專利名稱：：用于生產(chǎn)具有提高的抗原性的卷旋桿菌屬細(xì)菌的方法及包含此種細(xì)菌的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是1994年10月5日提交的共同未決的系列申請(qǐng)08/318,409的部分后繼。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體上涉及誘導(dǎo)或提高腸細(xì)菌抗原和/或毒性因子的表達(dá)因而產(chǎn)生抗原性提高的腸細(xì)菌的體外方法，涉及使用抗原性提高的腸細(xì)菌的方法，涉及含有抗原性提高的腸細(xì)菌的疫苗。2.發(fā)明背景普遍認(rèn)為，使用常規(guī)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件體外培養(yǎng)的細(xì)菌，其表達(dá)的特征不同于在其自然的生活環(huán)境，包括在動(dòng)物宿主的正常微生物體系和病原體體內(nèi)生長(zhǎng)，生長(zhǎng)過(guò)程中所表達(dá)的特征。因而，這種體外生長(zhǎng)的病原菌不宜用作疫苗組分。然而，假如能夠確定引發(fā)或提高毒性因子的表達(dá)，相關(guān)生理學(xué)，或包括外表面抗原的抗原的條件，那么重要的產(chǎn)品和治療學(xué)(如，疫苗的新抗原，抗生素的新靶點(diǎn)，和用于診斷應(yīng)用的新的細(xì)菌特征)能夠被快速地確定。已經(jīng)確定了幾種影響細(xì)菌中毒性決定簇的表達(dá)的環(huán)境因子(Mekalanos，J.J.，J.Bacteriol.1741-7，1992)。例如，對(duì)于鐵和細(xì)菌，特別是志賀氏菌屬(Payne，Mol.MicroBiol.，31301-1306，1989)，奈瑟氏球菌屬(PayneandFinhelstein，J.Clin.Microbiol.，6293-297，1977)和巴斯德氏菌屬(Gilmour，etal.，Vaccine，9137-140，1991)細(xì)菌的毒性之間關(guān)系的研究已進(jìn)行了很長(zhǎng)時(shí)間。其它環(huán)境因子亦顯示出在植物和動(dòng)物中控制多種細(xì)菌的協(xié)同調(diào)節(jié)的毒性決定簇的表達(dá)，包括酚類(lèi)化合物，單糖，氨基酸，溫度，克分子滲透壓濃度，和其他離子(Mekalanos，J.Bacteriol.，1741-7，1992)。通過(guò)腸道(即，口途徑)進(jìn)入動(dòng)物宿主的細(xì)菌病原體遭遇多種宿主環(huán)境成份和條件，這些都可能影響細(xì)菌病理學(xué)和毒性因子表達(dá)。這些成份和條件包括膽汁，膽汁酸或鹽，胃pH，微需氧的條件(腸道內(nèi)CO2較高，O2較低)，克分子滲透壓濃度和其它尚未確定的因素。侵襲性腸病原菌需要從頭蛋白質(zhì)合成以完成內(nèi)在化(internalization)(HeadleyandPayne，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，874179-4183，1990)。因而，細(xì)菌可僅在應(yīng)答普通情況下體外不存在的某些環(huán)境信號(hào)時(shí)最佳地產(chǎn)生這些侵襲因子。這些假說(shuō)被最近的報(bào)道所支持針對(duì)常規(guī)生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌制備的抗血清在阻斷體外內(nèi)在化上僅有邊緣效應(yīng)(Konkel，etal.，J.Infect.Dis.，168948-954，1993)。然而，用在上皮細(xì)胞單層出現(xiàn)，一種提高侵襲力，的條件下生長(zhǎng)的彎曲桿菌提取物免疫兔，引起能明顯抑制細(xì)菌內(nèi)在化的抗血清的產(chǎn)生。研究人員一直在研究在腸道環(huán)境下的細(xì)菌生長(zhǎng)以確定相關(guān)毒性因子。例如，生長(zhǎng)于兔回腸環(huán)的彎曲桿菌菌株81-176表達(dá)了在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)體外培養(yǎng)條件下不表達(dá)的蛋白質(zhì)(Panigrahi，etal.，Infect.Immun.604938-4944，1992)。用INT407細(xì)胞單層培養(yǎng)的彎曲桿菌，與沒(méi)有上皮細(xì)胞條件下培養(yǎng)的細(xì)菌相比，出現(xiàn)了新的，或提高的蛋白質(zhì)的合成(Konkel，etal.，J.Infect.Dis.168948-954，1993)。而且，這些變化暫時(shí)地與空腸彎曲桿菌增加的侵襲力相關(guān)。在靜脈內(nèi)或絨毛尿囊雞胚傳代時(shí)，空腸彎曲桿菌的無(wú)毒株的一些變化被誘導(dǎo)和增加，如細(xì)胞形態(tài)，鞭毛失去，新的外層膜蛋白的表達(dá)和細(xì)胞表面碳水化合物的改變(Field，etal.，J.Med.Microbiol.，38293-300，1993)。其他腸道組分，例如膽汁酸或鹽，已知能抑制某些細(xì)菌，但是膽汁酸通過(guò)影響細(xì)菌毒性表達(dá)而起到其他作用。Pope和Payne(93rdAmSoc.Microbiol.，B-147，1993)報(bào)道培養(yǎng)在含有鵝脫氧膽酸鈉肉湯中培養(yǎng)的弗氏志賀氏菌被證明具有提高3-5倍的對(duì)Hela細(xì)胞單層的侵染力。然而，他們報(bào)道，其他膽汁酸和去垢劑，包括膽酸鹽，甘氨膽酸鹽，牛磺脫氧膽酸、CHAPS系列，毛地黃皂苷和TritonX100和其鈉鹽，對(duì)于弗氏志賀氏菌的侵襲力沒(méi)有作用。而且，含有鵝脫氧膽酸的肉湯對(duì)于大腸桿菌或其它志賀氏無(wú)毒菌株的侵襲力沒(méi)有作用。弗氏志賀氏菌的新的蛋白的合成亦被生長(zhǎng)培養(yǎng)基中改變的pH，溫度，和離子組成誘導(dǎo)。(Mekalanos，J.Bacteriol.，1741-7，1992)。公開(kāi)于1993年11月11日的公開(kāi)號(hào)為WO93/22423的PCT申請(qǐng)，公開(kāi)了用于在脂質(zhì)，例如磷脂酰絲氨酸，或粘液上生長(zhǎng)細(xì)菌的方法，及由于在磷脂酰絲氨酸出現(xiàn)的情況下生長(zhǎng)而提高其表達(dá)的蛋白分離。這一參考文獻(xiàn)既未公開(kāi)也未揭示本發(fā)明的用于產(chǎn)生具有提高的毒性或抗原特性的腸細(xì)菌的方法。針對(duì)許多腸道病原體例如彎曲桿菌屬細(xì)菌和志賀氏菌屬細(xì)菌的疫苗，還未有得到，但是這些病因的流行病學(xué)使這些疫苗成為重要的目標(biāo)。志賀氏菌病是全球性流行病，在發(fā)展中國(guó)家是每年因腹瀉而死亡的500萬(wàn)兒童中的10％的死因。彎曲桿菌雖然只是在最近才被鑒定為腸病原菌，現(xiàn)在被認(rèn)為發(fā)達(dá)國(guó)家和不發(fā)達(dá)國(guó)家的腹瀉病癥的一個(gè)主要原因。估計(jì)每年發(fā)生4,000至5,000萬(wàn)例彎曲桿菌腹瀉，且多于20萬(wàn)例發(fā)生在美國(guó)。志賀氏菌病是結(jié)腸粘膜細(xì)菌侵襲的后果。這種侵襲與發(fā)現(xiàn)于所有侵襲性分離物中的質(zhì)粒相關(guān)(Sansonetti等.，Infect.Immun.，35852-860，1982)。該質(zhì)粒的一個(gè)片段含有侵襲質(zhì)?？乖?Ipa)基因，IpaA，-B，-C，和-D。IpaB，-C和-D蛋白質(zhì)是進(jìn)入過(guò)程所必須的(Baudryetal.，J.Gen.Microbiol.，1333403-3413，1987)。雖然其預(yù)防效應(yīng)尚未明確確立，但I(xiàn)pa蛋白是合乎邏輯的疫苗候選者。IpaB和IpaC是免疫顯性蛋白(Hale.等.，Infect.Immun.，50620-629，1985)。而且，62kDaIpaB蛋白(開(kāi)始細(xì)胞進(jìn)入和在膜結(jié)合噬細(xì)胞液泡的溶胞中起作用的侵襲素)(High，etal.，EMBOJ.，111991-1999，1992)在志賀氏菌屬內(nèi)高度保守。在沒(méi)有明顯的針對(duì)志賀氏Ipa的粘膜抗體的營(yíng)養(yǎng)不良的兒童中所觀察到的久治不愈的病癥提示針對(duì)Ipa的粘膜抗體的出現(xiàn)可能限制感染的傳播和嚴(yán)重性。雖然在動(dòng)物和人類(lèi)中試驗(yàn)了一些志賀氏菌疫苗候選者，但未發(fā)現(xiàn)成功的一個(gè)。盡管Ipa蛋白的潛在的顯著毒性，多數(shù)被研究用來(lái)針對(duì)志賀氏菌病的多數(shù)疫苗候選者基于脂多糖抗原，它載有血清型特異的決定簇。已經(jīng)研制了非經(jīng)腸施用的多糖-蛋白結(jié)合疫苗，但是只是在動(dòng)物中顯示出明顯的保護(hù)作用(Robbins等，Rev.InfDis.13S362-365，1991)。一種類(lèi)似施用的核糖體疫苗的確誘導(dǎo)粘膜免疫，但是其保護(hù)效力尚待證實(shí)(Levenson等.，Arch.AllergyAppl.Immunol.，8725-31，1988)。彎曲桿菌感染的致病機(jī)制沒(méi)能象志賀氏感染的致病機(jī)制那樣被深入研究。體外細(xì)胞侵襲研究(Konkel，等，J.Infect.Dis.，168948-954，1993)和組織病理學(xué)檢查(Russell，等，J.Infect.Dis.，168210-215，1993)提示結(jié)腸侵襲是很重要的。這一結(jié)論亦同以下觀察一致由彎曲桿菌引起的腹瀉與母株中的血相關(guān)，且是嚴(yán)重的。這一活性與免疫顯性62kDa鞭示蛋白相關(guān)。最近的報(bào)道表明鞭毛的出現(xiàn)對(duì)于彎曲桿菌跨越板化的上皮細(xì)胞的單層(Grantetal.，InfectImmun.，611764-1771，1993)是必需的。沒(méi)有具體的彎曲桿菌抗原被研制用于保護(hù)。然而，低分子量(28-31kDa)蛋白，或PEB蛋白，和免疫顯性鞭毛蛋白被認(rèn)為是在此領(lǐng)域內(nèi)大有作為的(Pavlovskisetal.，Infect.Immun.，592259-2264，1992；BlaserandGotschich，J.Bio.Chem.26514529-14535，1990)。鞭毛蛋白與腸的移生，以及針對(duì)在Lior亞群范圍內(nèi)感染的交叉菌株的保護(hù)的關(guān)系表明了鞭毛蛋白的重要性(Pavlovskisetal.，Infect.Immun.，592259-2264，1992)。然而，基于鞭毛蛋白的彎曲桿菌疫苗可能包括來(lái)自8-10個(gè)最為臨床相關(guān)Lior血清群的鞭毛蛋白抗原。因此，本發(fā)明的目的包括1)用于培養(yǎng)和處理腸細(xì)菌的體外培養(yǎng)條件，此培養(yǎng)條件可以最佳地誘導(dǎo)或提高侵染活性和/或包括細(xì)胞表面特性的某性細(xì)胞特性；2)相關(guān)的改變的侵襲力或細(xì)胞特性，其中包括抗原分布(profile)改變的表面特征；3)這些生物體在小動(dòng)物模型中提高的毒力；和4)用于體內(nèi)或體外攻擊時(shí)，與制備用于抗傳統(tǒng)地生長(zhǎng)的細(xì)菌的抗血清相比，具有提高的侵襲力或改變的特性包括表面特性，因而更有效地中和活的生物體的抗生物體抗血清。本發(fā)明涉及這些需要及其他。以上討論的文獻(xiàn)均未教導(dǎo)或提示本發(fā)明的體外方法，亦不涉及本發(fā)明的包含抗原性提高的腸細(xì)菌的疫苗。在本申請(qǐng)的這一章節(jié)或任何其他章節(jié)中，引述或肯定任一文獻(xiàn)，不應(yīng)被解釋為表明這一文獻(xiàn)可能作為本發(fā)明的先有技術(shù)。3.發(fā)明概述本發(fā)明提供了腸細(xì)菌的明確的培養(yǎng)條件和加入培養(yǎng)介質(zhì)的成分，以誘導(dǎo)或提高毒力因子和其他抗原的呈現(xiàn)。優(yōu)選的，這一抗原是致免疫的。更優(yōu)選地，這一致免疫的抗原與毒力的指征相關(guān)。腸細(xì)菌生長(zhǎng)于模擬生物體在體內(nèi)天然所處的某些條件的條件和組分。本發(fā)明的方法產(chǎn)生了抗原性提高的腸細(xì)菌，該細(xì)菌具有表型改變，例如每細(xì)胞中增加的總蛋白，新的或增加的個(gè)別蛋白，改變的或增加的表面碳水化合物，改變的表面脂多糖，提高的粘附性能，提高的侵襲性能和/或提高的細(xì)胞內(nèi)群游現(xiàn)象。而且，本發(fā)明的方法適應(yīng)于商業(yè)應(yīng)用的實(shí)際上的大規(guī)模發(fā)酵。所述抗原性提高的腸細(xì)菌可以用于產(chǎn)生保護(hù)性疫苗，例如滅活的完整細(xì)胞或亞單位疫苗，或者出于診斷目的例如用于生產(chǎn)抗體和探測(cè)病原性腸細(xì)菌或用于生產(chǎn)抗生素。另外，本發(fā)明的改進(jìn)的腸細(xì)菌所誘導(dǎo)的抗體可以用作被動(dòng)疫苗。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是產(chǎn)生具有提高的抗原性的腸細(xì)菌的方法，這些腸細(xì)菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類(lèi)桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門(mén)氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌，包括將腸細(xì)菌在體外于下列條件的組合之下生長(zhǎng)，包括a)0.05％至3％膽汁或0.025％至0.6％一種或多種膽汁酸或其鹽，在-30℃至42℃之間的溫度，直至生長(zhǎng)期在大約早對(duì)數(shù)期，在早對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期之間，或大約在穩(wěn)定期，在空氣中或在一微需氧的條件下，例如5％至20％CO2和80％至95％空氣，5％至20％CO2和80％至95％N2；或5％至10％O2，10％至20％CO2，和70％至85％N2；和任選存在的二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑，例如，但不限于0至100μM，優(yōu)選25μMBAPTA/AM，0至10mMEGTA，和0至100μMEGTA/AM；或者是b)，如a)中所述，除了存在二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑，例如1.0至100μM，優(yōu)選25μMBAPTA/AM，0.5至10mMEGTA，或1至100μMEGTA/AM。而且沒(méi)有膽汁，膽汁酸或膽汁鹽。根據(jù)本發(fā)明，任何各別的膽汁酸或其鹽的濃度包括0.025％至0.6％，優(yōu)選0.05％至0.5％，更優(yōu)選0.05％至0.2％，最優(yōu)選0.05％或0.1％。優(yōu)選的方法中，所述膽汁酸或其鹽包括脫氧膽酸鹽或糖膽酸鹽。