專利名稱：對(duì)大腸桿菌0108型的0－抗原特異的核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大腸桿菌O108型(Escherichia coli O108)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特別是涉及大腸桿菌O108型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用這些對(duì)O-抗原特異的寡核苷酸快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)人體及環(huán)境中的大腸桿菌O108型并鑒定這些致病菌中的O-抗原。
背景技術(shù)：
O-抗原是革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖中的O特異性多糖成分，它由許多重復(fù)的寡糖單位組成。O-抗原的合成過程研究得較清楚先由糖基轉(zhuǎn)移酶將核苷二磷酸單糖轉(zhuǎn)移到一個(gè)固定在細(xì)胞內(nèi)膜的脂分子上，然后在內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)合成寡糖單位，O-抗原的寡糖單位再通過轉(zhuǎn)運(yùn)酶被轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜外側(cè)，而后通過聚合酶聚合成多糖，再被連接到一個(gè)糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena(1993)“Genetics of lipopolysaccharidebiosynthesis in entericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。編碼負(fù)責(zé)O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色體上相鄰排列，形成一個(gè)基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在志賀氏菌、大腸桿菌和沙門氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之間[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“TheEscherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgeneclusters encoding the same colitose-containing O antigen are highlyconserved”.Journal of Bacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三類基因糖合成路徑基因，糖基轉(zhuǎn)移酶基因，寡糖單位處理基因，其中糖合成路徑基因編碼的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸單糖；糖基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的酶將核苷二磷酸單糖及其它分子轉(zhuǎn)到單糖上從而使單糖聚合成寡糖單位；寡糖單位處理基因包括轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，它們將寡糖單位轉(zhuǎn)移到細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)，再聚合成多糖。糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因只存在于攜帶這些基因的基因簇里。O-抗原中單糖的不同，單糖間聯(lián)結(jié)鍵的不同和寡糖單位之間聯(lián)結(jié)鍵的不同構(gòu)成了O-抗原的多樣性，而單糖的組成、單糖間的聯(lián)結(jié)鍵及寡糖單位之間的聯(lián)結(jié)鍵是由O-抗原基因簇中的基因控制著，所以O(shè)-抗原基因簇決定了O-抗原的合成，也決定了O-抗原的多樣性。
因?yàn)镺-抗原是極強(qiáng)的抗原，是大腸桿菌重要的致病因素之一，同時(shí)它又具有極強(qiáng)的多樣性，這啟示我們能研究一種快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)大腸桿菌及其O-抗原的特異性好、靈敏度高的方法。以表面多糖為目標(biāo)的血清學(xué)免疫反應(yīng)自上世紀(jì)30年代以來一直被用于對(duì)細(xì)菌的分型和鑒定，是鑒定致病菌的唯一的手段。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和儲(chǔ)存中也存在一些困難。另一方面此法耗時(shí)長、靈敏度低、漏檢率高、準(zhǔn)確性差，所以，現(xiàn)在普遍認(rèn)為這種傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法將為現(xiàn)代分子生物學(xué)方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙門氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特異核苷酸序列通過PCR方法鑒定了沙門氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是將相應(yīng)于沙門氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原內(nèi)的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到對(duì)不同血清型的沙門氏菌特異的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用對(duì)E.coli O111的O-抗原特異的源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定了一株產(chǎn)毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak ofHemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated withShiga-like toxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后來的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定E.coli O111的血清型的方法有假陽性結(jié)果出現(xiàn)。Bastin D.A.and Reeves，P.R.認(rèn)為，這是由于wbdI基因是一個(gè)推測(cè)的糖合成路徑基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 16417-23]，而在其它細(xì)菌的O-抗原的結(jié)構(gòu)中也可能有這個(gè)糖，所以糖合成路徑基因?qū)τ贠-抗原并不是高度特異的志賀氏菌有46種血清型，但只有33種不同的O-抗原，大腸桿菌有166種不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，nichespecific selection and bacterial populations”.FEMSMicrobiol.Lett，100509-516]，二者親緣關(guān)系非常近，并且有12種是大腸桿菌和志賀氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identificationof the Enterobacteriaceae”.Elsevier Science Publishers，Amsterdam，TheNetherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between theenteroinvasive Escherichia coli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152and and Shigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)681-684]

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸。它是大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因和轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因及聚合酶基因的特異的核苷酸。
本發(fā)明的次一目的是提供了大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列。
本發(fā)明的另一目的是提供了構(gòu)成大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的基因轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf13、wbuB基因。
本發(fā)明的又一目的是提供了寡核苷酸，它們分別源于大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因包括orf13、wbuB基因；源于編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因；源于編碼聚合酶的基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；它們是上述基因內(nèi)的寡核苷酸，長度在10-20nt；它們對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原是特異的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它們對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原是高度特異的，而且這些寡核苷酸還可重新組合，組合后的寡核苷酸對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原也是高度特異的。
本發(fā)明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列，從而通過這些方法檢測(cè)和鑒定大腸桿菌O108型的O-抗原及檢測(cè)和鑒定大腸桿菌O108型。本發(fā)明的還一目的是提供了分離大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以獲得其他細(xì)菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以獲得編碼其他多糖抗原的細(xì)菌的基因簇的全序列。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長21225個(gè)堿基；或者所述具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸，其中包括命名為orf1，orf2，orf3，orf4，orf5，orf6，orf7，orf8，orf9，orf10，wzx，wzy，orf13，fn11，fn12，fn13，wbuB，wbuC的18個(gè)基因組成，位于galF基因和gnd基因間。
前述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸，其中所述基因中具有高度特異性的基因是轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因，其包括wzx基因；聚合酶基因，其包括wzy基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其包括orf13、wbuB基因；其中所述的基因wzx是SEQ ID NO1中的11613至12815堿基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的12835至14073堿基的核苷酸；orf13是SEQ ID NO1中的14124至15224堿基的核苷酸；wbuB是SEQ ID NO1中的18517至19728堿基的核苷酸。。
前述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸，其中還包括源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基轉(zhuǎn)移酶基因orf13、wbuB基因以及它們的混合或它們的重組。
前述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其中源于wzx基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的11775至11792堿基的核苷酸和12638至12655堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的12344至12361堿基的核苷酸和12748至12766堿基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ IDNO1中的13194至13213堿基的核苷酸和14012至14029堿基的核苷酸；SEQID NO1中的13605至13623堿基的核苷酸和13940至13957堿基的核苷酸。
前述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸在檢測(cè)表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原中的應(yīng)用。
前述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達(dá)而提供表達(dá)大腸桿菌O108型的O-抗原，以及制備細(xì)菌疫苗中的應(yīng)用。
前述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其特征在于，它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測(cè)、或者用于制造基因芯片或微陣列，供檢測(cè)細(xì)菌的應(yīng)用。
前述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌O108型，離心收集細(xì)胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O108型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O108型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，將得到的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并該long PCR產(chǎn)物，并用DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫將Long PCR純化產(chǎn)物應(yīng)用鳥槍法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；(4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的克隆用實(shí)驗(yàn)室常用的DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段進(jìn)行測(cè)序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析應(yīng)用生物信息學(xué)軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；(6)特異基因的篩選針對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，確定wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O108型的O-抗原的高度特異性；(7)引物靈敏度的檢測(cè)培養(yǎng)大腸桿菌O108，細(xì)菌計(jì)數(shù)后分別將5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌加入到一定量的某種待檢測(cè)物中，混入細(xì)菌的待檢測(cè)物作為檢測(cè)用樣品，將樣品加入LB培養(yǎng)基，取一些與樣品混合過的LB培養(yǎng)基過濾，將過濾液進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)毫升處理后作為PCR模板用寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)其對(duì)大腸桿菌O108的靈敏度。
