其中SpaA蛋白被除去一部分后得到的縮短型ΔSpaA蛋白的變體在制備抗豬丹毒桿菌感染的疫苗中的用途。
38.權(quán)利要求37所述的用途，其中所述變體具有引入了氨基酸取代的SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列。
39.權(quán)利要求37或38所述的用途，其中所述變體用使編碼SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因發(fā)生突變，以便在所述SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的氨基酸序列中引入氨基酸取代，使突變的基因在大腸桿菌中表達，在所表達的變體中挑選形成包涵體的變體的方法制備。
40.權(quán)利要求37-39中任何一項所述的用途，其中所述變體由下列(A)-(D)步驟制備(A)在編碼可溶性豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或ΔSpaA蛋白的基因中引入突變，以便引入氨基酸取代；(B)用含有所得到的突變基因的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞；(C)從上述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞中挑選形成不溶性包涵體的大腸桿菌細胞；和(D)培養(yǎng)所挑選的大腸桿菌細胞，回收細胞內(nèi)的包涵體。
41.權(quán)利要求40所述的用途，其中在(D)步驟之后，所述變體進一步由下列(E)-(F)步驟制備(E)給豬丹毒桿菌易感動物施用包涵體或用增溶劑處理的包涵體，然后用豬丹毒桿菌的強毒株攻擊該動物；和(F)觀察該豬丹毒桿菌易感動物的存活率或死亡率，從而評判是否具有抗豬丹毒桿菌感染的保護活性(免疫原性)。
42.權(quán)利要求37-41中任何一項所述的用途，其中所述變體發(fā)生的氨基酸取代是選自下述(1)-(7)中的一種或多于一種的組合(1)含有信號序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；(2)含有信號序列的N末端起第154位氨基酸被甘氨酸取代；(3)含有信號序列的N末端起第203位氨基酸被蘇氨酸取代；(4)含有信號序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；(5)含有信號序列的N末端起第253位氨基酸被蘇氨酸取代；(6)含有信號序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；和(7)含有信號序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代。
43.權(quán)利要求37-41中任何一項所述的用途，其中所述變體發(fā)生的氨基酸取代選自下述(a)-(h)中的一種(a)含有信號序列的N末端起第69位氨基酸被甘氨酸取代；(b)含有信號序列的N末端起第203位氨基酸被蘇氨酸取代；(c)含有信號序列的N末端起第214位氨基酸被谷氨酰胺取代；(d)含有信號序列的N末端起第278位氨基酸被甘氨酸取代；(e)含有信號序列的N末端起第531位氨基酸被甘氨酸取代；(f)含有信號序列的N末端起第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸和蘇氨酸取代；(g)含有信號序列的N末端起第214位和第253位氨基酸分別被谷氨酰胺和蘇氨酸取代；和(h)含有信號序列的N末端起第69位、第154位和第203位氨基酸分別被甘氨酸、甘氨酸和蘇氨酸取代。
44.權(quán)利要求37-43中任何一項所述的用途，其中所述變體具有在SEQID NO2所述氨基酸序列或除去C末端的SEQID NO2所述序列中引入了氨基酸取代的氨基酸序列。
45.權(quán)利要求37-44中任一項所述的用途，其中所述變體來源于選自藤澤菌株、小金井菌株、多摩96菌株、SE-9菌株和靜岡63菌株中的一種菌株。
全文摘要
提供了一種防止豬丹毒桿菌感染的豬丹毒桿菌表面保護性抗原SpaA蛋白或其中SpaA蛋白被除去一部分后得到的縮短型SpaA蛋白(ΔSpaA)的變體及其制備方法。在SpaA蛋白或SpaA蛋白的氨基酸序列的特定位點上引入氨基酸取代得到具有免疫原性，以包涵體形式在大腸桿菌中表達的SpaA蛋白或SpaA蛋白變體。由于本發(fā)明SpaA蛋白或SpaA蛋白變體以包涵體形式在大腸桿菌中表達，可容易地回收和純化。
文檔編號C12P21/02GK101031647SQ20058001359
公開日2007年9月5日 申請日期2005年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月27日
發(fā)明者牛島稔大, 坂口正士, 德永英治 申請人:財團法人化學(xué)及血清療法研究所