本發(fā)明的另一目的是腸道桿菌，它選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類(lèi)桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門(mén)氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌，其中所述腸細(xì)菌在體外在一些條件的組合下生長(zhǎng)，以促進(jìn)提高的抗原特性，所述的條件包括a)0.05％至3％膽汁或0.025％至0.6％一種或多種膽汁酸或其鹽，在30℃至42℃之間的溫度，直至生長(zhǎng)期在大約早對(duì)數(shù)期。在早對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期之間，或大約在穩(wěn)定期，在空氣中或在一微需氧的條件下，例如5％至20％CO2和80％至95％空氣，5％至20％CO2和80％至95％N2；或5％至10％O2，10％至20％CO2，和70％至85％N2；和任選存在的二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑，例如，但不限于0至100μM，優(yōu)選25μMBAPTA/AM，0至10mAEGTA，和0至100μMEGTA/AM；或者是b)，如a)中所述，除了存在二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑，例如1.0至100μM，優(yōu)選25μMBAPTA/AM，0.5至10mMEGTA，或1至100LμMEGTA/AM。而且沒(méi)有膽汁，膽汁酸或膽汁鹽。本發(fā)明的另一目的是含有完整腸細(xì)菌或其組分的疫苗，所述腸細(xì)菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類(lèi)桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門(mén)氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌，或其致免疫性片段或其衍生物，該疫苗具有提高的抗原特性；和任選地含有可藥用載體或稀釋劑。優(yōu)選的疫苗包含完整的，滅活的，抗原性提高的腸細(xì)菌。本發(fā)明的另一目的是進(jìn)一步包含一種佐劑的疫苗。本發(fā)明的另一目的涉及能夠特異性地結(jié)合于本發(fā)明的腸細(xì)菌的至少一種抗原決定簇的抗體(包括但不限于抗血清，純化的IgG或IgA抗體，F(xiàn)ab片段，等)。這樣的單克隆和多克隆抗體可用作免疫試劑，以檢測(cè)動(dòng)物中或由其衍生的生物學(xué)樣品中的腸細(xì)菌。本發(fā)明的單克隆或多克隆抗體亦可用作被動(dòng)疫苗，以用于預(yù)防腸細(xì)菌感染和疾病。本發(fā)明的另一目的是一種用于測(cè)試潛在的抗微生物劑的體外方法，包括步驟將具有提高的抗原特性的腸細(xì)菌和所述的潛在的化學(xué)劑接觸，且分析其殺細(xì)菌和制菌作用效能。其中，腸細(xì)菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類(lèi)桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門(mén)氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌。本發(fā)明的又一目的，是一種用于檢測(cè)宿主的抗體產(chǎn)生或檢測(cè)動(dòng)物中或由此衍生的生物學(xué)樣品中的腸細(xì)菌的體外方法，包括步驟將來(lái)自宿主的生物學(xué)樣品與本發(fā)明的具有提高的抗原特性的腸細(xì)菌，其抗原或其抗體相接觸。然后篩選抗體抗原相互作用，其中，所述腸細(xì)菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類(lèi)桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門(mén)氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌。本發(fā)明的另一目的涉及用于檢測(cè)宿主的抗腸細(xì)菌的抗體的產(chǎn)生，或用于檢測(cè)腸細(xì)菌的診斷試劑盒，具有提高的抗原特性的腸細(xì)菌，或其抗體，和所有其他必需的試劑盒組分，其中，所述腸細(xì)菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類(lèi)桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門(mén)氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌。本發(fā)明的各方面所優(yōu)選涉及的腸細(xì)菌是空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni.)，大腸彎曲桿菌(CampylobacterColi)，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，假結(jié)核耶爾森氏菌，大腸桿菌，弗氏志賀氏菌，宋內(nèi)氏志賀氏菌，痢疾志賀氏菌，鮑地氏志賀氏菌，Helicobacterpylori，HelicobacterfelisGastrospirillumhominus，霍亂弧菌，副溶血弧菌，Vibriovulnificus，脆弱類(lèi)桿菌，難辨梭狀芽孢桿菌，鼠傷寒沙門(mén)氏菌，傷寒沙門(mén)氏菌，雞傷寒沙門(mén)氏菌，雛白痢沙門(mén)氏菌，豬霍亂沙門(mén)氏菌，腸炎沙門(mén)氏菌，肺炎克雷白氏桿菌，陰溝腸桿菌，和Enterococcusfaecalis。優(yōu)選的大腸桿菌包括但不限于腸毒素性，腸溶血性，腸侵襲性，腸致病性或其他菌株。本發(fā)明部分地基于這一令人驚訝的發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗原性提高的腸細(xì)菌誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，與由生長(zhǎng)于傳統(tǒng)培養(yǎng)條件下的同一腸細(xì)菌誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相比，其交叉保護(hù)針對(duì)同種細(xì)菌的更廣范圍的株或血清型。在至少一種情況下，本發(fā)明的抗原性提高的腸細(xì)菌誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)交叉保護(hù)腸細(xì)菌的不同種。附圖簡(jiǎn)述圖1A，1B和1C是來(lái)自空腸彎曲桿菌81-176的表面提取物水解物的單糖的高效液相色譜的結(jié)果的圖示說(shuō)明。圖1A標(biāo)準(zhǔn)巖藻糖為“Fuc”，N-乙酰-半乳糖胺“GalNac”，N-乙酰-葡萄糖胺“GlcNac”，半乳糖“Gal”，葡萄糖“Glc”，甘露糖“Man”。圖1B傳統(tǒng)生長(zhǎng)的細(xì)菌“BHI”的表面提取物。圖1C按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的細(xì)菌“DOC”的表面提取物。圖2圖示了十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)的結(jié)果，顯示了傳統(tǒng)生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌81-176“BHI”和按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌81-176(0.8％牛膽汁膽汁酸“OX”或0.1％脫氧膽酸“DOC”的完整細(xì)胞蛋白(泳道1，2，3)或表面提取物(泳道5和6)的比較結(jié)果。圖3圖示W(wǎng)estern印跡分析的結(jié)果，展示了與白鼬含IgA的粘液結(jié)合的蛋白比較結(jié)果，該粘液由用完整空腸彎曲桿菌81-176細(xì)胞感染而制得。傳統(tǒng)生長(zhǎng)的完整空腸彎曲桿菌81-176細(xì)胞，“1”；或根據(jù)本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的完整空腸彎曲桿菌81-176細(xì)胞0.8％牛膽汁膽汁酸，“2”；或0.1％脫氧膽酸，“3”；或傳統(tǒng)生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌81-176的表面提取物，“4”；或根據(jù)本發(fā)明的方法，且0.1％脫氧膽酸生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌81-176表面提取物，“5”。圖4.圖示了Western印跡分析的結(jié)果，展示了與鞭毛蛋白特異性單克隆抗體72C結(jié)合的蛋白的比較結(jié)果，該抗體來(lái)自按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的完整細(xì)胞空腸彎曲桿菌81-176，“3”；傳統(tǒng)生長(zhǎng)的“2”；或按照本發(fā)明的方法，生長(zhǎng)于發(fā)酵罐里的，“1”。圖5，圖示了SDS-PAGE的結(jié)果，展示了完整的弗氏志賀氏菌2457T細(xì)胞的脂多糖的比較，傳統(tǒng)生長(zhǎng)的，泳道“1”，或按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的，在0.1％脫氧膽酸存在下泳道“2”。圖6，圖示按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌的免疫交叉反應(yīng)性的提高。傳統(tǒng)生長(zhǎng)的及如實(shí)施例5(DOC)例舉的根據(jù)本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌81-176細(xì)胞被用于誘導(dǎo)抗體。展示了這兩類(lèi)抗體(即抗BHI中培養(yǎng)的空腸彎曲桿菌81-176與抗DOC中培養(yǎng)的空腸彎曲桿菌81-176)對(duì)于不同的空腸彎曲桿菌血清型的凝集活性。詳見(jiàn)第9部分實(shí)施例32。圖7A，7B和7C圖示了含有滅活的空腸彎曲桿菌81-176完整細(xì)胞的疫苗在保護(hù)小鼠免受鼻腔遞送的活空腸彎曲桿菌81-176細(xì)胞的攻擊中的效力。以磷酸鹽緩沖液(PBS；實(shí)線)，PBS加L7佐劑(佐劑；虛線)，福爾馬林滅活的按照實(shí)施例5生長(zhǎng)和收獲的空腸彎曲桿菌81-176完整細(xì)胞不加佐劑(CWC；空心圈/實(shí)線)，或加入LT佐劑(CWC+佐劑；實(shí)心圈/實(shí)線)接種小鼠。使用腸道移生實(shí)驗(yàn)檢測(cè)疫苗效力。圖7A(上圖)顯示了每劑量使用3個(gè)105滅活細(xì)菌顆粒的口服劑量進(jìn)行接種所提供的預(yù)防結(jié)果。圖7B(中圖)顯示了每劑量使用3個(gè)107滅活細(xì)菌顆粒的口服劑量進(jìn)行接種所提供的預(yù)防結(jié)果。圖7C(下圖)顯示了每劑量使用3個(gè)109滅活細(xì)菌顆粒的口服劑量進(jìn)行接種所提供的預(yù)防結(jié)果。詳見(jiàn)11部分實(shí)施例34。圖8A，8B和8C圖示了含有滅活的空腸彎曲桿菌81-176完整細(xì)胞的疫苗在保護(hù)小鼠免受鼻腔遞送的活空腸彎曲桿菌81-176細(xì)胞的攻擊中的效力。如圖7A，7B和7C的簡(jiǎn)述所描述的那樣接種小鼠。使用腸道移生實(shí)驗(yàn)檢測(cè)疫苗效力。圖8A(上圖)顯示了每劑量使用3個(gè)105滅活細(xì)菌顆粒的口服劑量進(jìn)行接種所提供的預(yù)防結(jié)果。圖8B(中圖)顯示了每劑量使用3個(gè)107滅活細(xì)菌顆粒的口服劑量進(jìn)行接種所提供的預(yù)防結(jié)果。圖8C(下圖)顯示了每劑量使用3個(gè)109滅活細(xì)菌顆粒的口服劑量進(jìn)行接種所提供的預(yù)防結(jié)果。詳見(jiàn)9部分實(shí)施例34。圖9圖示了當(dāng)弗氏志賀氏菌2457T細(xì)胞侵襲時(shí)的弗氏志賀氏菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)期的效應(yīng)。傳統(tǒng)生長(zhǎng)的弗氏志賀氏菌2457T(BHI)，或按照如實(shí)施例9所例舉的本發(fā)明的方法所生長(zhǎng)的(DOC-EL)-當(dāng)培養(yǎng)物處于對(duì)數(shù)早期時(shí)收獲細(xì)胞，或按照實(shí)施例9，但是在收獲細(xì)胞前，讓培養(yǎng)物達(dá)到對(duì)數(shù)晚期(DOC-LL)。顯示了這些不同的細(xì)胞制備物的侵襲力。詳見(jiàn)12部分實(shí)施例35。圖10圖示了當(dāng)按照本發(fā)明的方法培養(yǎng)時(shí)，弗氏志賀氏菌細(xì)胞侵襲力的提高。宋內(nèi)氏志賀氏菌和痢疾志賀氏菌按傳統(tǒng)方法培養(yǎng)(BHI)或如實(shí)施例9所例舉的本發(fā)明的方法培養(yǎng)。顯示了這些志賀氏菌細(xì)胞的不同制備物對(duì)于INT-407細(xì)胞的侵襲力。詳見(jiàn)12部分實(shí)施例35。圖11圖示了按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的志賀氏菌交叉免疫反應(yīng)的提高。按照如實(shí)施例9例舉的本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的弗氏志賀氏菌2457T用于誘導(dǎo)抗體。圖示了，誘導(dǎo)對(duì)于傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)，或根據(jù)如實(shí)施例9例舉的本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的弗氏志賀氏菌，宋內(nèi)氏志賀氏菌，痢疾志賀氏菌和鮑地氏志賀氏菌的血清型的抗體凝集活力，詳見(jiàn)12部分實(shí)施例36。圖12圖示了當(dāng)HelicobacterpyloriNB3-2細(xì)胞粘附時(shí)，Helicobacterpylori培養(yǎng)物的膽汁濃度的效應(yīng)，和生長(zhǎng)期。H.pyloriNB3-2細(xì)胞生長(zhǎng)在含有0％，0.025％，0.05％或0.1％膽汁的培養(yǎng)基中，和在接種后8，10，12和18小時(shí)收獲。顯示了這些不同的H.pyloriNB3-2制備物對(duì)于INT-407細(xì)胞的侵襲力，詳見(jiàn)14部分實(shí)施例38。圖13圖示了當(dāng)HelicobacterpyloriG1-4細(xì)胞粘附時(shí)，Helicobacterpylori培養(yǎng)物的膽汁濃度的效應(yīng)，和生長(zhǎng)期。H.pyloriG1-4細(xì)胞生長(zhǎng)在含有0％，0.1％或0.2％膽汁的培養(yǎng)基中，和在接種后6，8，10，12，14和16小時(shí)收獲。