前述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O108型，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘，加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚。上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，將DNA重懸于30ul TE中；基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O108型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O108型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動(dòng)子區(qū)的galF序列設(shè)計(jì)上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCAGGG ATC AAA GAA AT)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并5管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫，反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行，酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)。合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中，隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3’端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接10小時(shí)，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶，最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物；用BiO-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到BiO-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒至6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒，并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇文庫；(4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的96個(gè)克隆用本實(shí)驗(yàn)室ABI3730型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段進(jìn)行測(cè)序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對(duì)大腸桿菌O108型的基因組作5個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫，2)對(duì)每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率，在得到大腸桿菌O108型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到8個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對(duì)，最后得到大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；(6)特異基因篩選針對(duì)痢大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，除在含大腸桿菌O108組中得到了預(yù)期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到預(yù)期片段大小的正確產(chǎn)物，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O108型的O-抗原都是高度特異的。
(7)引物靈敏度的檢測(cè)購買市場(chǎng)上的生豬肉餡，攪拌均勻，分成20g一份，存在-40℃冰箱中備用。將10μl大腸桿菌O108的凍存菌液接種到有20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12小時(shí)至飽和，取少量培養(yǎng)好的菌液作106和107倍的稀釋，其余的菌液放于4℃的冰箱中備用，取50μl稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，37度，培養(yǎng)12h，對(duì)所涂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度。在5份生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入200ml LB培養(yǎng)基，經(jīng)6層紗布過濾，過濾液于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12h。從培養(yǎng)好的菌液中取3ml菌液于6,000g離心5分鐘，去上清，加100μl MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100度沸水中煮15分鐘，裂解液于12,000g離心8分鐘，取lμ上清做為PCR模板。用4對(duì)寡核苷酸對(duì)，SEQ ID NO1中的11775至11792堿基的核苷酸和12638至12655堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的12344至12361堿基的核苷酸和12748至12766堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的13194至13213堿基的核苷酸和14012至14029堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的13605至13623堿基的核苷酸和13940至13957堿基的核苷酸，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性。參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果。參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果。說明使用上述方法時(shí)，這4對(duì)引物對(duì)豬肉餡中的大腸桿菌O108的檢測(cè)靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
也就是，本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全長21225個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通過本發(fā)明的方法得到了大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，如表3所示，它包括命名為orf1、orf2、orf3、orf4、orf5、orf6、orf7、orf8、orf9、orf10、wzx、wzy、orf13、fn11、fn12、fn13、wbuB、wbuC的8個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇中的基因，即轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因(wzx基因或與wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或與wzy有相似功能的基因)；糖基轉(zhuǎn)移酶基因(orf13、wbuB基因)。它們?cè)贠-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中；本發(fā)明尤其涉及到糖基轉(zhuǎn)移酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，因?yàn)樘呛铣陕窂交蚣春铣珊塑斩姿釂翁堑幕颥F(xiàn)在被預(yù)示對(duì)較多胞外多糖是常見的、共同的，對(duì)細(xì)菌的O-抗原并不是很特異的，而本發(fā)明涉及到的糖基轉(zhuǎn)移酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因?qū)Υ竽c桿菌O108型的O-抗原是高度特異的。
本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了源于大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇中的wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因和糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf13、wbuB基因的寡核苷酸，它們是這些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，優(yōu)先被用的是列于表1中的寡核苷酸對(duì)，在表1中也列出了這些寡核苷酸對(duì)在O-抗原基因簇中的位置及以這些寡核苷酸對(duì)為引物所做的PCR反應(yīng)的產(chǎn)物的大小，這些PCR反應(yīng)可用表中的退火溫度進(jìn)行。這些引物除在第13組中得到了預(yù)期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到任何產(chǎn)物，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O108型的O-抗原是高度特異的。
所述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法包括下述步驟1)基因組的提??；2)PCR擴(kuò)增大腸桿菌O108型中的O-抗原基因簇；3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特異基因的篩選；7)引物靈敏度的檢測(cè)。
本發(fā)明的其他方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
如本發(fā)明所用，“寡核苷酸”主要指來源于O-抗原基因簇中的編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因和編碼聚合酶的基因內(nèi)的一段核苷酸分子，它們?cè)陂L度上可改變，一般在10到20個(gè)核苷酸范圍內(nèi)改變；更確切說這些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1中的11613至12815堿基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1中的12835至14073堿基的核苷酸)；源于以上基因內(nèi)的寡核苷酸對(duì)大腸桿菌O108型是高度特異的。
此外，有時(shí)兩個(gè)遺傳相似的編碼不同O-抗原的基因簇通過基因重組或突變產(chǎn)生新的O-抗原，從而產(chǎn)生新的細(xì)菌類型，新的突變株。在這種環(huán)境中，需要篩選出多對(duì)寡核苷酸同重組基因雜交以提高檢測(cè)的特異性。因此，本發(fā)明提供了一整套多對(duì)寡核苷酸的混合物，它們?cè)从谔腔D(zhuǎn)移酶基因；源于轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。這些基因的混合物對(duì)一個(gè)特殊的細(xì)菌多糖抗原來說是特異的，從而使這套寡核苷酸對(duì)這個(gè)細(xì)菌的多糖抗原是特異的。更具體地說，這些寡核苷酸的混合物是源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因、wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的組合。
在另一方面，本發(fā)明涉及寡核苷酸的鑒定，它們可以用于檢測(cè)表達(dá)O-抗原的細(xì)菌和在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原。
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)食品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可使樣品能與以下至少一個(gè)基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是大腸桿菌O108型?？捎肞CR方法檢測(cè)，更可將本發(fā)明方法中的核苷酸標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測(cè)，或通過基因芯片或微陣列檢測(cè)樣品中的抗原及細(xì)菌。
本發(fā)明設(shè)計(jì)者考慮到以下情況當(dāng)單個(gè)的特異的寡核苷酸檢測(cè)無效時(shí)，寡核苷酸的混合物能與靶區(qū)域特異性雜交以檢測(cè)樣品。因此本發(fā)明提供了一套寡核苷酸用于本發(fā)明所述的檢測(cè)方法。這里所說的寡核苷酸是指源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。這套寡核苷酸對(duì)一個(gè)特殊的細(xì)菌的O-抗原來說是特異的，這一特殊的細(xì)菌O-抗原是由大腸桿菌O108型表達(dá)的。
另一方面，本發(fā)明涉及到一種檢測(cè)排泄物中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交。這些細(xì)菌是大腸桿菌O108型?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測(cè)樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸分子標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測(cè)，或者通過基因芯片或微陣列檢測(cè)樣品中的抗原及細(xì)菌。
一般一對(duì)寡核苷酸可能與同樣的基因雜交也可與不同的基因雜交，但它們中必須有一個(gè)寡核苷酸能特異性雜交到特殊抗原型的特異序列上，另一個(gè)寡核苷酸可雜交于非特異性區(qū)域。因此，當(dāng)特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新組合時(shí)，至少能選出一對(duì)寡核苷酸與多糖抗原基因簇中特異基因混合物雜交，或者選出多對(duì)寡核苷酸與特異基因的混合物雜交。甚至即使當(dāng)一個(gè)特殊的基因簇中所有基因都獨(dú)一無二時(shí)，此方法也能應(yīng)用于識(shí)別此基因簇內(nèi)的基因混合物的核苷酸分子。因此本發(fā)明提供了一整套用于檢測(cè)本發(fā)明方法的多對(duì)寡核苷酸，在這里多對(duì)寡核苷酸是源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因，這套寡核苷酸對(duì)一個(gè)特殊的細(xì)菌多糖來說是特異的，這套寡核苷酸可能是糖合成中必須基因的核苷酸。