顯示了這些不同的H.pyloriG1-4制備物對(duì)于INT-407細(xì)胞的侵襲力，詳見(jiàn)15部分實(shí)施例38。發(fā)明詳述本發(fā)明的方法涉及在選擇用于誘導(dǎo)或提高抗原和/或毒力因子表達(dá)的某些條件和某些組分的組合之下，體外生長(zhǎng)腸細(xì)菌。在此和在權(quán)利要求中所用的術(shù)語(yǔ)“腸”指正常地在動(dòng)物胃腸道的任何部分發(fā)現(xiàn)或與之相關(guān)的細(xì)菌和引起動(dòng)物胃腸道的任何部分感染的任何細(xì)菌。這樣的腸細(xì)菌包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。在此和在權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)“組分”和“條件”涉及與腸細(xì)菌自然體內(nèi)環(huán)境相關(guān)的許多因素和其它因素。這些“組分”和“條件”包括但不限于、膽汁、膽汁酸或其鹽或其生物學(xué)前體如膽甾醇，pH，微需氧條件，滲透壓，和在期望的細(xì)菌生長(zhǎng)期收獲和收集細(xì)菌。在此和在權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)“抗原”和其相關(guān)術(shù)語(yǔ)“抗原的”包括抗原或抗原特性，包括，但不限于，有助于細(xì)胞形態(tài)學(xué)或細(xì)胞運(yùn)送性的大分子；蛋白質(zhì)；更具體的是表面蛋白，脂多糖和碳水化合物。優(yōu)選地，所述抗原是免疫原性的。在此和在權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)“免疫原性”是指當(dāng)所述動(dòng)物暴露于包含本發(fā)明產(chǎn)生的完整細(xì)菌或完整細(xì)菌的片段的組合物后，能夠在動(dòng)物中誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力。在此和在權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)“抗原性提高的”或“提高的抗原特性”或“提高的”，是指按本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的腸細(xì)菌的抗原狀態(tài)。與傳統(tǒng)方法生長(zhǎng)的同一細(xì)胞相比，具有某些免疫原性抗原的較高水平和/或新的免疫原性抗原。在此和在權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)“傳統(tǒng)的”涉及先有技術(shù)中已知的。在此和在權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)“微需氧條件”指厭氧條件或提高的CO2水平，例如5％至20％CO2和80％至95％的空氣，5％至20％CO2和80％至95％N2；或5％至10％O2和10％至20％CO2和70％至85％N2。在此和在權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)“毒力”是指腸細(xì)菌的那些與粘附和/或侵襲和/或在宿主中存活和/或引起病理狀況的因子。在此和在權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)“免疫交叉保護(hù)”是指由一種細(xì)菌菌株或血清型，以完整細(xì)胞或其他形式，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以保護(hù)或減弱同一宿主被不同細(xì)菌菌株，血清型，或同屬的種的感染的能力。在此和在權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)“免疫交叉反應(yīng)”是指由一種細(xì)菌菌株或血清型，以完整細(xì)胞或其他形式，誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，和不同細(xì)菌菌株，血清型，或同屬的種交叉反應(yīng)(即，抗體結(jié)合)能力。免疫交叉反應(yīng)性是細(xì)菌免疫原免疫交叉保護(hù)潛能的指征。反之亦然。在此和在權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)“宿主”是指在體內(nèi)，為動(dòng)物，在體外為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物。在此和在權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”包括但不限于所有熱血生物例如哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)(e.g.，雞，火雞，鴨等)。根據(jù)本發(fā)明，在一包含抗原性提高的腸細(xì)菌或其免疫片段或其衍生物的疫苗中，腸細(xì)菌可以是活細(xì)菌或可以是滅活的，可以還包括一種佐劑，例如，但不限于，鋁，油-水乳劑，來(lái)自于腸毒性大腸桿菌非毒性形式(如mLT)的熱不穩(wěn)定毒素和/或其單個(gè)亞基，卡介菌(BCG)，或弗氏佐劑，還可以包括一種合適的藥用載體包括但不限于鹽水，萄聚糖或其他水溶液。其他合適的藥用載體在Mack出版公司出版的Remington′sPharmaceuticalSciences中描述，這是該領(lǐng)域的一本標(biāo)準(zhǔn)參考書(shū)。在此和在權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)“疫苗”也包括“被動(dòng)疫苗”，包含與所尋求其感染或疾病保護(hù)的病原體特異性結(jié)合的抗體。在此和在權(quán)利要求中所用術(shù)語(yǔ)“滅活細(xì)菌”，是指不能夠感染和/或移生的腸細(xì)菌，包括減毒和殺死的細(xì)菌。減毒的細(xì)菌可以復(fù)制但不能引起感染或疾病。所述病毒的滅活可以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法完成。例如，細(xì)菌可以化學(xué)滅活，例如通過(guò)福爾馬林固定，或物理滅活，例如通過(guò)熱，超聲或輻射，這樣，造成它們不能夠復(fù)制和/或感染和/或引起疾病。應(yīng)施用有效量的疫苗，其中“有效量”被定義為腸細(xì)菌或其免疫原性片段或其衍生物的能夠在受試者體內(nèi)引起免疫應(yīng)答的量。所需的量隨所使用的細(xì)菌，片段，或衍生物的抗原性，和待接種的受試者的種和體重而變化，但可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)確定。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的，非限制性實(shí)施方案中，有效量的疫苗造成至少是接種前抗體滴度兩倍的抗細(xì)菌抗體滴度的提高。在一優(yōu)選的、具體的、非限制性的本發(fā)明實(shí)施方案中，給宿主施用大約107至1011，優(yōu)選108至1010細(xì)菌。優(yōu)選的是包含滅活的完整細(xì)菌的疫苗。術(shù)語(yǔ)“有效量”用于被動(dòng)疫苗時(shí)，是能夠阻止或減弱一種細(xì)菌疾病或感染的抗體的量。所需的量隨抗體的種類(lèi)和抗體的滴度，和待接種的受試者的種和體重而變動(dòng)，但可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定。本發(fā)明的疫苗可以用本領(lǐng)域已知任何方式局部或全身施用，包括但不限于，靜脈，皮下，肌肉，陰道內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，口服或其他粘膜途徑。疫苗可以在一合適的，非毒性藥用載體內(nèi)給藥，可以包含于微膠囊中，和/或是含于緩釋植入物中。合意地，疫苗在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)施用，以維持抗體水平。本發(fā)明的疫苗可以同其他殺菌或制菌方法共同使用。本發(fā)明的抗體可以任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)方法獲得，例如，但不限于AntibodiesALaboratoryManual(EHarlow，D，Lane，冷泉港出版社。1989)。一般說(shuō)來(lái)，用本發(fā)明的抗原性提高的腸細(xì)菌的完整細(xì)胞或其免疫原性片段或其衍生物，在有或沒(méi)有一種佐劑或?qū)⑻岣呙庖咴ЯΦ娜魏位瘜W(xué)劑的條件下，免疫動(dòng)物(可以使用很大范圍的脊椎動(dòng)物種，最常見(jiàn)的是小鼠，大鼠，豚鼠，倉(cāng)鼠和兔)，在定期的時(shí)間間隔加強(qiáng)免疫。以任何便利的方法測(cè)試動(dòng)物血清中所期望抗體的存在。所述動(dòng)物的血清或血可以用作多克隆抗體的來(lái)源。就單克隆抗體而言，以上述方法處理動(dòng)物。檢測(cè)到可接受的抗體滴度后，將動(dòng)物實(shí)行安死術(shù)，無(wú)菌取脾以用于融合。脾細(xì)胞與特別選擇的永生化骨髓瘤細(xì)胞系混合，將混合物暴露于能夠促進(jìn)細(xì)胞融合的化學(xué)劑，典型地是聚乙二醇等。在這一環(huán)境下，融合隨機(jī)地發(fā)生，融合的細(xì)胞和每一種未融合的細(xì)胞的混合物是生成的產(chǎn)物，用于融合的骨髓瘤細(xì)胞系是特別選擇的，這樣，通用使用選擇性培養(yǎng)基，例如HAT次黃嘌呤、氨基蝶呤、和胸腺嘧啶，在培養(yǎng)物中，來(lái)自于融合混和物的能夠持續(xù)存在的僅有的細(xì)胞是那些衍生自免疫供體的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞之間的雜種細(xì)胞，融合之后，將細(xì)胞稀釋，在選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基用于篩選對(duì)于選定的抗原有期望的特異性的抗體的出現(xiàn)。通過(guò)有限稀釋將含有選擇的抗體的培養(yǎng)物克隆，直至可以推定細(xì)胞培養(yǎng)物是單細(xì)胞來(lái)源的。本發(fā)明的抗體可以用作腸細(xì)菌感染和疾病的被動(dòng)疫苗。用于在宿主體內(nèi)檢測(cè)抗體或所述細(xì)菌的方法包括免疫反應(yīng)。這些免疫反應(yīng)是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于放免實(shí)驗(yàn)(RIA)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，熒光免疫實(shí)驗(yàn)，和熒光極性化免疫實(shí)驗(yàn)(FPIA)。另一實(shí)施方案包括一種診斷試劑盒，其中包含進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的所期待的免疫實(shí)驗(yàn)所需的所有必需試劑。診斷試劑盒可以商業(yè)化包裝形式存在，是一個(gè)或多個(gè)裝有必需試劑的容器的組合。這樣一個(gè)試劑盒包含本發(fā)明的腸道桿菌，和/或本發(fā)明的單克隆或多克隆抗體，以及幾種傳統(tǒng)的試劑盒組分。傳統(tǒng)的試劑盒組分對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，公開(kāi)于多種出版物中、包括AntibodiesALaboratoryManual(E.Harlow.D.Lane，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)。傳統(tǒng)的試劑盒組分可以包括這些物品，例如，微滴度板，用于保持實(shí)驗(yàn)混合物的pH的緩沖液(例如，但不限于Tris，HEPES，等)。結(jié)合的第二抗體，如過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗鼠IgG(或任何抗第一抗體衍生來(lái)源動(dòng)物的抗-IgG)等，和其他標(biāo)準(zhǔn)試劑。本發(fā)明的方法包括將腸細(xì)菌在一合適的基礎(chǔ)必需培養(yǎng)基生長(zhǎng)，例如，但不限于可商購(gòu)的腦心浸液肉湯“BHI”，Laria肉湯“LB”，羊血瓊脂“SBA”，Brucella肉湯，Meuller-Hinton肉湯，牛提取物蛋白酶水解胨肉湯，等。以及各種條件和組分，包括但不限于0.05％至3％膽汁或0.025％至0.6％的一種或多種膽汁酸或其鹽，或其生物學(xué)前體，例如膽甾醇，在30℃至42℃溫度下，直到其生長(zhǎng)期處于大約早對(duì)數(shù)期，早對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期之間，或大約在穩(wěn)定期，在空氣中或微需氧條件下，例如5％至20％CO2和80％至95％空氣；5％至20％CO2和80％至95％N2；或5％至10％O2和10％至20％CO2和70％至85％N2；和任選的二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑的出現(xiàn)，例如，但不限于0至100μM，優(yōu)選25μMBAPTA/AM(2′(亞乙基二氧基)二亞氨n，n.n′，n′-四乙酸/乙酰氧甲基酯；分子探針，Engene，OR)，0至10mMEGTA(亞乙基二(氧亞乙基次氮基)-四乙酸；西格瑪化學(xué)公司，St.Lovis，MO)，0至100μMEGTA/AM(亞乙基二(氧亞乙基次氮基)-四乙酸/乙酰氧甲基酯，分子探針，Eugeme，OR)；這樣條件和組分的組合產(chǎn)生了抗原提高的腸細(xì)菌。根據(jù)另一實(shí)驗(yàn)方案，本發(fā)明的方法亦包括將腸細(xì)菌生長(zhǎng)于以上描述的條件，只有一點(diǎn)不同即在二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑出現(xiàn)的情況下生長(zhǎng)，例如，但不限于1.0至100μM，優(yōu)選25μMBAPTA/AM，0.5至10mMEGTA、或1.0至100μMEGTA/AM，但是沒(méi)有膽汁，膽汁酸或膽汁鹽?？捎糜诒景l(fā)明的膽汁或膽汁酸或其鹽包括任何由肝分泌正常情況下積聚于膽囊中的天然膽汁化合物，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的那些合成膽汁酸，例如但不限于“OXGALL”(Difco實(shí)驗(yàn)室底特律，密西根)，牛膽汁(SigmaChemicals，StLouis，密蘇里)或其他可商購(gòu)的制備物，膽酸，脫氧膽酸(DOC)，?；悄懰岷透拾蹦懰?。優(yōu)選的是脫氧膽酸，它是可商購(gòu)的膽汁酸，在體內(nèi)出現(xiàn)在被某些腸細(xì)菌移生的小腸遠(yuǎn)側(cè)和大腸的位點(diǎn)。同樣優(yōu)選的有甘氨膽酸(GC)。根據(jù)本發(fā)明選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類(lèi)桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門(mén)氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌的腸細(xì)菌培養(yǎng)物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備成冷凍原種，于-80℃保藏備用。例如，可以通過(guò)在含有5％去纖維蛋白綿羊紅細(xì)胞(SBA)的胰酶水解大豆瓊脂上，于37℃，在5％O2，10％CO2，85％N2微需氧環(huán)境，“MC”將生物體生長(zhǎng)20小時(shí)。來(lái)獲得空腸彎曲桿菌原種?？梢酝ㄟ^(guò)在腦心浸液肉湯(“BHI”)生長(zhǎng)生物體而制備大腸桿菌，鼠傷寒沙門(mén)氏菌，Helicobacterpylori和弗氏志賀氏菌的原種?？捎萌魏我阎绞绞斋@細(xì)菌用于冷凍，例如拭取培養(yǎng)物重懸于含30％甘油的BHI中。用于分析實(shí)驗(yàn)及用于發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)物可以用任何已知的方法制備，例如將生物體于37℃，在含1.5％瓊脂的BHI，于MC或大氣條件下培養(yǎng)，然后將單菌落轉(zhuǎn)移到肉湯之中，按本發(fā)明描述的方法培養(yǎng)。用任何本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的方法例如離心收獲細(xì)菌備用。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，彎曲桿菌屬細(xì)菌，優(yōu)選的是空腸或大腸，最優(yōu)選是空腸81-176的抗原性提高的細(xì)胞，生長(zhǎng)于基礎(chǔ)必需培養(yǎng)基，優(yōu)選BHI肉湯，附加地包括大約0.1％DOC或大約0.8％膽汁，于37℃，大約10％至20％CO2與大約80％-90％空氣的混合物中，當(dāng)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)達(dá)到晚對(duì)數(shù)期至穩(wěn)定期，典型地是接種后20h之后收獲。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，志賀氏菌屬細(xì)菌，優(yōu)選的是弗氏或痢疾，最優(yōu)選的是弗氏2457T菌株的抗原提高的細(xì)胞，生長(zhǎng)與基礎(chǔ)必需培養(yǎng)基，優(yōu)選BHI肉湯，附加地包括大約0.1％DOC或大約0.8％膽汁，于37℃，空氣中，當(dāng)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)達(dá)到約早對(duì)數(shù)期后，典型地是接種早至中對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物后30min之后收獲。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，Helicobacterpylori，優(yōu)選的是ATCC49503，NB3-2或G1-4的抗原性提高的細(xì)胞，生長(zhǎng)于基礎(chǔ)必需培養(yǎng)基，優(yōu)選BHI肉湯，附加地包括大約0.05％至大約0.2％膽汁或大約0.05％甘氨膽酸(GC)，于37℃，大約5％至20％CO2與大約80％-95％空氣或大約10％CO2和約5％O2和85％N2的混合物中，當(dāng)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)達(dá)到大約對(duì)數(shù)期至大約穩(wěn)定期收獲。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在培養(yǎng)物大約達(dá)到對(duì)數(shù)期時(shí)收獲。根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)的腸細(xì)菌具有改變的形態(tài)，和/或細(xì)胞游動(dòng)性和/或產(chǎn)生一些新蛋白。脂多糖和/或碳水化合物和/或與單用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞相比，具有水平改變的大分子?？梢源_定提高細(xì)胞產(chǎn)量的最佳培養(yǎng)條件，和病原性的指征。采用這些培養(yǎng)條件可以確定提高的或誘導(dǎo)的毒力-相關(guān)抗原。通過(guò)鏡檢未處理的或染色的細(xì)菌，看到游動(dòng)性和肉眼可視的形態(tài)學(xué)改變。很可能其他的、可能由本發(fā)明的方法引起的形態(tài)學(xué)改變可以用電鏡和熒光顯微鏡看到。根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)的腸細(xì)菌的形態(tài)學(xué)和粘液樣特征提示可能誘導(dǎo)了莢膜和/或表面層的表達(dá)。為了檢測(cè)莢膜的產(chǎn)生，可以制備表面組分的苯酚提取物，如蛋白，碳水化合物和脂多糖。通過(guò)高壓液相色譜(HPLC)看到提高的碳水化合物。從在本發(fā)明的毒力提高的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的腸細(xì)菌制備的外膜的蛋白分布(profile)可以通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳表征，并與來(lái)自于生長(zhǎng)在傳統(tǒng)培養(yǎng)基的生物體的外膜蛋白分布相比較。進(jìn)行SDS-PAGE以評(píng)價(jià)響應(yīng)抗原性提高或改變條件在細(xì)菌細(xì)胞的和提取的蛋白中誘導(dǎo)的變化。這些數(shù)據(jù)提供了涉及提高的侵襲力或改變的抗原性相關(guān)的表面變化的定性和定量信息。誘導(dǎo)的或改變的蛋白抗原的免疫潛能可由WesternBlotting確定。由SDS-PAGE確定的誘導(dǎo)的或改變的細(xì)菌蛋白抗原的免疫原性可由如下所述且普遍接受的WesternBlotting技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。任何來(lái)源的抗體均可用于測(cè)定細(xì)菌抗原，例如恢復(fù)期免疫兔或白鼬血清(來(lái)自于用傳統(tǒng)生長(zhǎng)或根據(jù)本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的活生物體口服感染的動(dòng)物的抗體來(lái)源)，腸道粘液(IgA抗體來(lái)源)，多克隆抗血清，或單克隆抗體，例如一個(gè)與空腸彎曲桿菌鞭毛抗原交叉反應(yīng)的單抗。幾種這些細(xì)菌抗原的提高的產(chǎn)生伴隨著毒力相關(guān)特性的提高。這些特性包括培養(yǎng)的人腸道上皮細(xì)胞粘附和侵襲性，和剛果紅染料結(jié)合。剛果紅染料結(jié)合試驗(yàn)是一普遍接受的方法，預(yù)言毒力，在下面Andrews等.(Infect.Immun603287-3295，1992)，和Yoder(AvianDis.33502-505，1989)中有所描述。細(xì)菌結(jié)合剛果紅表明結(jié)合氯化血紅素的能力，這種結(jié)合血紅素的能力與毒力相關(guān)。剛果紅結(jié)合亦相關(guān)于提高的上皮細(xì)胞的細(xì)菌侵襲。已前已證實(shí)多數(shù)傳統(tǒng)生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌Lior血清型不是免疫交叉反應(yīng)性的?；诖诵畔ⅲ苽浜褪┯脦追NLior血清型菌株的多種疫苗或復(fù)合疫苗以獲得對(duì)于彎曲桿菌的普遍保護(hù)是必需的。根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的抗原性提高的彎曲桿菌與那些傳統(tǒng)生長(zhǎng)獲得的彎曲桿菌相比，是針對(duì)更廣范圍的Lior血清型免疫-交叉反應(yīng)性的。同樣的，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的抗原性提高的志賀氏菌，與那些傳統(tǒng)生長(zhǎng)獲得的志賀氏菌相比，針對(duì)更廣范圍的志賀氏菌菌種是免疫-交叉反應(yīng)性的，和免疫-交叉保護(hù)性的。這些免疫-交叉反應(yīng)性和免疫-交叉保護(hù)性的特性為下述凝集反應(yīng)和疫苗研究的結(jié)果所證明。用于產(chǎn)生抗原性提高的腸細(xì)菌的本發(fā)明的方法關(guān)系到小動(dòng)物模型中提高的毒力。幾種馴養(yǎng)的動(dòng)物可以用作人類(lèi)彎曲桿菌疾病的模型。大多數(shù)立足于免疫效力的研究是Caldwell等人(Infect.Immun.，421176-1182，1983)的可逆性腸結(jié)，成年兔腹瀉(RITARDModel)。這一模型也證明了Lior血清型和交叉-菌株保護(hù)之間的聯(lián)系。然而，這一模型用來(lái)測(cè)量對(duì)移生的抗性，而不是對(duì)于疾病的抗性。Bell等人(Infect.Immun.，581848-1852，1990)的白鼬模型可能是一更有用的模型，因?yàn)樵搫?dòng)物確實(shí)出現(xiàn)如人類(lèi)彎曲桿菌疾病的疾病癥狀。一個(gè)更新的模型是Bagar(感染和免疫，633731-3755，1995)的小鼠移生模型。該模型涉及免疫法，然后用活的彎曲桿菌鼻腔或口服攻擊免疫小鼠，然后經(jīng)監(jiān)測(cè)糞樣中彎曲桿菌的出現(xiàn)而檢查腸移生。就志賀氏菌來(lái)說(shuō)，如Mallett等人(見(jiàn)下面13部分)描述的小鼠鼻攻擊實(shí)驗(yàn)被用于評(píng)價(jià)毒力和疫苗效力。就Helicobacterpylori，陳等(柳葉刀，3391120-1121，1992)描述的Helicobacterfelis胃移生模型被用于評(píng)價(jià)由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的H.pylori疫苗潛能。還有涉及腸細(xì)菌侵襲和感染的其他動(dòng)物模型，它們可用于測(cè)試按本發(fā)明的方法產(chǎn)生的提高的腸細(xì)菌的疫苗效力。按本發(fā)明的方法產(chǎn)生的抗原性提高的腸道桿菌用于制備原型死的完整細(xì)胞或亞單位疫苗。當(dāng)施用于動(dòng)物時(shí)，這些疫苗可顯示出誘導(dǎo)抗體因而建立了疫苗保護(hù)性潛能。在一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中這些抗原的提高或誘導(dǎo)產(chǎn)生了制成更有效力疫苗的細(xì)胞。用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的疫苗候選者制劑可用于多種粘膜免疫戰(zhàn)略以誘導(dǎo)腸免疫應(yīng)答。成功的免疫法方案可以用于保護(hù)用有或沒(méi)有提高的免疫原性的病原體攻擊的動(dòng)物。疫苗亦可作為復(fù)合疫苗配制和檢測(cè)，例如，志賀氏菌和彎曲桿菌或其組分可以復(fù)合成一個(gè)單一疫苗。下面描述的實(shí)驗(yàn)性探索使檢測(cè)與提高的侵襲力相關(guān)的表面抗原和其他特性的改變成為可能。這些變化既是質(zhì)的又是量的。最重要的，這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，本發(fā)明的方法提高了侵襲力，誘導(dǎo)了免疫原性相關(guān)抗原。這樣的抗原性提高的細(xì)菌誘導(dǎo)了與傳統(tǒng)生長(zhǎng)細(xì)菌相比，保護(hù)免受更廣范圍的細(xì)菌菌株，血清型和/或種的細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答，因而可用作有效的疫苗。已有幾種完善建立的，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的模型，并如下所述，可用于評(píng)價(jià)提高的抗原特性，細(xì)菌毒力和疫苗效力。下面描述了非限制性實(shí)施例。實(shí)施例產(chǎn)生提高的抗原細(xì)菌的方法實(shí)施例1?？漳c彎曲桿菌81-176株在血瓊脂平板上劃線(含有胰酶水解大豆瓊脂，加5％去纖維蛋白綿羊紅細(xì)胞)在微需氧GasPak(BBLCockeysville，MD)發(fā)酵罐中于37℃溫孵20小時(shí)。拭取細(xì)菌層，接種至盛有1升在10％CO2，90％空氣中預(yù)平衡的、含有0.8％OXGALL(Difco，Detroit，MI)BHI培養(yǎng)基的三角瓶中。培養(yǎng)物在一密封瓶中，在10％CO2，90％空氣中，于37℃振搖溫孵20小時(shí)，然后如上述收獲。實(shí)施例2?？漳c彎曲桿菌81-176株在血瓊脂平板上劃線(含有胰酶水解大豆瓊脂，加5％去纖維蛋白綿羊紅細(xì)胞)在微需氧GasPak(BBLCockeysville，MD)發(fā)酵罐中于37℃溫孵20小時(shí)。拭取細(xì)菌層，接種至盛有1升在10％CO2中預(yù)平衡的、含有0.01％-0.1％脫氧膽酸鈉(DOC)BHI培養(yǎng)基的三角瓶中(將DOC作為與BHI培養(yǎng)基分開(kāi)的母液而配制和高壓滅菌，并且在接種之前將其無(wú)菌地加至BHI培養(yǎng)基，使其終濃度為0.01％-0.1％是至關(guān)重要的)。培養(yǎng)物在5％O2，10％CO2，85％N2中，于37℃振搖溫孵不同時(shí)間，最多達(dá)20小時(shí)，然后如上述收獲。實(shí)施例3?？漳c彎曲桿菌81-176株在血瓊脂平板上劃線(含有胰酶水解大豆瓊脂，加5％去纖維蛋白綿羊紅細(xì)胞)在微需氧GasPak(BBLCockeysville，MD)發(fā)酵罐中于37℃溫孵20小時(shí)。拭取細(xì)菌層，接種至盛有1升在10％CO2中預(yù)平衡的、含有0.01％至0.1％脫氧膽酸鈉的Brucella肉腸的三角瓶中。培養(yǎng)物在5％O2，10％CO2，85％N2中，于37℃振搖溫孵20小時(shí)，然后如上述收獲。實(shí)施例4。空腸彎曲桿菌81-176株在血瓊脂平板上劃線(含有胰酶水解大豆瓊脂，加5％去纖維蛋白綿羊紅細(xì)胞)在微需氧GasPak(BBLCockeysville，MD)發(fā)酵罐中于37℃溫孵20小時(shí)。拭取細(xì)菌層，接種至盛有1升在10％CO2中預(yù)平衡的、含有0.01％至0.1％脫氧膽酸鈉的Mueller-Hinton肉湯的三角瓶中。培養(yǎng)物在5％O2，10％CO2，85％N2中，于37℃振搖溫孵20小時(shí)，然后如上述收獲。實(shí)施例5?？漳c彎曲桿菌81-176株在血瓊脂平板上劃線(含有胰酶水解大豆瓊脂，加5％去纖維蛋白綿羊紅細(xì)胞)在微需氧GasPak(BBLCockeysville，MD)發(fā)酵罐中于37℃溫孵20小時(shí)。