另一方面，本發(fā)明也涉及到一種檢測(cè)源于病人的樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法。樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因中的一對(duì)寡核苷酸中的一個(gè)特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與樣品中的至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是大腸桿菌O108型?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測(cè)樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)，或者通過基因芯片或微陣列檢測(cè)樣品中的抗原及細(xì)菌。
更詳細(xì)地說，以上描述的方法可以理解為當(dāng)寡核苷酸對(duì)被使用時(shí)，其中的一個(gè)寡核苷酸分子能雜交到一個(gè)并不是來源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因、wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的序列上。此外，當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸都能雜交上時(shí)，它們可能雜交于同一基因也可能雜交到不同基因上。也即，當(dāng)交叉反應(yīng)出現(xiàn)問題時(shí)，可選擇寡核苷酸的混合物來檢測(cè)混合的基因以提供檢測(cè)的特異性。
本發(fā)明者相信本發(fā)明不必限于以上所提的核苷酸序列編碼的特定的O-抗原，而且廣泛應(yīng)用于檢測(cè)所有表達(dá)O-抗原和鑒定O-抗原的細(xì)菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如細(xì)菌胞外抗原)合成之間的相似性，本發(fā)明的方法和分子也應(yīng)用于這些其他的多糖抗原。
本發(fā)明首次公開了大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的全長序列，而且可從這個(gè)未被克隆的全長基因簇的序列中產(chǎn)生重組分子，通過插入表達(dá)可產(chǎn)生表達(dá)大腸桿菌O108型的O-抗原，并成為有用的疫苗。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件。
實(shí)施例1基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O108型，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中?；蚪MDNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
實(shí)施例2通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O108型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O108型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇。首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動(dòng)子區(qū)的galF序列設(shè)計(jì)上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCGC)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性。合并5管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例3構(gòu)建O-抗原基因簇文庫首先是連接產(chǎn)物的獲得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫。反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行。酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)。合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中。隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3’端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接10小時(shí)，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物。
其次是感受態(tài)細(xì)胞的制備參照Bio-Rad公司提供的方法制備感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α。取一環(huán)大腸桿菌DH5α單菌落于5ml的LB培養(yǎng)基中，180rpm培養(yǎng)10小時(shí)后，取2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到200ml的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm劇烈振蕩培養(yǎng)到OD600 0.5左右，然后冰浴冷卻20分鐘，于4℃ 4000rpm離心15分鐘。傾盡上清，用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水200ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分鐘。再用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水100ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分鐘。用冷的冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，4℃6000rpm離心10分鐘，棄上清，最后沉淀用1ml冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞。將制得的感受態(tài)細(xì)胞分裝為50ul一管，-70℃保存。
最后是電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒-6.0毫秒。電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇。然后立即將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃倒置過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇文庫。
實(shí)施例4對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的96個(gè)克隆用本實(shí)驗(yàn)室ABI3730型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段單向進(jìn)行測(cè)序，使序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。
實(shí)施例5核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列(見序列列表)。序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對(duì)大腸桿菌O108型的基因組作5個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對(duì)每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到大腸桿菌O108型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到8個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對(duì)，最后得到大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，如表3所示。
通過檢索和比較，發(fā)現(xiàn)orf1編碼的蛋白與Vibrio vulnificus CMCP6中編碼的nucleoside-diphosphate sugarepimerases有85％的氨基酸序列一致性和91％的相似性，通過對(duì)Pfam蛋白基序數(shù)據(jù)庫的搜索，發(fā)現(xiàn)orf1編碼的蛋白與已知的nucleoside-diphosphate sugarepimerases的共有序列的同源性預(yù)期值為1.5×e-3。由于這個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這個(gè)基因暫命名為orf1。Orf2編碼的蛋白與Vibrio vulnificus CMCP6中編碼的aminotransferase有73％的氨基酸序列一致性和87％的相似性，通過對(duì)Pfam蛋白基序數(shù)據(jù)庫的搜索，發(fā)現(xiàn)orf2編碼的蛋白與已知的aminotransferase的共有序列的同源性預(yù)期值為9.3×e-76。由于這個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這個(gè)基因暫命名為orf2。Orf3編碼的蛋白與Vibrioparahaemolyticus中編碼的UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase有77％的氨基酸序列一致性和87％的相似性，通過對(duì)Pfam蛋白基序數(shù)據(jù)庫的搜索，發(fā)現(xiàn)orf3編碼的蛋白與已知的UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase的共有序列的同源性預(yù)期值為3.1×e-93。由于這個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這個(gè)基因暫命名為orf3。Orf4編碼的蛋白與Vibrio vulnificusYJ016中編碼的NeuB sialic acid synthase有81％的氨基酸序列一致性和92％的相似性，通過對(duì)Pfam蛋白基序數(shù)據(jù)庫的搜索，發(fā)現(xiàn)orf4編碼的蛋白與已知的NeuB sialic acid synthase的共有序列的同源性預(yù)期值為2.4×e-95。由于這個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這個(gè)基因暫命名為orf4。Orf5編碼的蛋白與vibrio vulnificus YJ016中編碼的acetyltransferase有47％的氨基酸序列一致性和68％的相似性，通過對(duì)Pfam蛋白基序數(shù)據(jù)庫的搜索，發(fā)現(xiàn)orf5編碼的蛋白與已知的acetyltransferase的共有序列的同源性預(yù)期值為1.3×e-10。由于這個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這個(gè)基因暫命名為orf5。Orf6編碼的蛋白與Vibrio parahaemolyticus中編碼的nucleotide transferase有68％的氨基酸序列一致性和80％的相似性，通過對(duì)Pfam蛋白基序數(shù)據(jù)庫的搜索，發(fā)現(xiàn)orf6編碼的蛋白與已知的nucleotidetransferase的共有序列的同源性預(yù)期值為1.3×e-30。由于這個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這個(gè)基因暫命名為orf6。Orf7編碼的蛋白與Vibriovulnificus YJ016中編碼的dehydrogenase有51％的氨基酸序列一致性和72％的相似性，通過對(duì)Pfam蛋白基序數(shù)據(jù)庫的搜索，發(fā)現(xiàn)orf7編碼的蛋白與已知的dehydrogenase的共有序列的同源性預(yù)期值為2.9×e-15。由于這個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這個(gè)基因暫命名為orf7。 Orf8編碼的蛋白與Vibrio vulnificus YJ016中編碼的CMP-N-acetylneuraminic acidsynthetase有63％的氨基酸序列一致性和73％的相似性，通過對(duì)Pfam蛋白基序數(shù)據(jù)庫的搜索，發(fā)現(xiàn)orf8編碼的蛋白與已知的CMP-N-acetylneuraminicacid synthetase的共有序列的同源性預(yù)期值為1.6×e-5。由于這個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這個(gè)基因暫命名為orf8。 Orf9編碼的蛋白與Vibrio vulnificus YJ016中編碼的dehydrogenase有63％的氨基酸序列一致性和78％的相似性，通過對(duì)Pfam蛋白基序數(shù)據(jù)庫的搜索，發(fā)現(xiàn)orf9編碼的蛋白與已知的dehydrogenase的共有序列的同源性預(yù)期值為1.2×e-6。由于這個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這個(gè)基因暫命名為orf9。Orf10編碼的蛋白通過檢索比較并未發(fā)現(xiàn)其確定的功能，所以我們將這個(gè)基因暫命名為orf10。
Orf11和orf12是大腸桿菌O108中僅有的兩個(gè)編碼存在跨膜片段的蛋白的基因。Orf11編碼的蛋白與Salmonella enterica的O-抗原轉(zhuǎn)移酶有23％的序列一致性，44％的相似性，通過HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其含有11個(gè)均勻的跨膜片段，這是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf11為wzx。Orf12編碼的蛋白與Salmonella enterica的O-抗原聚合酶有22％的一致性，46％的相似性，通過HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其含有9個(gè)跨膜片段，并且有一個(gè)大的胞質(zhì)內(nèi)親水環(huán)(loop)，這是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf12為wzy。
Orf13、orf17兩個(gè)基因編碼的蛋白與其他已知的糖基轉(zhuǎn)移酶分別有24％、33％的序列一致性和42％、84％的序列相似性。通過對(duì)Pfam中糖基轉(zhuǎn)移酶基序數(shù)據(jù)庫的搜索，這兩個(gè)基因編碼的蛋白與已知的糖基轉(zhuǎn)移酶家族1的共有序列的同源性預(yù)期值為2.8×e-5、1.6×e-4，因此我們推測(cè)這兩個(gè)基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，而且由于每個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶特異性催化形成一種二糖鍵，因此我們推測(cè)大腸桿菌O108的O-抗原的寡糖單位可能由三個(gè)單糖組成。由于orf13這個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這個(gè)基因暫命名為orf13。而orf17這個(gè)基因編碼的蛋白與Escherichia coli中編碼的wbuB L-fucosaminetransferase有72％的氨基酸序列一致性和84％的相似性，因此我們將這個(gè)基因暫命名為wbuB。