拭取細(xì)菌層，接種至盛有1升在10％CO2中預(yù)平衡的、含有0.1％脫氧膽酸鈉的BHI培養(yǎng)基的三角瓶中。培養(yǎng)物在10％CO2，90％空氣中，于37℃緩慢振搖20小時(shí)，然后如上述收獲。實(shí)施例6?；魜y弧菌在BHI瓊脂平板上劃線在空氣中于37℃溫孵20小時(shí)。拭取細(xì)菌層，接種至盛有1升含有0.1％脫氧膽酸的BHI培養(yǎng)基的三角瓶中。培養(yǎng)物在空氣中，于37℃振搖溫孵20小時(shí)，然后如上述收獲。實(shí)施例7?；魜y沙門(mén)氏菌在BHI瓊脂平板上劃線在空氣中于37℃溫孵20小時(shí)。拭取細(xì)菌層，接種至盛有1升含有0.1％脫氧膽酸的BHI培養(yǎng)基的三角瓶中。培養(yǎng)物在空氣中，于37℃振搖溫孵20小時(shí)，然后如上述收獲。實(shí)施例8。鼠傷寒沙門(mén)菌在LB瓊脂平板上劃線，在空氣中于37℃溫孵20小時(shí)。拭取細(xì)菌層，接種至盛有1升含有0.1％脫氧膽酸鈉的BHI培養(yǎng)基的三角瓶中。培養(yǎng)物在10％CO2，90％空氣中，于37℃振搖溫孵20小時(shí)，將一個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至1升含有0.1％脫氧膽酸鈉的LB培養(yǎng)基然后在密封瓶中于37℃緩慢振搖溫孵，12小時(shí)后，將60mL培養(yǎng)物稀釋至1升同種新鮮預(yù)熱培養(yǎng)基中，再溫孵30分鐘，然后如上述收獲。實(shí)施例9。弗氏志賀氏菌在剛果紅瓊脂平板上劃線，在空氣中于37℃溫孵20小時(shí)。將一紅色菌落接種至盛有1升BHI培養(yǎng)基的三角瓶中。振搖溫孵12小時(shí)，50mL這種培養(yǎng)物用于接種250mL預(yù)熱的含有0.1％脫氧膽酸鈉的BHI培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在空氣中于37℃振搖4小時(shí)。這種培養(yǎng)物用預(yù)熱含有0.1％DOC的BHI稀釋至OD600為大約0.17，在空氣中于37℃振搖30分鐘，然后如上述收獲。實(shí)施例10?？漳c彎桿菌81-176，81-116或HC株(在含有30％甘油的BHI中)快速解凍，在羊血瓊脂平板上劃線(SBA每板0.1mL)。接種平板在備有CampyPakPlus微需氧環(huán)境發(fā)生器的GasPak(BBLCockeysville，MD)發(fā)酵罐中于37℃溫孵20小時(shí)。拭取細(xì)菌層，細(xì)菌重懸于10mlBHI培養(yǎng)基中，接種至盛有1升在10％CO2，90％空氣中預(yù)平衡的、含有或不含有0.1％DOC的BHI培養(yǎng)基的2L三角瓶中。培養(yǎng)物加入預(yù)平衡的培養(yǎng)基中，直到OD625等于0.05。接種瓶返回10％CO2，90％空氣中，于37℃緩慢振搖溫孵20小時(shí)，然后如上述收獲。實(shí)施例11。Helicobacterpylori加入加了4％小牛血清的BHI。接種后，三角瓶中充入5％O2，10％CO2，85％N2，于37℃振搖溫孵22h。溫孵后，2.5mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到盛有含4％小牛血清的BHI培養(yǎng)基，或盛有與上述相同，另外還含0.05％甘氨膽酸鈉的培養(yǎng)基的三角瓶中，這些培養(yǎng)物再充入微需氧氣體混合物(5％O2，10％CO2，85％N2)。于37℃溫孵20-24小時(shí)，細(xì)菌如上述收獲。實(shí)施例12。鼠傷寒沙門(mén)氏菌(在帶有30％甘油的LB中)在LB瓊脂板上劃線，在空氣中于37℃培養(yǎng)18-20h挑取一個(gè)菌落，轉(zhuǎn)移到三角瓶中的1升LB或含0.1％DOC的LB中，三角瓶中充入10％CO2，5％CO2，85％N2，密封于37℃，振搖溫孵12h。該細(xì)菌然后用同一培養(yǎng)基稀釋至OD600為0.17，在同樣條件下溫孵到對(duì)數(shù)早期，典型地，是稀釋后30分鐘，細(xì)菌如上述收獲。實(shí)施例13。鼠傷寒沙門(mén)氏菌在LB瓊脂平板上劃線，于37℃空氣中溫孵18-20小時(shí)。挑取一個(gè)菌落轉(zhuǎn)至1LLB或含有0.1％DOC的LB中，于37℃空氣中溫孵12小時(shí)。培養(yǎng)物用同一新鮮培養(yǎng)基稀釋(1/5)，在相同條件下溫孵4小時(shí)。培養(yǎng)物再用同一新鮮培養(yǎng)基稀釋，至OD600為大約0.17，在相同條件下溫孵，直到培養(yǎng)物達(dá)到對(duì)數(shù)期，典型地，是稀釋后30分鐘，然后如上述收獲細(xì)胞。實(shí)施例14。肺炎克雷白氏菌在BHI瓊脂平板上劃線，于37℃空氣中溫孵18-20小時(shí)。挑取一個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至1LBHI或含有0.1％DOC的BHI中，于37℃空氣中溫孵12小時(shí)。培養(yǎng)物用同一新鮮培養(yǎng)基稀釋至OD600為大約0.17，再生長(zhǎng)30分鐘，然后如上述收獲。實(shí)施例15。Enterobactercloacae在BHI瓊脂平板上劃線，于37℃空氣中溫孵18-20小時(shí)。挑取一個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至1LBHI或含有0.1％DOC的BHI中，于37℃空氣中溫孵12小時(shí)。培養(yǎng)物用同一新鮮培養(yǎng)基稀釋至OD600為大約0.17，再生長(zhǎng)30分鐘，然后如上述收獲。實(shí)施例16。大腸桿菌0157H7在綿羊血瓊脂平板上劃線，于37℃空氣中溫孵18-20小時(shí)。挑取一個(gè)菌落接種至1LBHI或含有0.1％～0.2％DOC的BHI的三角瓶中，于37℃振搖12小時(shí)。培養(yǎng)物稀釋至OD600為大約0.17，再生長(zhǎng)30分鐘，然后如上述收獲。實(shí)施例17。Enterococcusfaecalis在綿羊血瓊脂平板上劃線，于37℃振搖18-20小時(shí)。挑取一個(gè)菌落接種至1LBHI或含有0.1％DOC的BHI的三角瓶中，于37℃空氣中溫孵12小時(shí)。培養(yǎng)物稀釋至OD600為大約0.17，再生長(zhǎng)30分鐘，然后如上述收獲。實(shí)施例18。難辨梭狀芽孢桿菌(在含30％甘油的改進(jìn)碎肉培養(yǎng)基上)在含1.5％瓊脂的用于厭氧的牛肝培養(yǎng)基平板上劃線，于37℃在微需氧(5％CO2，95％N2)條件下培養(yǎng)。挑取一個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至1L含有或不含有0.1％DOC的改進(jìn)碎肉培養(yǎng)基中，細(xì)菌于37℃微需氧條件下溫孵12小時(shí)。然后如上述收獲。實(shí)施例19。脆弱類(lèi)桿菌(在含30％甘油的改進(jìn)碎肉培養(yǎng)基上)在改進(jìn)的碎肉培養(yǎng)基瓊脂平板上劃線，于37℃在微需氧(5％CO2，95％N2)條件下培養(yǎng)。挑取一個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至1L含有或不含有0.1％DOC的改進(jìn)碎肉培養(yǎng)基中，細(xì)菌于37℃微需氧條件下溫孵12小時(shí)。然后如上述收獲。實(shí)施例20。假結(jié)核耶爾森氏菌(在含30％甘油的LB培養(yǎng)基)在LB瓊脂平板上劃線于30℃溫孵。將一個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至1LLB中于30℃溫孵12小時(shí)。培養(yǎng)物用含有或不含有0.1％DOC的LB稀釋(1/5)，在37℃下溫孵4小時(shí)。培養(yǎng)物再用同一個(gè)新鮮培養(yǎng)基稀釋，至OD600為大約0.17，再溫孵30分鐘，然后如上述收獲細(xì)胞。實(shí)施例21。Helicobacterpylori加至加有4％牛血清的BHI肉湯中。接種后，將三角瓶充入5％O2、10％CO2，85％N2于37℃振搖溫孵22h。溫孵后，將2.5ml此種培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至盛有含4％牛血清的BHI的，或另外含有約0.1％至約0.2％牛膽汁的同樣培養(yǎng)基的三角瓶中。這些培養(yǎng)物再充入微需氧氣體混合物(5％O2，10％CO2，85％N2)，于37℃溫孵20-24h。細(xì)胞如上述收獲。7.實(shí)施例提高抗原性的細(xì)菌實(shí)施例22。細(xì)菌濕制片鏡檢被用于觀察游動(dòng)性和肉眼可見(jiàn)形態(tài)學(xué)。可通過(guò)印度墨水(苯胺墨)中染色莢膜來(lái)觀察表面層?？諝飧稍锖?，細(xì)胞用結(jié)晶紫復(fù)染計(jì)數(shù)。所有觀察均在1000X放在倍數(shù)下觀察。與那些在單獨(dú)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(傳統(tǒng)生長(zhǎng)的)培養(yǎng)的相比，按照本發(fā)明的方法培養(yǎng)的細(xì)菌(此后稱作“提高的”細(xì)菌)形態(tài)已改變。例如，“提高的”空腸彎曲桿菌聚生且形成大的細(xì)胞團(tuán)塊，而傳統(tǒng)生長(zhǎng)的細(xì)胞主要是單生的。從莢膜染色(資料未給出)明顯地看出使用本發(fā)明的方法進(jìn)行培養(yǎng)，完成了細(xì)菌表面的改變。這種表面改變確實(shí)引起了“提高的”細(xì)胞對(duì)于來(lái)自于染料的苯胺黑顆粒的增長(zhǎng)的結(jié)合?！疤岣叩募?xì)菌”保持高度的游動(dòng)性。實(shí)施例23用苯酚提取分析空腸彎曲桿菌表面組分。提取物由傳統(tǒng)生長(zhǎng)的或按上述實(shí)施例2培養(yǎng)的空腸彎曲桿菌81-176制得?？漳c彎曲桿菌細(xì)胞用上述離心技術(shù)從培養(yǎng)基中收集。細(xì)胞沉淀物在室溫下用1％苯酚提取2h。離心45分鐘從提取物中分離完整細(xì)胞。含有提取的細(xì)胞表面組分的上清液用蒸餾水透析過(guò)夜。保留物在4℃105,000xg離心3h。提取的沉淀重新溶解于10％Nacl用兩倍體積的冷95％乙醇沉淀。重復(fù)沉淀，并冷干樣品。然后，樣品以1mg/ml溶于水，用于進(jìn)一步分析。采用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物，用普遍接受的苯酚-硫酸法分析提取物的碳水化合物含量。糖醛酸含量系用咔唑試劑以Dische方法測(cè)定。苯酚提取物的總蛋白含量用biccichinoic酸試劑盒(PierceChem.Co，Rocrford，IL)測(cè)定。值得注意的是，提取物中無(wú)糖醛酸。許多典型的細(xì)菌莢膜由糖醛酸聚合物構(gòu)成。令人驚訝地，空腸彎曲桿菌81-176表面提取物主要由蛋白構(gòu)成。然而“提高”的細(xì)胞的總碳水化合物含量高于傳統(tǒng)生長(zhǎng)的細(xì)胞。提取物的碳水化合物與蛋白質(zhì)的比率在表1中表述。表1傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)或根據(jù)實(shí)施例2的方法生長(zhǎng)的(提高的)空腸彎曲桿菌表面提取物的碳水化合物蛋白質(zhì)比率加入后時(shí)間(h)BHI提高的10.020.0220.020.1040.020.1560.030.29在培養(yǎng)基中含有DOC和可提取的細(xì)菌表面碳水化合物提高的水平之間有直接的聯(lián)系(表1)。根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)的細(xì)菌，其表面可提取碳水化合物增加了多于8倍，而傳統(tǒng)生長(zhǎng)細(xì)菌未見(jiàn)增加。在DOC培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞的群生現(xiàn)象看來(lái)應(yīng)歸因于表面提取物的組分。再水合時(shí)，提取物在水中具有很高的成膠能力，使溶液高度粘稠且粘蛋白樣，在特性上同群生細(xì)菌一樣。提取物的函數(shù)性一致于粘蛋白樣糖蛋白。為了分析各個(gè)單糖，將提取物在密封容器里，在1N三氟乙酸中水解。樣品在氮?dú)庵懈稍?h，重懸于蒸餾水中。采用Dionex公司色譜基質(zhì)和由3％0.5N.NaOH/97％H2O作為溶劑的溶劑系統(tǒng)進(jìn)行HPLC來(lái)分離蔗糖。使用電流檢測(cè)法測(cè)量分離的單糖。一種人工的單糖標(biāo)準(zhǔn)物，其由果糖半乳糖胺，葡萄糖胺，半乳糖，葡萄糖，和甘露糖構(gòu)成，也經(jīng)受HPLC分析以供比較。水解表面提取物的HPLC分析揭示了幾種單糖的存在(圖1)?？磥?lái)來(lái)自于傳統(tǒng)生長(zhǎng)的和從按實(shí)施例2的方法生長(zhǎng)的細(xì)菌的提取物的碳水化合物組成，未見(jiàn)質(zhì)的差別，但是出現(xiàn)了微小的量的差別。實(shí)施例24。用SDS-PAGE和WesternBlotting分析細(xì)菌蛋白。采用Lugtenberg等人的凝膠系統(tǒng)(FEBSLetters58，254-258，1975)。該凝膠體系是不連續(xù)凝膠，由低含量丙烯酰胺(典型地4％)，pH6.8濃縮膠，和較高百分比丙烯酰胺，pH8.8分離膠構(gòu)成，兩種膠都含有0.1％SDS，都使用緩沖液。按照分子大小進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，采用8或12％丙烯酰胺分離膠。銀染固定的凝膠使分離的蛋白質(zhì)可視化，分子大小的確定基于用作標(biāo)準(zhǔn)物的已知蛋白的Mr值。SDS-PAGE分離空腸彎曲桿菌細(xì)胞蛋白，銀染使之可視。在用DOC培養(yǎng)的細(xì)胞中，包括62kD2的蛋白在內(nèi)的四種蛋白質(zhì)被誘導(dǎo)或提高(圖2)。實(shí)施例25。通過(guò)苯酚提取分析弗氏志賀氏菌LPS。如上所述，通過(guò)離心從培養(yǎng)基中收獲傳統(tǒng)生長(zhǎng)和或如實(shí)施例9中例舉的根據(jù)本發(fā)明生長(zhǎng)的弗氏志賀氏菌。用Westphal和Jann(InR.Whistler，ed.，MethodsinCarbohydrateChemistry.，vol5p.83，1965)的方法提取脂多糖(CPS)。簡(jiǎn)言之，培養(yǎng)于BHI或如上面實(shí)施例9例舉的細(xì)胞通過(guò)離心收集，在PBS中洗一遍。然后，在68℃用在水中的45％苯酚提取細(xì)胞15分鐘，提取物冷卻至10℃，并離心。吸出含有LPS上層水相，用蒸餾水透析。保留物于4℃，80,000xg離心7h，于105,000xg離心三次，每次3h。凍干終沉淀。分析之前，LPS重懸于水(1mg/ml)。如上述對(duì)于碳水化合物那樣，表征純化LPS，以及如下所述通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，如圖5所示，表征純化LPS。使用這一具體的SDS-PAGE系統(tǒng)進(jìn)行分析，在傳統(tǒng)生長(zhǎng)的與“提高”的細(xì)胞之間，未見(jiàn)弗氏志賀氏菌蛋白分布顯示出重大差別。與BHI細(xì)胞提取物相比，來(lái)自于“提高的”細(xì)胞的碳水化合物與LPS干重之比降低了。然而，弗氏志賀氏菌LPS經(jīng)SDS-PAGE，然后氧化和銀染證明了LPS結(jié)構(gòu)上的一個(gè)主要改變(圖5)。如，見(jiàn)凝膠上泳道“2”，來(lái)自于“提高的”弗氏志賀氏菌的LPS的O-抗原部分在其長(zhǎng)度削減了。這一結(jié)果補(bǔ)充了來(lái)自于“提高的”細(xì)胞的碳水化合物/LPS干重比降低的這一發(fā)現(xiàn)。這一結(jié)果提示在“提高的”細(xì)胞上出現(xiàn)了更短的O-抗原側(cè)鏈，潛在地，可能使細(xì)菌更為疏水。在腸道中，更疏水的細(xì)菌可能與疏水表面有更強(qiáng)的相互作用。實(shí)施例26。通過(guò)WesternBlotting確定蛋白質(zhì)免疫原性。來(lái)源于傳統(tǒng)生長(zhǎng)的或根據(jù)如上述實(shí)施例1或5例舉的本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的細(xì)菌的蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE分離，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素或PVDF膜且用標(biāo)準(zhǔn)封閉劑封閉[3％BSA，50mMTris(pH8.5)，50mMNaCl，0.2％TWEEN20]。第一抗體加入封閉劑中，然后洗滌印漬加入第二抗體報(bào)告關(guān)聯(lián)物(cognate)。洗滌后，印漬是借助于光可視的，或借助于發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生底物可視。所用報(bào)告半體是辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶。圖3圖示了來(lái)自于用含IgA的免疫兔粘液進(jìn)行的WesternBlotting的蛋白。正如所看到的，62kDa蛋白是免疫顯性蛋白。在用DOC或膽汁培養(yǎng)的細(xì)胞中，62kDa蛋白的抗原性極大地提高。該蛋白亦是用DOC培養(yǎng)的細(xì)胞表面提取物中的主要抗原。使用與彎曲桿菌鞭毛蛋白交叉反應(yīng)的鼠單克隆抗體，證明這一提高的蛋白是空腸彎曲桿菌鞭毛蛋白(圖4)。這是一個(gè)意義重大的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)閹讉€(gè)研究者證明空腸彎曲桿菌鞭毛蛋白參予了發(fā)病機(jī)制，并與細(xì)菌的侵襲特性相關(guān)。實(shí)施例27。用剛果紅染料結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定毒力。生長(zhǎng)于含0.025％剛果紅的BHI瓊脂平板的傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)或根據(jù)本發(fā)明的方法(“提高”)生長(zhǎng)的腸細(xì)菌重懸于蒸餾水，并用丙酮提取10分鐘。離心沉淀細(xì)胞碎片，用40％丙酮，60％水的空白溶液測(cè)定染料OD488。染料吸光度與660nm處細(xì)胞吸光度相比，表達(dá)為OD488/OD660。數(shù)據(jù)顯示于表2。表2.傳統(tǒng)生長(zhǎng)(BHI)或按照本發(fā)明的方法(提高的)生長(zhǎng)的腸致病菌剛果紅染料結(jié)合染料吸光率菌株BHIENHANCED空腸彎曲桿菌81-1760.070.49空腸彎曲桿菌81-1160.060.49鼠傷寒沙門(mén)氏菌0.050.30弗氏沙門(mén)氏菌0.020.13霍亂弧桿菌0.702.00表2顯示了對(duì)于幾種按照本發(fā)明的方法培養(yǎng)的腸細(xì)菌，剛果紅染料結(jié)合提高了。這些結(jié)果表明本發(fā)明的體外方法有用于誘導(dǎo)毒力，及其他已知對(duì)于其他細(xì)菌種體內(nèi)發(fā)病機(jī)制相關(guān)的特性。實(shí)施例28。分析了細(xì)菌對(duì)于培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的粘附。細(xì)菌粘附如Galen和Curtiss(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)866383-6387，1989)中所描述的進(jìn)行測(cè)定。組織培養(yǎng)細(xì)胞(INT-407或Henle細(xì)胞(ATCC#CCL6)，和CaCo-2(ATCC#HTB37)人腸細(xì)胞系)在24孔板中(37℃，5％CO2)培養(yǎng)，至60-80％鋪滿。培養(yǎng)基取決于所用細(xì)胞系，但是含有10％胎牛血清和50mg/ml的青霉素G和50mg/μl鏈霉素的Dulbecco′s改進(jìn)Eagle′s培養(yǎng)基被用于Henle細(xì)胞，含有10％胎牛血清和50mg/ml青霉素G和50mg/μl鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基被用于培養(yǎng)CaCo-2細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)前至少3小時(shí)，培養(yǎng)基被移去，細(xì)胞在含鈣鎂的Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)中洗兩遍。然后用不含抗生素的培養(yǎng)基涂覆單層。就粘附實(shí)驗(yàn)而言，細(xì)菌如下制備。對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的腸細(xì)菌，如彎曲桿菌和卷旋桿菌，用新鮮的，預(yù)平衡的培養(yǎng)基將細(xì)菌培養(yǎng)物密度稀釋到OD625為0.1，然后用于測(cè)定，對(duì)于志賀氏菌和其他生長(zhǎng)快的腸細(xì)菌，用新鮮的，預(yù)平衡的培養(yǎng)基將細(xì)菌培養(yǎng)物稀釋到OD625為0.17，然后用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)菌以每細(xì)胞10個(gè)細(xì)菌的感染倍數(shù)加入上皮細(xì)胞以避免飽和。接種到細(xì)胞培養(yǎng)孔中的細(xì)菌數(shù)量通過(guò)平板計(jì)數(shù)來(lái)確定。在5％CO2之下，對(duì)于彎曲桿菌為感染2h，志賀氏菌是30分鐘，在用0.1％膽酸裂解單層之前，用HBSS洗滌移去未結(jié)合細(xì)菌，用鋪板來(lái)確定粘附。下面表3中顯示了溫度對(duì)于空腸彎曲桿菌81-176粘附INT-407細(xì)胞的作用，其中空腸彎曲桿菌81-176是傳統(tǒng)生長(zhǎng)的，或如實(shí)施例5所例舉的本發(fā)明的方法培養(yǎng)的。下面表4中顯示了幾株空腸彎曲桿菌粘附的差異，其中，空腸彎曲桿菌是傳統(tǒng)生長(zhǎng)的，或如本發(fā)明的方法培養(yǎng)的。粘附百分比被表達(dá)為從單層中回收的集落形成單位(CFU)數(shù)目除以接種到單層中的CFU數(shù)目乘以100。表3溫度對(duì)于傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)或按照本發(fā)明的方法(提高的)生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌粘附INT-407的影響B(tài)HI提高的溫度(％粘附)(％粘附)37℃5.562.342℃5.511.2表4傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)或按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的(提高的)不同空腸彎曲桿菌菌株對(duì)于INT-407的粘附(提高倍數(shù))菌株BHI-提高的81-1761.08.481-1761.012.5HC1.028.2在侵襲試驗(yàn)中，上皮細(xì)胞按上述用于粘附實(shí)驗(yàn)的方法生長(zhǎng)和制備。傳統(tǒng)生長(zhǎng)的或按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的細(xì)菌以每細(xì)胞10個(gè)細(xì)菌的感染倍數(shù)加入上皮細(xì)胞中，以避免飽和。接種到組織培養(yǎng)孔中的細(xì)菌數(shù)目通過(guò)平板計(jì)數(shù)來(lái)計(jì)算。在5％CO2下，對(duì)于彎曲桿菌是感染2h，志賀氏菌是30分鐘，吸出正在感染的細(xì)菌，用含有慶大霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基涂蓋單層，以殺死任何細(xì)胞外細(xì)菌。任何在這時(shí)保留的可培養(yǎng)的細(xì)菌已經(jīng)侵入上皮細(xì)胞單層。在CO2氣氛之下，就空腸彎曲桿菌感染細(xì)胞而言，繼續(xù)溫孵3小時(shí)，就志賀氏感染細(xì)胞而言，是1.5h。用HBSS洗滌單層以移去慶大霉素，加入0.1％脫氧膽酸以裂解單層。平板計(jì)數(shù)以計(jì)數(shù)裂解物中的細(xì)菌，侵襲百分比表示為慶大霉素抗性細(xì)菌數(shù)除以接種細(xì)菌數(shù)目。侵襲被表達(dá)為進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)菌的百分比，通過(guò)將從慶大霉素處理過(guò)的單層中回收的克隆形成單位(CFU)除以接種到單層中CFU的數(shù)目再乘以100而確定。下面表5中顯示了溫度對(duì)于空腸彎曲桿菌81-176侵襲INT-407細(xì)胞的影響，其中，空腸彎曲桿菌是傳統(tǒng)生長(zhǎng)的，或者按上面實(shí)施例5的方法生長(zhǎng)的。下面表6中顯示了幾種不同空腸彎曲桿菌菌株對(duì)于INT-407細(xì)胞侵襲的差異，其中空腸彎曲桿菌菌株是傳統(tǒng)生長(zhǎng)的，或按本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的。下面表7中顯示了DOC對(duì)于空腸彎曲桿菌81-176粘附和侵襲INT-407細(xì)胞的影響，其中，空腸彎曲桿菌細(xì)胞是傳統(tǒng)生長(zhǎng)的，或者按上面實(shí)施例5的方法生長(zhǎng)的。下面表8中顯示了DOC對(duì)于志賀氏粘附和侵襲INT-407細(xì)胞的影響，其中，志賀氏細(xì)胞是傳統(tǒng)生長(zhǎng)的，或者按上面實(shí)施例5的方法生長(zhǎng)的。表5溫度對(duì)于傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)或按照本發(fā)明的方法(提高的)生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌81-176侵襲INT-407細(xì)胞的影響B(tài)HI提高的溫度(％侵襲)(％侵襲)37℃2.549.542℃4.07.1表6傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)或按照本發(fā)明的方法(提高的)生長(zhǎng)的不同空腸彎曲桿菌菌株對(duì)于INT-407細(xì)胞的侵襲(提高倍數(shù))菌株BHI提高的81-1761.09.281-1161.010.0HC1.026.7表7DOC濃度對(duì)于傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)或按照本發(fā)明的方法(提高的)空腸彎曲桿菌81-176粘附和侵襲的影響處理粘附(％)侵襲(％)BHI9.36.3提高的；0.025％DOC18.317.4提高的；0.1％DOC52.637.0表8DOC對(duì)于傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)或按本發(fā)明(提高的)方法生長(zhǎng)的弗氏志賀氏菌侵襲(百分比)或粘附(百分比)INT-407細(xì)胞的影響性質(zhì)BHI提高的粘附1.0140.0a侵襲1.094.4a由于在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，細(xì)菌的生長(zhǎng)，回收了多于最初加入的細(xì)菌向培養(yǎng)基中加入膽汁或脫氧膽酸，極大地提高了幾種空腸彎曲桿菌的人分離物(即81-116，81，176和HC)對(duì)于培養(yǎng)的INT-407細(xì)胞的粘附和侵襲(見(jiàn)表4和6)。最有效的DOC劑量是0.1％(表7)，最大應(yīng)答在37℃，而不是在42℃獲得(彎曲桿菌傳統(tǒng)生長(zhǎng)所處溫度)(表3和表5)。對(duì)于弗氏志賀氏菌也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)(表8)。根據(jù)本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的志賀氏菌，其粘附和侵襲能力都極大提高。這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的方法提高了腸道病原菌的侵襲和粘附力。實(shí)施例29。快速玻片凝集反應(yīng)被用于顯示免疫交叉反應(yīng)。傳統(tǒng)生長(zhǎng)的，和按如實(shí)施例5例舉的本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌菌株暴露于血清IgG。該IgG來(lái)自用傳統(tǒng)生長(zhǎng)或按照本發(fā)明生長(zhǎng)(例，實(shí)施例5)的空腸彎曲桿菌81-176(Lior5)免疫的動(dòng)物。IgG抗體固定化在蛋白A包被的膠乳珠上。假如在待測(cè)血清型和產(chǎn)生用來(lái)抗Lior5血清型的抗體之間有交叉反應(yīng)表位，則幾乎立即可以看見(jiàn)細(xì)胞簇集(即，凝集)。這種簇集在反應(yīng)進(jìn)行一段很短的時(shí)間后，基于0至3的尺度來(lái)衡量，其中，0意味著無(wú)可見(jiàn)簇集，而3意味著高度凝集。四種菌株的結(jié)果在下面表9中給出。