Orf14，15，16編碼的蛋白與Escherichia coliO-抗原基因簇中fnl1，2，3基因編碼的蛋白有很高的氨基酸序列一致性(72％-89％)，通過對(duì)Pfam蛋白基序數(shù)據(jù)庫的搜索，發(fā)現(xiàn)orf14，15，16編碼的蛋白與已知的Fnl1，2，3蛋白的共有序列的同源性預(yù)期值非常高，因此我們將這三個(gè)基因暫命名為fnl1，2，3。Orf18編碼的蛋白與Escherichia coli(AAN60465)O-抗原基因簇中編碼的WbuC蛋白有68％的氨基酸序列一致性和87％的相似性，由于這個(gè)基因的確切功能還不能確定，因此我們將這個(gè)基因暫命名為orf18。
實(shí)施例6特異基因的篩選。
針對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設(shè)計(jì)引物，在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，除在含大腸桿菌O108組中得到了預(yù)期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到預(yù)期片段大小的正確產(chǎn)物，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O108型的O-抗原都是高度特異的；這些基因在核苷酸序列中的位置見表1。
實(shí)施例7引物靈敏度的檢測(cè)。
購買市場(chǎng)上的生豬肉餡，攪拌均勻，分成20g一份，存在-40℃冰箱中備用。將10μl大腸桿菌O108的凍存菌液接種到有20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12小時(shí)至飽和，取少量培養(yǎng)好的菌液作106和107倍的稀釋，其余的菌液放于4℃的冰箱中備用，取50μl稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，37度，培養(yǎng)12h，對(duì)所涂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度。在5份生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入200ml LB培養(yǎng)基，經(jīng)6層紗布過濾，過濾液于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12h。從培養(yǎng)好的菌液中取3ml菌液于6,000g離心5分鐘，去上清，加100μl MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100度沸水中煮15分鐘，裂解液于12,000g離心8分鐘，取1μ上清做為PCR模板。用4對(duì)寡核苷酸對(duì)，SEQ ID NO1中的11775至11792堿基的核苷酸和12638至12655堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的12344至12361堿基的核苷酸和12748至12766堿基的核苷酸；SEQ IDNO1中的13194至13213堿基的核苷酸和14012至14029堿基的核苷酸；SEQID NO1中的13605至13623堿基的核苷酸和13940至13957堿基的核苷酸，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性。參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果。參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果。說明使用上述方法時(shí)，這4對(duì)引物對(duì)豬肉餡中的大腸桿菌O108的檢測(cè)靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
通過對(duì)O抗原基因簇的克隆和在減毒的疫苗菌株中的表達(dá)，可以組建重組疫苗。O抗原為最主要的革蘭氏陰性菌的表面抗原，可以引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，是制造重組疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret實(shí)驗(yàn)室成功的將志賀氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙門氏菌Tyziai疫苗菌中表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明可以引起兔子的免疫反應(yīng)(Molecular Microbiology1993，7239-252)。中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的小組也在從事與Viret實(shí)驗(yàn)室類似的工作。王磊實(shí)驗(yàn)室在1999年成功的將大腸桿菌O111的O抗原基因簇在沙門氏菌疫苗STM-1中表達(dá)，并證明組建成的菌株可以引起小鼠的血液和體液反應(yīng)(Microbial Pathogenesis 1999，2755-59)。所以本發(fā)明O108的O抗原特異基因序列可以應(yīng)用于組建重組疫苗。
當(dāng)分子探針核苷酸序列與靶DNA序列同源性大于85％時(shí)，可以準(zhǔn)確的將目的序列雜交出來。在低嚴(yán)謹(jǐn)性的Southern雜交中要求兩者的同源性大于65％(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，第509頁，低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交)。本發(fā)明中的特異核苷酸序列在Genebank中的同源性搜索顯示沒有同源性大于65％的其他基因存在。所以在雜交實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明中的特異核苷酸序列作為分子探針將只能對(duì)目的細(xì)菌得出陽性結(jié)果。Southern雜交法對(duì)于分子探針的長度并沒有嚴(yán)格要求，本發(fā)明中的特異核苷酸序列中從20bp或以上的寡核苷酸到整個(gè)序列都可以在雜交中應(yīng)用。在一項(xiàng)Southern實(shí)驗(yàn)中，利用沙門氏菌的相關(guān)特異基因(1000bp以上)做分子探針，成功的分辨出該細(xì)菌(Liu D，Verma NK，RomanaLK，Reeves PR.，1991 Relationships among the rfb regions of Salmonellaserovars A，B，and D.J Bacteriol.173(15)4814-4819.)，很多本領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)都表明1000-2000bp左右的基因序列可以用做分子探針?；蛐酒cSouthern雜交法的原理一樣，在選用分子探針的要求上也相似，所以本發(fā)明中的特異核苷酸序列以及其中的寡核苷酸片段都可以在雜交反應(yīng)中作為分子探針檢測(cè)該目的細(xì)菌，包括Southern、基因芯片等多種雜交的常規(guī)方法。
根據(jù)本發(fā)明的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸序列(SEQ IDNO1所示)，構(gòu)造特異核酸探針，將其固定到芯片的載體上制成生物芯片，將要檢測(cè)的樣品適當(dāng)處理后，與生物芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后利用生物芯片信號(hào)分析設(shè)備就可以得到樣品中相應(yīng)的細(xì)菌情況。這種大腸桿菌O抗原鑒定的DNA芯片將可以直接用于臨床和其它檢驗(yàn)場(chǎng)所(如食品加工和生產(chǎn)行業(yè)，畜牧獸醫(yī)行業(yè)海關(guān)檢疫等的微生物檢驗(yàn))。這種芯片只需要擴(kuò)大產(chǎn)量，在完全相同的條件下就可以產(chǎn)業(yè)化。
表1列出了大腸桿菌O108型的O抗原基因簇中寡糖單位處理基因及基因內(nèi)的引物及PCR數(shù)據(jù)。在表中列出了大腸桿菌O108型的O抗原基因簇的轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因及它們的相應(yīng)的功能和大小。在每個(gè)基因內(nèi)，我們各設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方以確保其特異性。在表中還列出了每個(gè)引物在SEQ ID NO1中的位置和大小。以每對(duì)引物用表中所列的相應(yīng)的退火溫度以表2中的所有菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，得到了相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，其大小也列于表中。
表2是用于篩選特異基因的166株大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源，為了檢測(cè)的方便，我們將它們每12-19個(gè)菌分為一組，總共12組，它們的來源都列于表中。
在第13組中含有大腸桿菌O108型的基因組DNA作為陽性對(duì)照。以每組菌做模板，用表1中的每對(duì)引物按如下條件做PCR在95℃預(yù)變性5分鐘后，95℃變性30秒，退火時(shí)間是30秒，溫度見表1，72℃延伸2分鐘，這樣進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。最后在72℃繼續(xù)延伸5分鐘，反應(yīng)體系是25ul。模板為1∶20稀釋，取1μl。反應(yīng)完畢后，取10ulPCR產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增出的片段。
對(duì)于wzx、wzy基因，每個(gè)基因都有兩對(duì)引物被檢測(cè)，每對(duì)引物除了在第13組中做PCR后得到了預(yù)期大小的正確的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到任何大小正確的帶，也就是說，在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O108型及其O-抗原是高度特異的。
最后，通過PCR從大腸桿菌O108型中篩選到對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原高度特異的基因轉(zhuǎn)移酶基因(wzx基因)和轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因(wzy基因)。而這些基因內(nèi)的任何一段10-20nt的寡核苷酸對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原是特異的，尤其是上述每個(gè)基因中的引物即寡核苷酸對(duì)經(jīng)PCR檢測(cè)后證實(shí)對(duì)大腸桿菌O108型是高度特異的。所有的這些寡核苷酸都可用于快速準(zhǔn)確地檢測(cè)人體和環(huán)境中的大腸桿菌O108型，并能鑒定它們的O-抗原。
表3是大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)表，在表中列出了大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，共由12個(gè)基因組成，每個(gè)基因用方框表示，并在方框內(nèi)寫入基因的名稱，數(shù)字表示的是O-抗原基因簇中的開放閱讀框(orf)的順序。在O-抗原基因簇的兩端是galF基因和gnd基因，它們不屬于O-抗原基因簇，我們只是用它們的一段序列設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增O-抗原基因簇的全長序列。
表4是大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇中的基因的位置圖，在圖中列出了大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇中的所有開放閱讀框在全序列中的準(zhǔn)確位置，在每個(gè)開放閱讀框的起始密碼子和終止密碼子的下面劃線。在大腸桿菌中開放閱讀框的起始密碼子有兩個(gè)ATG和GTG。
SEQ ID NO1序列(SEQUENCE LISTING)<110>天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司<120>對(duì)大腸桿菌O108型的O抗原特異的核苷酸<130>對(duì)大腸桿菌O108型的O抗原特異的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>21225
<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgagcagcg cgtgaagcgt120caactactgg cggaagtaca gtccatttgc ccgccgggag tgaccattat gaacgtgcgt180cagggcgaac ctttaggttt gggccactcc attttatgtg cacgacccgc cattggtgac240aattcatttg tcgtggtgct gccagacgt tgtgatcgatg acgccagcgc cgacccgctg300cgctacaacc ttgcggccat gattgcgcgc ttcaacgaaa cgggccgcag ccaggtgctg360gcaaaacgta tgccaggtga cctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agagccgctg420gaccgcgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag480acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg540gaacttgaac gcactcagcc aggtgcatgg ggacgtatcc aactgacaga tgccattgcc600gaactggcga aaaaacagtc tgttgatgca atgctgatga ctggtgacag ctacgactgc660ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttc gtgaagtatg gattgcgtaa cctgaaagaa720gggccgaaat tccagaaaag cattgaaaaa ttgcttagtg agtaagacca caaattagcc780agtttgattg actaaaaatc tataaacagc agttaacatt cgaggcagtg atgccggtaa840gaaaagaatg tttctgccgt ttttgctgaa aggtgtttgt tttcattgag ttagctacaa900aattttgaac tggattttgt agtatttctt cttgtttccg acaccgaatg gtaagacaat960tagtgtttga gtttagaggc tttgcgactg aaagcagagt tcaacacgtc tatgaaagtt1020cgcagtgcac tggtagctgt taagccaggg gcggtagcgt atcaattttc tggcttgatg1080ctaattaaaa ccgaaggttt cccccggttt tttaagaatg tcaatatata tgaaacgatt1140gcagccacga aatttttttt gactgaagcc gttttgacct gaatataatg agtaacaaac1200tggatctcga aatgtataat atcctccaat tgattgggcg taataaagaa ttattcagtg1260atgatgtttc tgaaaatgaa aaagaattaa aaaaaatcgt ttccgaatca cgcttccttg1320tacttggcgg tgctggctct attggtcagg ctgttgtaaa agaaatattt aaacgcaatc1380ctcagaaact gcatgttgtc gatattagcg aaaacaacat ggttgagttg gttcgtgata1440tacgcagttc cttcggttat attgctggtg atttccagac gttcgcgctt gatatcggct1500ctgtagaata cgacgctttt atcaaagctg acggtaaata tgattacgtt ctgaatttat1560ctgccctgaa acatgttcgc agtgagaaag atccgtttac cctgatgcgc atgattgaag1620tcaatattct caatactgac aaaaccattg agcagtctat tgctgctggc gttaagaaat1680tcttctgcgt atcgaccgac aaggccgcga atccggtaaa tatgatgggc gcttctaagc1740gtattatgga aatgttcctg atgcgtaaaa gtgaacaaat cgccatctct actgcacgtt1800tcgcgaacgt agccttttct gatggctccc ttctgcatgg gttcaatcaa cgcctccaca1860agcagcaacc cctggttgca ccgaatgata tcaagcgtta tttcgtcacc cctcaggaat1920caggtgagct ctgtctgatg tcatgtattt ttggtgataa tcgtgacatc ttcttcccga1980aactgagtga agcattacac ctcatttctt ttgccgatat tgcggttctc taccttaagc2040aacgtggtta tgagcctcat ctttgtgaaa ccgaagacga agctcgtgag cttgctaaaa2100ccctgccagc acaaggtaaa tggccatgtt tgtttacctc aagtgatacg acaggtgaga2160aagatttcga ggagttcttc accgataatg aaacgcttga tatggagcgt tttaacaatc2220tgggcattat caagaatgaa cctttatatg accctgcgct tctggcccac tttgaagaac2280gtatcgaaga gatgaaagca tctctggaat ggaataaaga cgatattgta aaactgtttt2340ttgaaatgat ccctgacttc agacataaag aaacaggtaa atacctcgac agcaaaatgt2400aagcaaggca tccccgaatg aatatcaaat caattatcga atttgttcgc gacgtataca2460aaacggatga atttattcct ttgcatgcgc cagtgtttaa tggcaacgaa aaaaaatatg2520ttctggatac tctggacagt actttcgtgt cgagcgtcgg taaatatgtc gatgatttcg2580aacgtaaaat ggaatcttac accggaacgg cgagagcggt tgcaacggtt aacggaacag2640ccgcgttaag cgcagcgtta tacctggcag gtgttaagcg aggtgatctt gttatcactc2700aggcactgac cttcattgca acctgcaatg cgctttatca tctgggagct gagccggtgt2760ttaccgatgt ctctccggtg agtatggggc tgtgcccggt cgcacttgat aattggttat2820ctgaaaatac cgagctgaca gaaaaaggat gtgtgcaccg taaaacacgg caggttgtac2880gtgctgtggt gcctatgcat acctttggtc atccggttga gctggatgag cttattaccg2940tttgccagaa gtggcacatc gttcttgttg aagatgcggc tgaaagtctg ggctctttct3000acaagggtaa acacaccggt acgctcggtg actatggagc gttaagcttt aacggcaata3060aaattattac gaccggtggt ggcggaatgg tcctctgtcg ctcgtcagaa gcgggtgttc3120gtgcgaaaca tgtcactacg acagcaaaag taccgcatcc ctacgagttt tatcatgatg3180aaccaggttt caactatcgt atgccaaacc tcaacgctgc gcttgggtgt gggcagatgg3240aacgccttga ttcgttcctg aaacaaaaac gtgagttggc tcagcgctat gaggcatttt3300ttgccgggtc agagttcagg ttcgtgaaag aacctgaata tgctcagtca aacttctggc3360tgaatgccat catttgtgaa aacatggatg cccgtgatgc aatgctggta caaatgaatg3420aagccaaagt aatggttcgc ccaatctgga aattgatgca ccgtctgcca atgtttgaac3480atgcaatgcg tgatgatctc aagaactctg aacagattga agctcgcctg atcaacatac3540ctagctctcc aatggagtaa tggtaatggg gtcagcaaaa cgtaaagttg cggtatttac3600cggcacgcga gctgaatatg gcttgctcta ctggctgttg aaagatatcc aggatgacaa3660agagctggaa cttcagcttc tcgttagtgg tatgcatctc tcgcccgagt ttggaaatac3720
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表1

實(shí)施例2利用JP-A No.3-121146中公開的方法，制備具有表2所示組成的纖維-聚烯烴樹脂復(fù)合材料粒料。該粒料含有17重量％的纖維且長度為9mm。
注塑該纖維-聚烯烴樹脂復(fù)合材料粒料，并測(cè)量所得樣品的彎曲模量、抗彎強(qiáng)度、屈服點(diǎn)強(qiáng)度、懸臂梁式(IZOD)沖擊強(qiáng)度和加權(quán)平均纖維長度。其結(jié)果示于表2中。
對(duì)比實(shí)施例2除了用聚(對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)纖維(D-1)代替聚(萘二甲酸乙二醇酯)纖維(A-1)之外，以與實(shí)施例2中相同的方式進(jìn)行評(píng)價(jià)。其結(jié)果示于表2中。
ATGATGTTTC TGAAAATGAA AAAGAATTAA AAAAAATCGT TTCCGAATCA CGCTTCCTTG1320TACTTGGCGG TGCTGGCTCT ATTGGTCAGG CTGTTGTAAA AGAAATATTT AAACGCAATC1380CTCAGAAACT GCATGTTGTC GATATTAGCG AAAACAACAT GGTTGAGTTG GTTCGTGATA1440TACGCAGTTC CTTCGGTTAT ATTGCTGGTG ATTTCCAGAC GTTCGCGCTT GATATCGGCT1500CTGTAGAATA CGACGCTTTT ATCAAAGCTG ACGGTAAATA TGATTACGTT CTGAATTTAT1560CTGCCCTGAA ACATGTTCGC AGTGAGAAAG ATCCGTTTAC CCTGATGCGC ATGATTGAAG1620TCAATATTCT CAATACTGAC AAAACCATTG AGCAGTCTAT TGCTGCTGGC GTTAAGAAAT1680TCTTCTGCGT ATCGACCGAC AAGGCCGCGA ATCCGGTAAA TATGATGGGC GCTTCTAAGC1740GTATTATGGA AATGTTCCTG ATGCGTAAAA GTGAACAAAT CGCCATCTCT ACTGCACGTT1800TCGCGAACGT AGCCTTTTCT GATGGCTCCC TTCTGCATGG GTTCAATCAA CGCCTCCACA1860AGCAGCAACC CCTGGTTGCA CCGAATGATA TCAAGCGTTA TTTCGTCACC CCTCAGGAAT1920CAGGTGAGCT CTGTCTGATG TCATGTATTT TTGGTGATAA TCGTGACATC TTCTTCCCGA1980AACTGAGTGA AGCATTACAC CTCATTTCTT TTGCCGATAT TGCGGTTCTC TACCTTAAGC2040AACGTGGTTA TGAGCCTCAT CTTTGTGAAA CCGAAGACGA AGCTCGTGAG CTTGCTAAAA2100CCCTGCCAGC ACAAGGTAAA TGGCCATGTT TGTTTACCTC AAGTGATACG ACAGGTGAGA2160AAGATTTCGA GGAGTTCTTC ACCGATAATG AAACGCTTGA TATGGAGCGT TTTAACAATC2220TGGGCATTAT CAAGAATGAA CCTTTATATG ACCCTGCGCT TCTGGCCCAC TTTGAAGAAC2280GTATCGAAGA GATGAAAGCA TCTCTGGAAT GGAATAAAGA CGATATTGTA AAACTGTTTT2340orf1的終止TTGAAATGAT CCCTGACTTC AGACATAAAG AAACAGGTAA ATACCTCGAC AGCAAAATGT2400orf2的起始AAGCAAGGCA TCCCCGAATGAATATCAAAT CAATTATCGA ATTTGTTCGC GACGTATACA2460AAACGGATGA ATTTATTCCT TTGCATGCGC CAGTGTTTAA TGGCAACGAA AAAAAATATG2520TTCTGGATAC TCTGGACAGT ACTTTCGTGT CGAGCGTCGG TAAATATGTC GATGATTTCG2580AACGTAAAAT GGAATCTTAC ACCGGAACGG CGAGAGCGGT TGCAACGGTT AACGGAACAG2640CCGCGTTAAG CGCAGCGTTA TACCTGGCAG GTGTTAAGCG AGGTGATCTT GTTATCACTC2700AGGCACTGAC CTTCATTGCA ACCTGCAATG CGCTTTATCA TCTGGGAGCT GAGCCGGTGT2760TTACCGATGT CTCTCCGGTG AGTATGGGGC TGTGCCCGGT CGCACTTGAT AATTGGTTAT2820CTGAAAATAC CGAGCTGACA GAAAAAGGAT GTGTGCACCG TAAAACACGG CAGGTTGTAC2880GTGCTGTGGT GCCTATGCAT ACCTTTGGTC ATCCGGTTGA GCTGGATGAG CTTATTACCG2940TTTGCCAGAA GTGGCACATC GTTCTTGTTG AAGATGCGGC TGAAAGTCTG GGCTCTTTCT3000ACAAGGGTAA ACACACCGGT ACGCTCGGTG ACTATGGAGC GTTAAGCTTT AACGGCAATA3060AAATTATTAC GACCGGTGGT GGCGGAATGG TCCTCTGTCG CTCGTCAGAA GCGGGTGTTC3120GTGCGAAACA TGTCACTACG ACAGCAAAAG TACCGCATCC CTACGAGTTT TATCATGATG3180AACCAGGTTT CAACTATCGT ATGCCAAACC TCAACGCTGC GCTTGGGTGT GGGCAGATGG3240AACGCCTTGA TTCGTTCCTG AAACAAAAAC GTGAGTTGGC TCAGCGCTAT GAGGCATTTT3300TTGCCGGGTC AGAGTTCAGG TTCGTGAAAG AACCTGAATA TGCTCAGTCA AACTTCTGGC3360TGAATGCCAT CATTTGTGAA AACATGGATG CCCGTGATGC AATGCTGGTA CAAATGAATG3420AAGCCAAAGT AATGGTTCGC CCAATCTGGA AATTGATGCA CCGTCTGCCA ATGTTTGAAC3480ATGCAATGCG TGATGATCTC AAGAACTCTG AACAGATTGA AGCTCGCCTG ATCAACATAC3540orf2的終止orf3的起始CTAGCTCTCC AATGGAGTAA TGGTAATGGG GTCAGCAAAA CGTAAAGTTG CGGTATTTAC 3600CGGCACGCGA GCTGAATATG GCTTGCTCTA CTGGCTGTTG AAAGATATCC AGGATGACAA3660AGAGCTGGAA CTTCAGCTTC TCGTTAGTGG TATGCATCTC TCGCCCGAGT TTGGAAATAC3720CTGGCAGCAG ATTGAGAAAG ACGGTTTTTC AATTGATGAG AAGATTGATA TATTGCTTTC3780TTCGGATACG GCAGTAGGGA CTGCAAAAAG CATGGGGCTG GGGATATTGG GTTTTGCTGA3840TGCCCTGAAC AGATTAAAGC CGGATATTTT AGTGATACTC GGGGACCGTT TTGAAGCTCT3900TGCAGCGGCA CAGACGGCGA TGATTCTCCG TATTCCCATT CTGCATCTAC ATGGTGGGGA3960AATTACGGAG GGTGCCTACG ACGATGCGAT CAGACACGCG ATTACTAAAC TGAGTTATTT4020ACATGGAACT TCAACAGAGG CCTATCGGAA TCGTGTTATC CAGCTAGGGG AAGATCCTTC4080TCGCGTAGTC AATGTTGGCG CAATTGGGCT GGATCATCTC AAGCGCGGAC AATTTATGTC4140TGTTGAGGAA TTAGGTGTCT CGCTGAAATT CCCGCTTAGA AAACCATTCT TACTGGTGAC4200GTATCATCCT GTCACTCTGG GTGACGAGCC TGCAGAAGCA AGTTTTAACG CGTTGTTAGC4260GGCGCTTGAT GAGTACCCGG AGTATCAGGT CATCCTGACC TATCCCAACG CAGATGATGG4320TGGCAGAAAG ATCATTCCCT TGCTCGAAGC CTATGCTGCC AGACAACCCG AGCGTGTGCT4380GGCGATTCCT TCTTTAGGAC AGGTGCGCTA TCTCAGTGCT GTGAAGTATG CAGCGGCAGT4440GGTAGGTAAT TCCTCCAGCG GGATTATTGA AGTTCCTGCG TTTGATGTTC CTACCGTTAA4500CATTGGCGAA AGGCAAAAAG GCCGGTTGGC TGCCCGAAGC GTGTTGAATT GCCCTGCAAC4560GACGGAGTCG ATTGCGAAGG CATTAAGAAT TGCGGTTACG CGCAGTTATA AAAACCGCGA4620TGAAGACATT GCGAATCCTT ATGGCCAGGG TGATGCAAGT TCGAAAATCA TTGAGATGAT4680orf3的終止orf4的起始TAAGTCCATG CATTTTGTTC CCGGCAAGAC GTTCTACGAC ATCAAGTGAA ACTATATGAC4740GCTTATCATT GCTGAAGCCG GTGTTAATCA CAACGGCGAC GAAAAACTGG CTTTTGAACT4800TGTTGATGCT GCTTATAAGG CCGGGGCTGA TATTGTTAAG TTCCAGACGT TTAAAGCGAA4860AAACCTGGTG ACCGAACAGG CAAAGCAAGC CGATTATCAG GTGGCGAATA CTCAACGACA4920