表9傳統(tǒng)生長(zhǎng)的或按本發(fā)明的方法(提高的)生長(zhǎng)的Lior血清型的交叉反應(yīng)性培養(yǎng)物生長(zhǎng)條件珠反應(yīng)性81-176(L5)BHIAnti-BHIa181-176(L5)BHIAnti-EHNb281-176(L5)提高的Anti-BHI281-176(L5)提高的Anti-EHN2.5L2BHIAnti-BHI1L2BHIAnti-EHN1.5L2提高的Anti-BHI0L2提高的Anti-EHN1.5L8BHIAnti-BHI2L8BHIAnti-EHN1L8提高的Anti-BHI1L8提高的Anti-EHN2.5L21BHIAnti-BHI0L21BHIAnti-EHN2L21DOCAnti-BHI0L21DOCAnti-EHN2MediaBHIAnti-BHI0BHIAnti-EHN0</table></tables>a傳統(tǒng)生長(zhǎng)的81-176誘導(dǎo)的抗體b按照如實(shí)施例5例舉的本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的81-176誘導(dǎo)的抗體表9表明所有四種待測(cè)的Lior血清型(L5，L2，L8，L21)均與產(chǎn)生于用提高的空腸彎曲桿菌81-176Lior血清型L5免疫的動(dòng)物的抗體交叉反應(yīng)。用空腸彎曲桿菌81-176感染的兔的腸灌洗粘液含有IgA，與按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌的10種主要臨床血清型(即，人病原體)中的8個(gè)反應(yīng)，與抗Lior5血清型菌株(見(jiàn)下面表16)的抗體交叉反應(yīng)。該結(jié)果表明，本發(fā)明的方法極大地?cái)U(kuò)展了與來(lái)自于用空腸彎曲桿菌的Lior5血清型免疫的動(dòng)物的抗血清交叉反應(yīng)的Lior血清型的數(shù)目。而且，按照本發(fā)明的方法，而不是傳統(tǒng)生長(zhǎng)的志賀氏菌的幾個(gè)種與來(lái)自于用生長(zhǎng)于有DOC的環(huán)境的弗氏志賀氏菌2457T免疫的動(dòng)物的IgG抗體交叉反應(yīng)。8.實(shí)施例疫苗效力實(shí)施例30。用于研究彎曲桿菌致病機(jī)制的白鼬模型可以用作評(píng)價(jià)保護(hù)免受移生和/或疾病的疫苗效力的模型，因?yàn)楦腥景作芍貜?fù)地產(chǎn)生三種見(jiàn)于人類(lèi)的疾病現(xiàn)象中的兩種。二十四只7至9周齡雄性白鼬分別用PBS(作對(duì)照)，福爾馬林固定的傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)或按實(shí)施例5的方法(提高的)生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌81-176菌株進(jìn)行口服免疫。分離血清以確定基線Ig滴度。所有的疫苗和PBS均在佐劑LT的出現(xiàn)下施用，相隔一周，施用兩次(0天和7天“接種”)。一周后收集血清(14天，“接種后”)以確定IgG抗體滴度。接種后四周(攻擊)，用ACE丙嗪氯胺酮麻醉白鼬，并用含有活空腸彎曲桿菌81-176(1×1010CFU)的10mlPBS溶液口服攻擊。其后，每日監(jiān)測(cè)動(dòng)物的粘液樣腹瀉，菌血癥，彎曲桿菌從糞便里排出，體重改變，潛血和糞便白血球。從麻醉白鼬頸靜脈中抽取1至2ml血，并將樣品在一通氣的(vented)胰酶水解大豆肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以檢測(cè)菌血癥。在攻擊后2，5，7天進(jìn)行血瓊脂平板的亞培養(yǎng)。免疫前收集血清樣品(基線)。第二次免疫后一周，在攻擊時(shí)，和在攻擊后一周測(cè)定IgG滴定。通過(guò)在一個(gè)Hemacult卡上測(cè)試糞便材料來(lái)檢測(cè)潛血。糞便材料涂布在玻片上用亞甲基藍(lán)染色以檢測(cè)糞便白血球。在彎曲桿菌選擇性培養(yǎng)基平板(胰酶水解大豆瓊脂，5％綿羊血、三甲氧芐二胺嘧啶，萬(wàn)古霉素，多粘菌素B、頭孢菌素I，和兩性霉素B，Remel，Lenexa，ks)上培養(yǎng)來(lái)自直腸拭子的涂片，以確定彎曲桿菌以糞便中排出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下面表10和11。表10在白鼬中接種，保護(hù)免受空腸彎曲桿菌81-176疫苗攻擊后5天，陽(yáng)性集落形成a疾病bPBS6/61/6BHI0/62/6提高的0/5c0/6a陽(yáng)性移生數(shù)/測(cè)試數(shù)b出現(xiàn)綠色粘液/未形成/水樣便c疾病狀態(tài)確定之后，移生計(jì)數(shù)之前，本組中有一只動(dòng)物死亡表11白鼬血清IgG幾何平均滴度組基線接種后一周攻擊時(shí)攻擊后一周PBS6.44.96.41380.4BHI6.494.094.026505.3ENHANCED6.8234.41621.856234.1aa五只存活動(dòng)物的平均值表10顯示出當(dāng)活體(live)攻擊時(shí)，用本發(fā)明的殺死的完整細(xì)胞疫苗的動(dòng)物被保護(hù)免受移生和疾病。表11中的數(shù)據(jù)表明，由本發(fā)明的疫苗(提高的)引起的IgG抗體滴度比起傳統(tǒng)生長(zhǎng)的腸細(xì)菌(BHI)所引起的要大得多。這些結(jié)果證明用本發(fā)明的疫苗可以獲得免疫原性(表11)和保護(hù)免受感染(表10)，而且比當(dāng)用傳統(tǒng)生長(zhǎng)細(xì)菌進(jìn)行接種動(dòng)物時(shí)所見(jiàn)的要強(qiáng)烈。因此本發(fā)明的方法形成的細(xì)菌可以有用地作為疫苗。保護(hù)哺乳動(dòng)物免于感染。實(shí)施例31。與白鼬不同，小鼠不會(huì)自然地發(fā)生彎曲桿菌或志賀氏菌感染。但是它們被本領(lǐng)域技術(shù)人員用來(lái)展示當(dāng)口服攻擊免疫動(dòng)物時(shí)的對(duì)于腸移生的抗性，或通過(guò)肺感染免疫動(dòng)物的疾病的抗性。鼠鼻內(nèi)接種模型可用于預(yù)言疫苗用于其他動(dòng)物或人類(lèi)時(shí)的效力。該實(shí)驗(yàn)為Mallet等人描述(疫苗，11190-196，1993)。幾組約16周齡雌性Balblc小鼠，每組10只，用磷酸鹽緩沖液(PBS)，傳統(tǒng)生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌(BHI)或按照實(shí)施例5生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌(提高的)，其劑量是大約107CFU或109CFU口服免疫，然后攻擊。每組腸粘液的IgA滴度用ELISA測(cè)定，在下面表12中給出。表12小鼠中，用(107或109)彎曲桿菌完整細(xì)胞疫苗口服免疫后IgA應(yīng)答免疫灌洗液IgA滴度a％應(yīng)答者bPBS2314提高的(107)11475提高的(109)7875BHI(107)4025BHI(109)3212a灌洗液滴度表示從每組小鼠的每一個(gè)體中獲得的抗空腸彎曲桿菌IgA滴度平均值。b應(yīng)答者被定義為其終點(diǎn)滴度比單獨(dú)接受PBS的動(dòng)物的平均值超出2倍標(biāo)準(zhǔn)差的動(dòng)物。表12表明用按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的細(xì)菌免疫的動(dòng)物，比用傳統(tǒng)生長(zhǎng)的細(xì)菌免疫的動(dòng)物，具有被較高百分比的應(yīng)答者遞呈的較高的腸IgA抗體滴度。9.實(shí)施例DOC引起的抗原改變或提高的機(jī)制雖然并不試圖將本發(fā)明限制于任何具體的作用機(jī)制，本發(fā)明者獲得了一些證據(jù)，提示脫氧膽酸(DOC)看來(lái)在改變或提高腸細(xì)菌抗原性上有兩重作用。證據(jù)表明DOC作用的一個(gè)方面是通過(guò)鈣依賴作用介導(dǎo)的，因?yàn)镈OC結(jié)合鈣，因而降低了培養(yǎng)基中鈣濃度。證據(jù)如下。當(dāng)空腸彎曲桿菌81-176在具有可透膜的鈣螯合劑BAPTA/AM和不具有DOC的情況下培養(yǎng)時(shí)，其對(duì)于INT-407細(xì)胞的侵襲性提高了接近10倍(見(jiàn)下表13)。然而，用BAPTA/AM處理不提高空腸彎曲桿菌81-176細(xì)胞的免疫交叉反應(yīng)性。表13中所示結(jié)果是使用按照實(shí)施例5中描述的方案，除了以25μMBAPTA/AM替代了0.1％DOC外，培養(yǎng)的空腸彎曲桿菌81-176獲得的。侵襲試驗(yàn)如下面7部分實(shí)施例28中所述的進(jìn)行且評(píng)價(jià)。表13傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)或帶有BAPTA/AM生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌對(duì)于INT-407細(xì)胞的侵襲培養(yǎng)條件菌株BHIBAPTA/AM空腸彎曲桿菌81-1763.036.9幾個(gè)易感由膽汁和膽汁鹽例如DOC引起的抗原性提高或改變的細(xì)菌屬(如，彎曲桿菌，志賀氏菌，卷旋桿菌)與來(lái)自耶爾森菌的低鈣應(yīng)答(lcr)基因有基因同源性。已知lcr座位調(diào)節(jié)應(yīng)答低鈣水平時(shí)耶爾森氏菌的毒力。兩個(gè)參予侵襲所必需的鞭毛蛋白(flaA，flbA)的表達(dá)和裝配的彎曲桿菌基因部分地受lcr產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。傳統(tǒng)生長(zhǎng)的或在本發(fā)明的毒力提高的條件下生長(zhǎng)的彎曲桿菌flaA和flaB突變體行為的分析表明侵襲，但不是剛果紅染料結(jié)合或提高的交叉反應(yīng)性，是鈣依賴的(見(jiàn)下面表14)。表14所示的結(jié)果是采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的或如實(shí)施例5中例舉的本發(fā)明的方法培養(yǎng)的空腸彎曲桿菌獲得的。侵襲試驗(yàn)如實(shí)施例28中描述而進(jìn)行和評(píng)價(jià)。表14傳統(tǒng)生長(zhǎng)(BHI)的或按照本發(fā)明的方法(提高的)空腸彎曲桿菌突變株侵襲INT-407細(xì)胞培養(yǎng)條件菌株BHI提高的空腸彎曲桿菌81-3.540.8176空腸彎曲桿菌flaA0.050.05空腸彎曲桿菌flbA0.010.04當(dāng)用DOC培養(yǎng)時(shí)，空腸彎曲桿菌fla和flbA突變株確實(shí)展示了明顯提高的剛果紅結(jié)合和免疫交叉反應(yīng)性(分別見(jiàn)表15和圖6)。表15和圖6所示的結(jié)果采用傳統(tǒng)生長(zhǎng)的，或如實(shí)施例5例舉的本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌獲得。剛果紅染料結(jié)合試驗(yàn)。其結(jié)果如表15所示，如實(shí)施例26所述內(nèi)容進(jìn)行。免疫交叉反應(yīng)性，其結(jié)果如圖6所示，如實(shí)施例29所述而完成。表15傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)或按照本發(fā)明的方法(提高的)空腸彎曲桿菌突變株的剛果紅染料結(jié)合培養(yǎng)條件菌株BHI提高的空腸彎曲桿菌81-0.071.68176空腸彎曲桿菌flaA0.101.60空腸彎曲桿菌flbA0.120.80flaA突變株不能表達(dá)鞭毛蛋白。甚至用DOC處理之后，F(xiàn)LAa突變株和flaA-flaB雙突變株(由C.Grant，NIH惠贈(zèng))都是非侵襲性的，表明鞭毛蛋白是侵襲所必需的。令人感興趣的是，在這些突變株中，沒(méi)有正常展示即非DOC誘導(dǎo)的出來(lái)的這些fla突變株的同基因親本株和一些其他空腸彎曲桿菌Lior血清型之間的免疫交叉反應(yīng)性。然而，DOC處理可誘導(dǎo)這些鞭毛蛋白較少的突變株展示出提高的免疫交叉反應(yīng)性和剛果紅結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)表明DOC通過(guò)鈣依賴(如侵襲性)和非鈣依賴(如剛果紅染料結(jié)合)機(jī)制在腸細(xì)菌中調(diào)節(jié)毒力功能。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步提示由DOC誘導(dǎo)的提高的免疫交叉反應(yīng)性和剛果紅結(jié)合是至少部分地鞭毛蛋白依賴的。10實(shí)施例DOC誘導(dǎo)提高的血清型和種空腸彎曲桿菌的免疫交叉反應(yīng)性實(shí)施例33。用快速被片凝集反應(yīng)來(lái)檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌的血清型免疫交叉反應(yīng)性。該反應(yīng)使用來(lái)自免疫的和非免疫兔的腸粘液來(lái)確定改變的培養(yǎng)條件在彎曲桿菌異源菌株的交叉反應(yīng)性上的影響。兔用活的傳統(tǒng)生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌81-176免疫。測(cè)定粘液抗體對(duì)于二十四種彎曲桿菌菌株的凝集活性。包括18種血清型，傳統(tǒng)地生長(zhǎng)在BHI-YE培養(yǎng)基或按照如實(shí)施例5所例舉的本發(fā)明的方法生長(zhǎng)。凝集反應(yīng)的結(jié)果表明當(dāng)菌株用本發(fā)明的方法培養(yǎng)時(shí)，比起它們傳統(tǒng)生長(zhǎng)時(shí)，異源彎曲桿菌菌株的交叉凝集更廣泛，在許多情況下，也更強(qiáng)。具體地，在異源凝集反應(yīng)性上有超過(guò)兩倍增長(zhǎng)在抗-81-176免疫粘液中。24個(gè)傳統(tǒng)生長(zhǎng)的異源菌株中的6個(gè)以+水平或更高凝集水平，而在DOC條件下生長(zhǎng)的同樣24個(gè)菌株中的14個(gè)以+水平或更高凝集水平。另外，當(dāng)在傳統(tǒng)生長(zhǎng)時(shí)，異源菌株中的18個(gè)被證明是微弱(±)或不凝集，當(dāng)在“提高的”培養(yǎng)條件下(如，含DOC的培養(yǎng)基)生長(zhǎng)時(shí)，這些菌株中的11個(gè)顯示了增強(qiáng)的凝集應(yīng)答。表16說(shuō)明了抗-81-176免疫兔粘液對(duì)于19個(gè)異源Lior血清型的交叉反應(yīng)性。這些血清型包含22個(gè)傳統(tǒng)生長(zhǎng)(BHI-YE)的，或采用實(shí)施例5(提高的)方法生長(zhǎng)的菌株。雖然這一實(shí)驗(yàn)僅分析了已知Lior血清型(VC/67)的一部分，結(jié)果表明，本發(fā)明的方法誘導(dǎo)了Lior血清型之間巨大的免疫交叉反應(yīng)。這一結(jié)果還進(jìn)一步表明彎曲桿菌中DOC誘導(dǎo)或提高的抗原在分泌型IgA應(yīng)答中看來(lái)是重要的，這種應(yīng)答與彎曲桿菌引起的腸感染的抗性和恢復(fù)相關(guān)。另外還需注意Lior血清型8菌株是不同種，大腸彎曲桿菌。在抗-81-176免疫兔粘液中，這個(gè)血清型中的2個(gè)菌株強(qiáng)烈地凝集(3+)，這一結(jié)果表明衍生于空腸彎曲桿菌菌株(如Lior5)的疫苗不僅在同一種同內(nèi)而且也在彎曲桿菌屬的其他種(如大腸彎曲桿菌)，針對(duì)異源血清型交叉保護(hù)。