GGAATCGCAA CTAGCGATGC TAAGCCGTCT TGAACTGTCA TGGGAAGCGC ATCATGCATT4980GGTTAAGCAT TGTGAAGCAT TGGGGATAGA ATTTCTTTCC ACGGCCTTTG ATTCAGAAAG5040CCTTGATTTC CTGGTGAATG ATCTTGGAAT CAAACGCTTG AAATTGCCTT CTGGTGAGCT5100CACCAATGCA CCGTTGGTTC TGGAACATGC CAGAACAGGT TGCGATATTA TTGTTTCAAC5160GGGGATGGCC ACTCTTTCTG AAATAGAAGC TGCTTTGGGT GTTATCGCAT TCGGATATAT5220CAGTTCAAAG GATGAAAAAC CTTGTATCGA AGCCTTTGAA AGAGCCTATG CAACACGTGA5280AGGTCAGAAG TTGCTGAAAG AGAAAGTGAC AATTCTTCAC TGTACGACTG AATATCCTGC5340GCCAATGGGT GAAATTAACT TGAGAGCAAT GGATTCCTTA CGAGAAGCTT TTGACCTTCC5400TGTGGGCTAT TCCGATCACA GCGAGGGGAT AGCTATCCCT GTAGCAGCCG TTGCCAGAGG5460GGCTGTGATT ATTGAGAAAC ATTTCACGCT AGATAAAAAT ATGGAAGGTC CGGATCATAA5520AGCTTCACTT GAACCTGATG AACTGGCCGC AATGGTAAAA GCGATCAGGC AAATAGAAAT5580AGCGCTAGGA AATAAGGTCA AAGCACCAAC CGTTTCAGAA ATTAAAAACA AGTCGGTTGC5640GAGAAAAAGT CTGGTGGCTG CGCAGAAAAT TCGAGCGGGG GAAACTTTTA CCGCGTCGAA5700TGTTACAATC AAGAGACCTG GAAACGGGAT GTCGCCTTAT AGCTACTGGG ATATCCTGGA5760orf4的終止AAAAATATCA ACAAAAGAAT ATTTGCCGGG AGATCTGATT ATTGAATAGC AAACCTGTTG 5820orf5的起始TTCTTATTGG TGGTGGCGGC CATGCCAGTG TCCTACTGGA CATTCTGAAT TCAAATATGC 5880GGGAAGTTAT CGCTGTTGTG AGTCCGCATG ATGTCCCCGC AAGAACGATT TTTTCTGGAA5940TCAAAGTATT CCGCACTGAT GACGATATTT TTCAGTACTC AAATAAAGAC ATTGAATTAG6000TTAATGGCAT CGGTATGGTT CCGCGATCTT CGGTAAGAAA GAATGTTACG GAATCCTATC6060TTCGCCATGG ATATCAATTT GCCAGTGTAA TTGCTAAAGA TGCATTAATT TCCGCACATG6120CCCATATTAT GAACGGGGCC CAAGTTCTGT CAGGAACGAT AGTCAATCCT GGGGTAGTAA6180TTGGTAGCCA TTCAATAATT AATACCCGTG CGATTATTGA ACATGACTGC CAGATAGGAA6240ATCACAGCTT TATTGGACCC GGTGCGGTGT TGTGCGGGCA GGTTAAAACG GGGGAATCAG6300TTTTTGTGGG GGCAGGTTCC ACAATAATCC CTGGGATGAT ACTAGGCAGT AATTCAATGG6360TGGGTGCTGG CGCAGTATTA GTGCAGTCGT TAGATAATGG GCAAGTTTGC TATCCGGCAA6420orf5的終止orf6的起始GATCGGTTAT CAAATAGTGT CTTACAAAAG GTAATTCATGATGCAGCATT GGAAAAATGT6480GCTGATCCGA CCGGACAGCT CACTGCGTGA AGCGCTCGAA ATTATTAACC GTGAAGCTCT6540ACGTATCGCG TTAGTTGTTG ATAATGAAAA TAATTTATTA GGTGTCATCA CTGATGGAGA6600CATCAGAAGG GGATTGCTGA ATAATCTGGA TCTCTCGGCT AAAACTTCAC AGGTCATGAA6660TACTCAGCCA GTCACAGCGA CCAGTAGTGT TTCTTCAGCC GAGTTAAACA CGCTGATGAA6720AGTAAAAGGG ATTTTGTCTG TTCCTATCCT TCGCGATGGT AAAGTAATCG GTCTGGAGAC6780TATCCAGTCA GTAAATAATA AGAAAAAATA TCCTAACCCT GTGTTTATCA TGGCTGGCGG6840ATTTGGAACA AGATTAAAAC CATTAACGGA TTCCTGCCCA AAGCCCATGC TTTGTATCGG6900TGGTAAGCCA ATATTAGAAA CCGTAATTCG CAGTTTTGTT AAAGCTGGGT TTAATAATTT6960CTATATCTCG ACTCACTATA TGCCTGAGAT TATCAAAGAA CATTTCGGTG ATGGTGAGCG7020GTTTGATTCA AAAATCCGCT ATGTACATGA AGAAAAACCG CTGGGCACTG GCGGTGCTTT7080AGGTTTGTTA CCTGAAGATT TATCGGATGA ACATCCTCTC ATCATGATAA ATGGCGACGT7140CTTGACCAAT GTTGATTACG AGCGTTTGAT TAAATTCCAC ATAGAAAGCA AAGCTGACGC7200AACTATGTGT GTACGCGAAT ATGATTATCA AATTCCCTAT GGCGTCATAA AAGGGGATGG7260AAATAAAATC ATCTCGATGG AAGAGAAGCC TGTACACCGA TTTTTCGTCA ATGCAGGGAT7320CTATGTTGTG TCACCACAAA TCTTCAAAGC AGTGCCTAAA AATCATCGTA TTGATATGCC7380AACTCTTCTT GAAGAGCATA TGGATAATAA TGAAAACATC CTTATGTTCC CTATACATGA7440GTACTGGTTG GATATCGGTA GAATGGATGA CTTCAAAAGG GCGCAGGTAG ATTACTTTAC7500orf6的終止orf7的起始ACTAGGTTTT GACTAATGAA AGCAGTTGCG GTGATTGGAT TAGGTAATAT TGCAGACAGA 7560CATCGTCGCA ATCTCAAAAA AGTTTATCCC GGTATCAAAG TTTATGCGAT GTCAGCCTCT7620GGACGCAAAA TTCATGGTGA AATAAGTGAT TGTGATCAGG TAGTAAATAT CATAGATGAA7680CTCTTAGATA TTGTTGATAT GGCTATTATA GCATCTCCAG CAACGTTACA CGCTGGACAT7740GCCATACCAT TTATTAAAGC CGGTATACCT GTTCTAATTG AGAAACCTGT TACGGTATCG7800ACGTCTGATG CAGAGGCATT ACTGGATGCA TCAATGCGTT TTAATTCGGT AGTCGCTGTT7860GGGTATTGTT TGCGCTATTT GCCCTCTGCG CTTTCGTTAA AAAGAGTTTT AGAAGAGAAG7920AAAGCAGGCA GAATATTTAA CGCCTTTATC GAGATCGGAC AGTATCTCCC GGACTGGCGT7980GTTAGTAAAA ACTATAAAGA AAGTGTCTCA GCTAATAAAG CTTTGGGTGG TGGGGCTCTC8040CTGGAGTTAA GCCATGAATT GGATTATACA CGCTGGCTTT TTGGCGAGCT AGATGTTCTC8100CATGCTACAG TCCGAAATTC CGGTGTGCTT GATATCGATG TTGAAGATAT AGCAGATATT8160ATTGCTATTT CAAAAGATGA AATCGTTGTC AATATTCATT TGGATTTTCT ACAGAAAAAA8220GCGTTCAGGA AATGTAGTTT CTTAGGTACA GATGGACGGG TAGAATGGGA TTTGATCAAT8280AATCAAGTGA AATTAATTAA TAAATCAGAT GAGTGTTTGA TTTATAATGA ACCGCAATAC8340GATAAAAACA CCATGTATTT GGATATGTTG AAAGATTTTG ATAACTATAT ACATGGGCGC8400GAGAATCAAT GCATCAAATT GACTGATGCA GTTAAAACCA TCGCATTAGT TAATCGGATA8460orf7的終止orf8的起始AAAAAGTTGG CAGAATAAAA TGAAAAATTA TGCTTTTATA TTTGCTCGCG GAGGCTCTAA8520
AGGCCTGCCA GGGAAGAACA TAAAAGAGTT ATGTGGAAAG CCTTTATTAC ACTATGCAAT8580CGAGATTGCA CAACTGTCCC CATCAATTGA TAAAGTATTT GTCTCCACAG ATGACGCAGA8640CATTAAACAA AAAGCATTAG AATTAAAAGA TGTTGTTGTC ATTGACAGAC CTGATGAACT8700TTCTGGTGAT AAAAGTCCTG AGTGGTTTGC GTGGCGCCAT GCTATTGAGT GGGTAACTGA8760GCATTACGGG GCATTTGGAC AATTTGTCAG CCTTCCCGCC ACGAGTCCAT TGCGAGAAGT8820GCAGGATGTT GAACGTGCCA TTGCTAAACG CATGCAAACA GATGCAGATA TCTGTATCGC8880AGTAACGCCA GCATCACGTA GTCCATATTT TAATATGGTC AAAATCAACA GCAATGGCTT8940orf8的終止GAATGAGTTA GTAATTAGCC CAGAAAGGGG ATGTCTCAAG ACGTCAGGAC TGTCCTGATG 9000TGTTCGATAT TACTACCGTC GTTTATGTCT CAACTCCCGA ATTTATTCTG AATAATATTG9060GATTGTTTTC AGGGAATGTT ACTTCGGTTG AAGTTCCGAA GGAAAGAGCT GTTGATATCG9120ATGATATTTA TGATTTTCTT ATGGCTGAAA CCATTCTAAC GATGAAAAAG GAATGTAATT9180orf9的起始AAAATGATAC TGGAAAATAA AAATATTGTC ATTTTTGGTT CTGGTGGTCT GCTTGGCGCA 9240TGCCTGACGA AGGCATGCCT TGCAAATGGT TCAAAGGTTA TTGCTGTCGA TCTTGATATA9300AACCATATAA AGAATAAATT AAGTGCACAA GGTGTAGCAA CATCTGGCAT GAACATAACC9360TACGCTGAGG TTGATGTCAC CAATGAACAA TCTGTCACTG ATTTTTTTAA CTGCCTTGAG9420GACATTGATG GAATTGTCAA TGCAACCTAT CCCAGGAATA AAACGTATGG TCGTAAGTTA9480TTCGATGTAA CGCTTGCCAG CTTCAATGAA AACTTATCGC TTCACTTGGG TAGCTCCTTC9540CTGATTAGCC AACAAGCTGC ACAGTTTTTT ATGCGACAAA AAAAGCCAGT TTCGATGGTT9600AATATATCAT CCATTTACGG TGTAATTGCT CCTAAATTCA ATATTTATGA CAATACTCAA9660ATGACAATGC CTGTAGAATA TGCGGCAATC AAGTCAGCAT TATTACATTT GAATAAGTAT9720ATTGTAGCGT ATGTCAATAA TAGTGACTTC CGCATTAATT CAGTAAGCCC CGGTGGAATT9780TTTGACAACC AACCAGCTGA ATTTTGTGAG GCATATAGAA AAAACACTCA TGGAACTGGA9840ATGCTGGATG TTAATGAAAT GACGGGATCC ATTGTTTTCT TGCTGTCAGA TCAATCAAGA9900orf9的終止TATGTTACAG GTCAGAACAT TATCGTTGAT GATGGTTTCT CACTTTAGTT TTTATCATTT 9960ATTGAATGAA TATTAAGTTT GAAATGTTGA TTTTTACATT TGCATTTTGG AAATGAAGAG10020orf10的起始GTAGTTAAAT TTAATGTTAT CAAAAATAAA AACGATACTT CGCTATCTCA AACCCTATCA 10080GCGAGATGAA ATTGAAAATA AGTTTGTAGA ATTGAACAGC GGGTTATGGA AGTCAGAGAA10140ATCAACTAGA ATTCAAACTA ATAGAAAAAA AGAATATTGT CTGGTTGAGG GTATCATTGC10200ATGTCCTGCA AGTATTATGG ATAAGGCAAG AATAGCAAAG GCAATACAGC AAGAAACAGG10260AGTCCAACCT GTTGTATATA TTGAGGCTTT AATTTTACAG GTAGCAATGC CAGTCATATT10320TATAATCTTT CAATATAATC ATTTTTATTG CTGGTGGCGT GGACTCTTCC ATCCTAAGGT10380GTTTGTACCC GCTGTCATTG CAACACTTAA AGCCATGTCA GGATCGAGGT CTGCAAAATC10440TTTGATCAAT CTAAACTATC GCGGCGTTGA GATTGGTGAT CTCATTTACG ATACTCTCAT10500TCGATTCAGA CCTAACGAAT ATACTGTTAA AAAAATTGAG GTTAAACATT TAAGATTGAT10560ATTCAGATCA TTTCTAACAT TTCATAACAA TGAGTTAATG TTGGAAAAAT ATAATCCGAA10620ATATCTTGTA ACTAGCCATA ATGTCTATGC TGAATTTGGC ATGTTGCCTC GTCAAATTAG10680ACATCACAAT AACGGCATAG TATTCCTTAA AGATATATAT GCCTATAAAT GTTATGGACC10740TGCAATAAAT ATTAAAGAAC ACTTCCTGAA ACCAACGCAA GAAGCATTTT TGCAGAACCT10800TCATGCAATT GATTTTGTTG ACAGAGCGTA TAAATATTTC TATGACAGAT TAGAAGGTAA10860CGTTGATCAA ATAGATGTAA AAAATGCTTA TCAAAATAAG AAAAAATATA GTATTGAACA10920GTTAAAATCT ATTTACCCTA AAGTTGATAT TCGTAAAAAA AATGTTGTTG TCATGTCACA10980TGCGTTCTCT GACTCACCTC ATGTTGGTGA GGGGTTACTA TTTAATGACT ATTATGATTT11040CTTGGAAAAA ACGCTAATTC GCCTCAATAA AAATCGAAAT ATTAACTGTT TTGTAAAAGC11100TCATCCAAGT TCGTACATGT GGAATGAAAA GGGAGGAGTT GAGAGCTTAA TTGAGGCTAA11160TCAACTGGAT AATATTTATA TGATGCCGGT TGATTTGAAT ACTAATTCTA TTGCAGATTT11220TGCAGACAGC ATTGTTACGG CAAAAGGGAC GGCAGGACTG GAATTTTCAT GCCTTGGGAT11280TCCTGCAGTA ACTGCTGGAA AAGGATACTA TGCCGGTTTT GGTATTACCC TTGAACCTGA11340ATCTGTTCAA TCTTATTACA ATATTTTAGA TTCGATCTCG GGGTTAGCAA AACTGGATGA11400TGAAGTTCGT AAACGGGCAT TAGTATTGCT TTATATGGTA TCGTTGAGCC GGAGACATTC11460TGATATTTTA CCTAAGCAAC ACATCATGCC ACATGAAAAT TATAATGATG TCTACCTGAG11520TAAATATCAA GAAATTATCG CTAATATCGA AAATAATATA CCTATGCGTG ATGGCTTTTA11580wzx的起始o(jì)rf10的終止TGAAGAGGTA ATTCAGGACG TGGTGAAAAA CCATGATTAAAAAAGGGTTA ATATATATAT11640TGATAAATTA TGCTATTCAA TTTCTCAATA TATTCCTTAG TCTAGTCATG ATGAAATATC11700TCACAACAGC TCAGCTAGGT GATCTTACTC TTGCTAGAAC CTGGCAGCAA TTTGTGGACT11760ATTCACACTT TGGTGCACGA TTTTCCTTAG ATCGATTTAT TCCACTAAAA AAGGAAAGAG11820AAAAAAAATT ATTAGTTACA ACTGTATTGT TAACGAATAT TATTGGGGCG TTAACAATTT11880TGTTGGTGGC TTTATTTTTT AACCATTCTA ATTTGACAGT TATTATACTC ACCTTGTGTG11940GAGTATTTAT ATCGATAAGT AATATTATTA AAGCATACTA TCGGGCGACA AACCGGATTG12000ACGAAATGCT TTGGCTAGTT TTATATTCAC AGTTCTTTCC TGTGCTTATT CCACTAGTGT12060TGTATATCAT AACGCACAAT TTTGATGTTT ATATTTACTC GAGTTTAGGT TGCTATGCTT12120
TAGCTATTAT AAGACTGTAT AGAGTGGAAA AGGGACTAAA AAAGTTCCTG ATCCCTAAGT12180TGTTGTTAAC AAGATTAAAG TTCTTGTTTA AACCATCGGC TTTGTTATTC CTTAATGCAA12240TATTTACCTT TTTATATCTT GTCATGGACC GTTTTTTTAT TGATGATTCC GGTGGTCGTG12300AGCAACTAGG TAATTATAGC GTTATCATAT TCGCATTTAG TGCCCTAATG ATAATTCCCT12360CGACCTGTGC GGAGTTGCTT TTTGTCAAAG TTATTAGGCA GTGTAGTCAA AGTGGTAAGC12420GTTTGTTTGT TAAAGAGAGT CTTATTATGC TTGTAGTAAC ATTGTCGGGC GTAATTATTG12480CAAACGTTGT TATGAAATTT TTTATAGAAA ATTTCACTAA GTATGGAAAC CTCGTTTCTG12540AATTACATAT GGCAACACTT GCTGTTATCC CCTTTGCATT TACTGCAATA TATTACCATG12600TAATGAATGG ATTAGATTTG CGCAAACAAA TGGTGTGTGT CAGTGGTGTT GTTTGTCTCA12660TTTTGATGTC ATATTATTGC ATCCCAGTAT TCGCCAATGT GAAATTTGAG CTAGAAGACT12720ATCTATATGG AAAATTGGCT ACAGGATGGT TAGTGTTACT TGGTTATTGT TATTTCATTT12780wzx的終止wzy的起始CGCGCGCAAA GCATCTCGCG TATAATAATA AGTAAATTCG CGGTAGAGCC CATTATGATC12840TCAATTGCAT TCTTTATAAT AGCTTTGATC TTATATTCTT TAATTGTTTT AAAAACAAAA12900GATATTATTC ATCCTCTTGG AATTGGTATT GTTTTTTGGT ACTTCTCAGC TTCCCTGTCT12960ACGGTTGATA TTCTGTATGA CCATCAATTG CAATCAGAAT TAAGTCTGGA AACACTAAGT13020GCTATTTTAC TTGCTGGTGT TTTCTTTGTT GCCCCATTTG TATTTTCAAA AAAGATAGAT13080AAAAATAATT TTAGTTTTCA GCGTTTTGAC TTTAACTTAT TTTATCGCGT ATTTTTTAAT13140TTTATTGTAG CTTTATCAGT CGTTGCTTTC TTTATGCGCT TTGGAGTGAT GCTCACTAAT13200CCACCACTTC TGTCTGGTGC AGGAAGTGAT TTAAAATCAT TAGTTCCAAA TGCGCCTCCG13260TTGTTGAATT TCATAGATGT ATCAATGCCT TACATAGCAC TTGCTGCTCT ATTTGAACTT13320AAGTACTCAT ATCGACAAGG GCGTGTGAGA AAGTATTTCC TTCTATCCTA TGTTTTTTTC13380AGTATTGTAG TTGCATTGGT TTATGAGGTA TCAAGGGGAG AATTTTTAGT ATTCATGTTA13440GGTGCCATCT ATATTTTTCT GATTCCACGT AAAATTACGC TAGGGTTCAA ACAACTAATG13500ATGGTTATGC TACCGATGGC ATTGCTTTTG TATATCGGTG CAATGCGGAT TTCAGAAACA13560AGTCGCGCCT CTACTCAATT TGGTGATGGG ATGGCAAATT CGCTTTTTAG CCAGATTTAC13620ACCTATGTTG CAATGAATTT TCAGAATCTG AATTTATTAA TTAACTCATC ATTCGAACCC13680ACATATATAT GGGGTGGTCT TAAGTTTATT CTTAAGCCGT TCTTTGGTAC CTATTACGAT13740AGTAACTCCA TGGGGTTCAC TGACTATGAG GTTGGTTTTT TCAATGCAAA AACATTTATA13800TACTATTTCT ATAATGATCT AGGATTAGCT GGTGTAATAC TCTATTCATT TATTATTGGC13860TTATTGCTTC AAATTATCTA CAATAAAACA TCCAGCAATA TTAAATATTG TCTGTTACAG13920GCGTGTTTTA TGAAAGCGAT CGTGTTTATG CTGTTTGGAA ACTATTTCTT TGGGGAATTT13980GTCTTAATCA TTCCATACTT AATTGTGTTG TTCCTTTTGC TGCTCATTAG AAAAGTCGAG14040wzy的終止CCTCGAAGGA TAGAAAATAC ACCTAAAAAATAATCCTTTT TCGACGAAGA TGTCTATAGC 14100orf13的起始AGTTAAAATA AGGGAAGATA TTGATGAGTT TGCTGATTAA TGCATCTAAT CTGTATGTGG 14160GTGGTGGTGT TCAGGTTGCT GTATCTGTAT TAGAAGAGTT AACTAAAGGT GGGCAACATT14220TCATTGCAGC AGTTTCACCT GTAGTTGCGA AACAACTCTC AGGAGAAACA CTATCAAGAT14280GCAAAATTAT CAGAAAAACA CCATCAAATG TGTTCAATGT TGAATCAAGA CGAGATTTAG14340ATCAGCTCGT TGCTGAAAAT AAAATTACGA AAGTCTTTAC GATATTTGGC CCAAGTTACT14400GGAGCCCGAA GAATGTTAAG CATGCCGTTG GATTCGCGTT GCCATGGCTG ATTTATGATG14460TGAGCCAAGT ATTTCCGAAG TTAAGTTTTC GTGAAAAGGT AAAAAAGATA CTTTTACTGC14520GCCTACAACC TTATTTTTAT AAAAAAAATG CAGATCTTAT GTTTGTTGAA ACTGATGATG14580CTAAAAATAA ACTTGTGGAA CAATATCATT TTAAGGACAG TCATGTCGTC ACTGTTCCTA14640ATACAATCAA TGCGATTTTG CAGAATGAGG ATTTATACGA TAATAGTATC TTAGAAGATT14700TACCGGAGAG GAATGTGGGG GACATTTACC TTCTGACAAT TTCACATGAT TATCCTCACA14760CAAACCTAAC CGTGATACCC AAGCTAATTG AGTTATTGCC AGATAATTAC AAGTTCATTG14820TTACGTTAAG TTCTTCGATG GCGGATATTC CCGAACGGTA TAGCCATCGT GTAATTAATG14880TTGGGCCAGT TTCCATTAAT CAATGTCCAG CATTATATCA TTATTGTGAT GCACTATTTT14940TGCCAACGTT ACTGGAGTGC TTCAGTGCCA GTTATGTAGA AGCCATGTAT TTCAAAAAAA15000TGATCTTCAC GTCTGACCTA CCATTTGCTC ATACAGTGTG TGACGACAGC GCAATATATT15060TTGATCCTTA TGATGCCAAT GATATTTGTG ACAAAATCAT TTCTGGAGTT GAAGGCGTAC15120ACGATAAAGT GATAAAGCAA GAAAAGGCCG ACTTAATTTT TAGCAAGCTT CCAACGGCTA15180orf13的終止AAGAAAGGGC CTTAATGTAC ATGCGCAGCA TTGATAAGTT ATAAGATTTC TTAAGAGGTA 15240fnl1的起始TTAAATGTTT TCAGATAAAG TTCTTTTGAT TACAGGCGGA ACAGGTTCCT TTGGAAATGC 15300AGTTTTAAAT CGTTTTCTGG AAACTGATAT TAAAGAAATT CGCATTTTCT CGCGCGATGA15360AAAAAAGCAA GATGATATGC GCAAGAAATA CAATAGTGAG AAGCTTAAGT TTTACATAGG15420CGATGTCAGG GATTATCGCA GTGTACTCAA TGCCAGCCGT GGCGTTGATT TTATCTACCA15480TGCTGCCGCC CTTAAACAAG TGCCATCATG TGAATTCCAT CCAATGGAAG CGGTTAAGAC15540TAACGTGCTC GGCACCGAAA ACGTTCTCGA AGCTGCAATT GCAAACGAAG TAAAACGCGT15600TGTGTGTTTA AGTACTGATA AAGCGGTTTA TCCAATCAAT GCCATGGGTA TCTCTAAGGC15660GATGATGGAG AAAGTCATGG TCGCTAAATC CCGAAATGTA AACAGCAATA AAACGGTGAT15720
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TTTCCGGGTA AGTTGTTAGG TTACATGGTT CAGTCTCTAC CTATATTAGG TAGCGTGAAT19500GCTGGAAATG ATCTGCTCGA CATCGTCAAT CAAAATAACG CAGGATTAAT CCATATCAAT19560GGAGAGGATG ACAAGCTTTA CCATTCTGCG CTGTTAATGC TTTATGACAT TGATGCGCGC19620CAGCGATTTG GTCTGGGCGC GAACAAGTTG TTAAAAGAGC AGTTCTCCGT TGAGTCTGCG19680wbuc的起始 wbuB的終止GCGCGGACGA TAGAAATGAG GCTGGAGGCA TGCAATGCGA TTAATTGATA ATGACCAGCT19740TGAGGCATTA TACGAACAAG CAGAGCAATC CGAGCGCCTG CGTTCCCATC TTTTGATGCA19800TAGTTCGCAT CAGGATAAGG TGCAACGACT ACTCATTGCC CTGGTCAGTA GTAGCTATGT19860AGAACCTCAT TTCCATGAAC TTCCTCATCA GTGGGAAATG TTTATCGTCA TGCAGGGCCA19920GCTTCAGGTT TGTTTGCATG GCAAAGATGG AGAAGTCGTT AAGCAATTTA TTGTCGGAGA19980AAATACAGAA ATTAACATTG TGGAGTTTTC TCCGGGAGAC ATACACAGTG TCAAATGCTT20040GTCTCCTCGT GCTCTCATGA TGGAGGTGAA AGAGGGACCA TTTGACCCTT CCTTTGCTAA20100wbuc的終止AGCATTTGTTTAATACCATC GTGAATCACA TCTTACGCTA TCCACCTGGC TTCATCCTGA 20160GTTAACATCA GCAATACATT CAAGCCGTGC ATAAATCGCG GTGACCACCC TCTGACAGGA20220GTAAACAATG TCAAAGCAAC AGATCGGCGT CGTCGGTATG GCAGTGATGG GGCGCAACCT20280TGCGCTCAAC ATCGAAAGCC GTGGTTATAC CGTCTCTATT TTCAACCGTT CCCGTGAAAA20340GACGGAAGAA GTGATTGCCG AAAATCCAGG CAAGAAACTG GTTCCTTACT ATACGGTGAA20400AGAGTTTGTT GAATCTCTTG AAACGCCTCG TCGCATCCTG TTAATGGTGA AAGCAGGTGC20460AGGGACGGAT GCTGCTATTG ATTCCCTCAA GCCATACCTC GATAAAGGTG ACATCATCAT20520TGATGGTGGT AACACCTTCT TCCAGGACAC CATTCGTCGT AACCGTGAGC TTTCTGCCGA20580AGGTTTTAAC TTTATCGGTA CCGGTGTTTC CGGTGGTGAA GAGGGCGCGC TGAAAGGTCC20640TTCCATTATG CCTGGCGGCC AGAAAGAAGC CTATGAACTG GTTGCTCCGA TCCTGACCAA20700AATCGCCGCC GTTGCTGAAG ATGGCGAACC GTGCGTTACA TATATTGGTG CCGATGGTGC20760GGGTCACTAT GCGAAAATGG TTCACAACGG TATTGAATAC GGTGATATGC AACTGATTGC20820TGAAGCCTAT TCTCTGCTTA AAGGTGGTCT GAACCTCACC AACGAAGAAC TGGCGCAGAC20880CTTTACCGAG TGGAATAACG GTGAACTGAG CAGCTACCTG ATCGACATCA CCAAAGATAT20940CTTCACCAAA AAAGATGAAG ACGGTAACTA CCTGGTTGAT GTGATCCTGG ATGAAGCGGC21000TAACAAAGGT ACCGGTAAAT GGACCAGCCA GAGCGCACTG GATCTAGGCG AACCGCTGTC21060GCTGATTACC GAGTCTGTGT TTGCACGTTA TATCCCTTCT CTGAAAGATC AGCGCGTTGC21120CGCATCTAAA GTTCTCTCTG GCCCGCAAGC GCAGCCAGCA GGCGACAAAG GTGAGTTCAT21180CGAAAAAGTT CGCCGTGCGT TGTATCTGGG CAAAATCGTT TCTTA21225本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的目的是尋找并應(yīng)用該細(xì)菌的特異分子標(biāo)識(shí)物(分子探針)，即特異核苷酸序列，因此本發(fā)明的技術(shù)方案具有獨(dú)特性，其與常規(guī)研究方法的不同之處是，尋找到具有特異性的核苷酸序列，并通過可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確保分子標(biāo)識(shí)物的特異性，即可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的成熟技術(shù)(如PCR或基因芯片等)，應(yīng)用該標(biāo)識(shí)物檢測(cè)細(xì)菌的技術(shù)，使所有本領(lǐng)域技術(shù)人員都可以根據(jù)本發(fā)明提供的技術(shù)內(nèi)容，很容易的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的并取得預(yù)期的使用效果。本發(fā)明中已經(jīng)提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，充分證明了該核苷酸序列的特異性，并可以應(yīng)用于該細(xì)菌的檢測(cè)，應(yīng)用本發(fā)明的現(xiàn)代分子生物學(xué)細(xì)菌鑒定方法相對(duì)于傳統(tǒng)的血清學(xué)免疫反應(yīng)，具有快速、準(zhǔn)確、低成本的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明測(cè)序并用生物信息學(xué)軟件推測(cè)各個(gè)基因的功能，是為了尋找特異性核苷酸，細(xì)菌中有一些特定功能的基因是高度特異的，利用以上方法推測(cè)出這些特定功能的基因以及它們的位置，然后利用實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證明，將推測(cè)出的這些基因的功能，作為一種路標(biāo)去更好更快的尋找到特異性核苷酸，這樣，可以減少研究實(shí)驗(yàn)的盲目性，加快實(shí)驗(yàn)的進(jìn)度，降低實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長21225個(gè)堿基；或者所述具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于其包括命名為orf1、orf2、orf3、orf4、orf5、orf6、orf7、orf8、orf9、orf10、wzx、wzy、orf13、fn11、fn12、fn13、wbuB、wbuC的18個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
3.按照權(quán)利要求2所述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特異性的基因是轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因，其包括wzx基因；聚合酶基因，其包括wzy基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其包括orf13、wbuB基因；其中所述的基因wzx是SEQ ID NO1中的11613至12815堿基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的12835至14073堿基的核苷酸；orf13是SEQ IDNO1中的14124至15224堿基的核苷酸；wbuB是SEQ ID NO1中的18517至19728堿基的核苷酸。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于其還包括源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基轉(zhuǎn)移酶基因orf13、wbuB基因以及它們的混合或它們的重組。
5.按照權(quán)利要求4所述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其中源于wzx基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的11775至11792堿基的核苷酸和12638至12655堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的12344至12361堿基的核苷酸和12748至12766堿基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的13194至13213堿基的核苷酸和14012至14029堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的13605至13623堿基的核苷酸和13940至13957堿基的核苷酸。
6.權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸在檢測(cè)表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達(dá)而提供表達(dá)大腸桿菌O108型的O-抗原，以及制備細(xì)菌疫苗中的應(yīng)用。
8.按照權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其特征在于，它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測(cè)、或者用于制造基因芯片或微陣列，供檢測(cè)細(xì)菌的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌O108型，離心收集細(xì)胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O108型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O108型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，將得到的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并該long PCR產(chǎn)物，并用DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫將Long PCR純化產(chǎn)物應(yīng)用鳥槍法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；(4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的克隆用實(shí)驗(yàn)室常用的DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段進(jìn)行測(cè)序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析應(yīng)用生物信息學(xué)軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；(6)特異基因的篩選針對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，確定wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O108型的O-抗原的高度特異性；(7)引物靈敏度的檢測(cè)培養(yǎng)大腸桿菌O108，細(xì)菌計(jì)數(shù)后分別將5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌加入到一定量的某種待檢測(cè)物中，混入細(xì)菌的待檢測(cè)物作為檢測(cè)用樣品，將樣品加入LB培養(yǎng)基，取一些與樣品混合過的LB培養(yǎng)基過濾，將過濾液進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)毫升處理后作為PCR模板用寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)其對(duì)大腸桿菌O108的靈敏度。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O108型，離心收集細(xì)胞；用pH值為8.0的500ul 50mM Tris-HCl和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘；之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘，加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合溶液抽提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，酚∶氯仿∶異戊醇的混合體積比例為25∶24∶1；上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，將DNA重懸于30ul TE中；基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O108型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O108型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動(dòng)子區(qū)的galF序列設(shè)計(jì)上游引物為#1523-ATT GTG GCT GCAGGG ATC AAA GAA AT，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物為#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并5管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫，反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行，酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)；合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇的混合溶液抽提一次，酚∶氯仿∶異戊醇的混合體積比例為25∶24∶1再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中，隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3’端加dA尾；此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇的混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接10小時(shí)，總體積為90ul，氯仿∶異戊醇的混合體積比例為24∶1；其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶，最后用1/10體積的pH值為5.2的3M NaAc和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物；用BiO-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到BiO-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒至6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒，并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇文庫；(4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的96個(gè)克隆用本實(shí)驗(yàn)室ABI3730型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段進(jìn)行測(cè)序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對(duì)大腸桿菌O108型的基因組作5個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫，2)對(duì)每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率，在得到大腸桿菌O108型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術(shù)信息學(xué)中心的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到18個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對(duì)，最后得到大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；(6)特異基因篩選針對(duì)大腸桿菌O108型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，除在含大腸桿菌O108組中得到了預(yù)期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到預(yù)期片段大小的正確產(chǎn)物，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O108型的O-抗原都是高度特異的。(7)引物靈敏度的檢測(cè)購買市場(chǎng)上的生豬肉餡，攪拌均勻，分成20g一份，存在-40℃冰箱中備用；將10μl大腸桿菌O108的凍存菌液接種到有20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12小時(shí)至飽和，取少量培養(yǎng)好的菌液作106和107倍的稀釋，其余的菌液放于4℃的冰箱中備用，取50μl稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，37度，培養(yǎng)12h，對(duì)所涂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度。在5份生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入200ml LB培養(yǎng)基，經(jīng)6層紗布過濾，過濾液于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12h。從培養(yǎng)好的菌液中取3ml菌液于6,000g離心5分鐘，去上清，加100μl MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100度沸水中煮15分鐘，裂解液于12,000g離心8分鐘，取1μ上清做為PGR模板；用4對(duì)寡核苷酸對(duì)SEQ ID NO1中的11775至11792堿基的核苷酸和12638至12655堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的12344至12361堿基的核苷酸和12748至12766堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的13194至13213堿基的核苷酸和14012至14029堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的13605至13623堿基的核苷酸和13940至13957堿基的核苷酸，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μ1，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性；參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果；參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果；說明使用上述方法時(shí)，這4對(duì)引物對(duì)豬肉餡中的大腸桿菌O108的檢測(cè)靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對(duì)大腸桿菌O108型(Escherichiacoli O108)的O－抗原特異的核苷酸，它是大腸桿菌型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長21225個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；還包括源于大腸桿菌O108型的O－抗原基因簇中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因的寡核苷酸；本發(fā)明通過PCR證實(shí)寡核苷酸對(duì)大腸桿菌O108型的O－抗原都有高度的特異性；本發(fā)明還公開了用本發(fā)明的寡核苷酸檢測(cè)和鑒定大腸桿菌O108型的方法。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1702081SQ200410094099
公開日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者王磊, 劉丹, 馮露 申請(qǐng)人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司