同樣值得注意的是Lior血清型1，2，4，9和11都處于世界范圍內(nèi)最流行的疾病相關(guān)血清型之中。在該實(shí)驗(yàn)中，它們都被證明了可測(cè)得的交叉反應(yīng)性。表16.20個(gè)傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI-YE)或按照本發(fā)明的方法(提高的)生長(zhǎng)的彎曲桿菌血清型對(duì)非-免疫b或抗-81-176a免疫兔粘液的凝集應(yīng)答凝集應(yīng)答c非免疫粘液免疫粘液Lior菌株血清型BHI-YE提高的BHI-YE提高的1341---++1952---±14---+++1705--+++++++81-1765--++++++++66--+++++++81-1166--+++357---+528-++++VC-1678--++++VC-1598--±-889---±24411--±+++55617--+-56318----54419-++-++69921--±++118028--++++198229----91032-++-++207436----HC36-+-+298446----7917172----a抗-81-176粘液從用傳統(tǒng)生長(zhǎng)的活空腸彎曲桿菌81-176感染兔得到。b非免疫粘液從未感染兔獲得c凝集應(yīng)答分為陰性(一)，很弱(±)，至很強(qiáng)(+++)11實(shí)施例彎曲桿菌疫苗效力的其他實(shí)驗(yàn)實(shí)施例34。采用Baqar(Infect&amp;Immun.，633731-3735，1995)報(bào)道的小鼠移生模型，確定按本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的福爾馬林固定的完整空腸彎曲桿菌細(xì)胞的保護(hù)效力。按照實(shí)施例5生長(zhǎng)和收獲空腸彎曲桿菌81-176，并如上述用0.075％福爾馬林滅活。幾組5只6至8周齡雌性Balb/c鼠被施用三個(gè)口服劑量(0.25ml劑量，于不含內(nèi)毒素的PBS中)，每劑量各自單獨(dú)含有105，107或109滅活細(xì)菌顆粒，或與25ug大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素組合(LT)。以48小時(shí)間隔給予劑量，隨即在15分鐘間隔時(shí)給予兩劑0.5ml5％碳酸氫鈉溶液(pH8.5)，以中和胃酸。對(duì)照組的動(dòng)物單獨(dú)用PBS接種或與LT佐劑組合接種。大約在施用第三劑量后的28天，接種動(dòng)物用大約108集落形成單位(CFU)的活的傳統(tǒng)生長(zhǎng)的空腸彎曲桿菌81-176經(jīng)鼻或口服攻擊。在9天時(shí)期內(nèi)，每天監(jiān)測(cè)糞便排出以確定腸移生的持續(xù)時(shí)間。在無(wú)菌PBS內(nèi)乳化糞便材料，將等份于彎曲桿菌血瓊脂平板上涂平板。平板在微需氧條件(CampylobacterGaspak，BBL)下于35℃溫孵3-5天，使空腸彎曲桿菌生長(zhǎng)。移生結(jié)果表達(dá)為在給定的取樣天，排出彎曲桿菌生物體的動(dòng)物的百分比。如圖7所示，免疫的和對(duì)照的所有鼻攻擊的動(dòng)物，攻擊后立即(第1天)排出生物體。攻擊后，80％對(duì)照組動(dòng)物保持移生9天。相反，在實(shí)驗(yàn)的9天之內(nèi)，接種組中排出生物體的動(dòng)物明顯較少。清除攻擊生物體的程度和時(shí)間依賴于施用疫苗的數(shù)量。低(105顆粒/劑量)和中疫苗劑量(107顆粒/劑量)給出一個(gè)漸進(jìn)的、不完全的清除速率。佐劑的出現(xiàn)提高了在這些劑量下的保護(hù)程度。令人驚訝的，在測(cè)試的最高劑量(109顆粒/劑量)，無(wú)佐劑的疫苗，與施用帶有LT佐劑的可比劑量時(shí)相比，產(chǎn)生了相等的、或略高的保護(hù)水平。當(dāng)口服接種動(dòng)物，并接著口服攻擊時(shí)也獲得了相似的結(jié)果(見(jiàn)圖8)。這些結(jié)果表明用按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的、滅活的彎曲桿菌免疫動(dòng)物，提供了針對(duì)于隨后攻擊的活彎曲桿菌的保護(hù)。甚至不與佐劑一起口服施用時(shí)，這種免疫仍然是有效的。腹膜內(nèi)(IP)施用按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的(見(jiàn)實(shí)施例5)福爾馬林固定的完整空腸彎曲桿菌細(xì)胞的保護(hù)效力也得到評(píng)價(jià)。就這些實(shí)驗(yàn)而言，幾組20只雌性Balb/c小鼠被施用單一劑量1.3×1010，2.5×109，5.0×108，1.0×108或2.0×107在0.5ml無(wú)內(nèi)毒素PBS中，無(wú)佐劑的滅活空腸彎曲桿菌顆粒。14天后，腹膜內(nèi)輸送一單一致死劑量的活空腸彎曲桿菌81-176(約1.0×1010CFU于無(wú)內(nèi)毒素PBS中)以攻擊動(dòng)物。每日監(jiān)測(cè)動(dòng)物死亡，持續(xù)4天。如表17所示，一個(gè)單一腹膜內(nèi)5.0×108滅活空腸彎曲桿菌顆粒劑量誘導(dǎo)了足以保護(hù)動(dòng)物免受活的空腸彎曲桿菌攻擊的免疫應(yīng)答。表17按本發(fā)明的方法制備的、V2滅活的、IP輸送的空腸彎曲桿菌提供的保護(hù)劑量死亡存活者天12341.3×10100400162.5×1090000205.0×1080000201.0×1081170025.0×107106202PBS對(duì)照4320112實(shí)施例志賀氏菌的DOC提高的侵襲力，剛果紅結(jié)合和免疫交叉反應(yīng)性實(shí)施例35，體外生長(zhǎng)的志賀氏菌的侵襲力受培養(yǎng)物生長(zhǎng)期的影響。按照實(shí)施例28所描述的方法，測(cè)定傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)，或按照實(shí)施例9例舉的本發(fā)明的方法(DOC-EL)生長(zhǎng)的(其中細(xì)胞來(lái)自于對(duì)數(shù)早期培養(yǎng)物)，或按照實(shí)施例9但在收獲細(xì)胞前讓培養(yǎng)物達(dá)到對(duì)數(shù)晚期(DOC-LL)的弗氏志賀氏菌2457T細(xì)胞的侵襲性。結(jié)果表明用DOC培養(yǎng)提高了侵襲力，而且最大的提高是在生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)早期達(dá)到的(見(jiàn)圖9)。按照本發(fā)明的方法，用DOC培養(yǎng)也提高其他志賀氏菌的種，宋內(nèi)氏志賀氏菌，和痢疾志賀氏菌(見(jiàn)圖10)的侵襲力。在板化上皮細(xì)胞內(nèi)，僅當(dāng)上皮細(xì)胞被細(xì)菌basolaterally感染時(shí)，才能觀察到提高的志賀氏菌的侵襲力。這一發(fā)現(xiàn)與體內(nèi)觀察的侵襲過(guò)程一致。比較性研究表明按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的志賀氏菌，其侵襲力幾乎是按照Pofe等人(Infect.&amp;Immun.，633642-36481995)描述方法制備的志賀氏菌的侵襲力的10倍多。實(shí)施例36。按照本發(fā)明的方法培養(yǎng)的志賀氏菌也顯示出提高的剛果紅結(jié)合。傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)或如實(shí)施例9所例舉的本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的弗氏志賀氏菌2457T和宋內(nèi)氏志賀氏菌。被用上面實(shí)施例26描述的方法分析其染料結(jié)合能力。結(jié)果顯示，在DOC中生長(zhǎng)，這兩種志賀氏菌的種的剛果紅結(jié)合提高了10至20倍(見(jiàn)表18)。表18傳統(tǒng)生長(zhǎng)的(BHI)或按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的(提高的)弗氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌的剛果紅結(jié)合培養(yǎng)條件菌株BHI提高的弗氏志賀氏菌0.040.44宋內(nèi)氏志賀氏菌0.020.40志賀氏菌被分為四個(gè)種和多個(gè)血清型。如實(shí)施例28所述，用凝集試驗(yàn)測(cè)試按本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的弗氏志賀氏菌的免疫交叉反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)采用來(lái)自免疫兔的抗血清，以確定培養(yǎng)條件對(duì)不同志賀氏菌的種的免疫交叉反應(yīng)性上的影響。兔用按實(shí)施例9的方法生長(zhǎng)的、用福爾馬林固定的弗氏志賀氏菌2457T免疫。針對(duì)于傳統(tǒng)生長(zhǎng)于BHI培養(yǎng)基的，或按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的(如，實(shí)施例9)的所有4種志賀氏菌的種，測(cè)試了從免疫動(dòng)物獲得的IgG抗體的凝集活性。凝集實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明具有DOC的生長(zhǎng)極大地提高了異源弗氏志賀氏菌的凝集活性，和三種異源志賀氏菌對(duì)于抗-弗氏志賀氏菌抗體的凝集活性(見(jiàn)圖11)。13實(shí)施例志賀氏菌的疫苗效力實(shí)施例37。用C.P.Manett等人(免疫，11190-196，1993)等人建立的小鼠鼻攻擊模型確定了根據(jù)本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的、福爾馬林固定的完整弗氏志賀氏細(xì)胞的保護(hù)效力。簡(jiǎn)言之，弗氏志賀氏菌按照實(shí)施例9例舉的方法生長(zhǎng)和收獲，并按實(shí)施例30的說(shuō)明用0.075％福爾馬林滅活。大約107滅活的細(xì)菌顆粒被用于接種14-16周齡雌性Balb/c小鼠。滅活的弗氏志賀氏菌懸于無(wú)菌的不含內(nèi)毒素的PBS中，其濃度是108顆粒/ml，35μl該物質(zhì)被經(jīng)鼻施用于幾組10只輕度麻醉動(dòng)物。以14天為間隔，總共免疫三次。為了檢測(cè)佐劑在完整志賀氏細(xì)胞疫苗的保護(hù)性能力的效力，幾組動(dòng)物用含有滅活的疫苗和5μg大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)的懸液免疫。第三次免疫后的14天、動(dòng)物經(jīng)鼻攻擊亞致死消瘦劑量(105CFU)的活弗氏志賀氏菌或宋內(nèi)氏志賀氏菌攻擊之前和攻擊后于1，2，5和7天，將動(dòng)物稱重，確定平均小組重量。結(jié)果見(jiàn)表19。表19滅活的弗氏志賀氏菌保護(hù)小鼠免受活的弗氏志賀氏菌或宋內(nèi)氏志賀氏菌的經(jīng)鼻攻擊攻擊生物體接種攻擊后體重改變百分比天1天2天5天7弗氏志賀氏菌PBS-8.1-18.2-17.7-18.3疫苗-5.4-2.9-2.5-1.6疫苗+-7.0-2.0-1.51.5佐劑宋內(nèi)氏志賀氏菌PBS-8.1-17.5-9.3-6.4疫苗-6.7-11.3-6.5-6.0疫苗+-6.4-5.2-1.3-2.1佐劑每組10只小鼠用含107滅活的按實(shí)施例9生長(zhǎng)的弗氏志賀氏菌疫苗經(jīng)鼻免疫3次。用含有滅活的，按本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的弗氏志賀氏菌的疫苗免疫的小鼠，被保護(hù)免受活的弗氏志賀氏生物體攻擊。與未接種小鼠，即PBS贗品(sham)對(duì)照組相比，這些小鼠較少體重降低，且體重恢復(fù)也較快。令人驚訝的，弗氏志賀氏菌疫苗也保護(hù)小鼠免受活宋內(nèi)氏菌攻擊。令人感興趣的是，單獨(dú)接受疫苗，沒(méi)有LT佐劑的小鼠與接受佐劑化疫苗的動(dòng)物被一樣有效地保護(hù)免受同源弗氏志賀氏菌攻擊。單獨(dú)的弗氏志賀氏菌疫苗也提供對(duì)于宋內(nèi)氏志賀氏菌的異源攻擊的保護(hù)。然而，含有的LT佐劑極大地提高了由宋內(nèi)氏志賀氏菌攻擊的保護(hù)。這些發(fā)現(xiàn)表明含有按本發(fā)明的方法制備的滅活的志賀氏菌的疫苗在一承認(rèn)的志賀氏菌疾病模型中是有效的，且在預(yù)防或減弱多種志賀氏菌的感染中不需佐劑。14影響H.PYLORI對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞粘附的因素實(shí)施例38。在甘膽酸鹽或膽汁上生長(zhǎng)可以提高H.pylori的粘附。H.pylori菌株NB3-2或G1-4被加入到加了4％小牛血清的BHI肉湯中。接種后，三角瓶充入10％CO2-5％O2-85％N2，37℃振蕩溫孵22h。溫孵后，培養(yǎng)物被1∶10稀釋至一個(gè)盛有1升加有4％小牛血清、含有不同濃度牛膽汁(0.025％至0.2％)的BHI培養(yǎng)基的三角瓶中。這些培養(yǎng)物再次用同樣的氣體混合物充滿，于37℃溫孵。在不同的時(shí)間，最多可達(dá)18h收獲細(xì)胞，用實(shí)施例28中描述的方法分析其對(duì)INT-407細(xì)胞的粘附。結(jié)果表明用膽汁培養(yǎng)提高了H.pylori對(duì)于INT-407細(xì)胞的粘附(見(jiàn)圖12和13)。就NB3-2菌株而言，比起非提高的培養(yǎng)物增長(zhǎng)2至3倍的峰值粘附，發(fā)生于生長(zhǎng)后約8h(圖12)。就G1-4菌株而言，比起非提高的培養(yǎng)物增長(zhǎng)2至3倍的峰值粘附，發(fā)生于在0.2％膽汁中生長(zhǎng)12-14小時(shí)之間。這些“峰值”時(shí)間一般對(duì)應(yīng)于每一菌株的培養(yǎng)物處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的階段。15實(shí)施例。根據(jù)本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的卷旋桿菌的疫苗效力實(shí)施例39.用陳等描述的小鼠Helicobacterfelis胃移生模型(柳葉刀，3391120-1121，1992)確定按照本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的、福爾馬林固定的完整細(xì)胞Helicobacterpolyri的保護(hù)效力。Helicobacterpolyri菌株G1-4作為種子培養(yǎng)物，于37℃，在10％CO2，90％空氣，在含有4％小牛血清的BHI中生長(zhǎng)22h。一小份這種培養(yǎng)物被用于接種10倍體積的、含有0.1％(v/v)牛膽汁的同一培養(yǎng)基。37℃生長(zhǎng)12-14小時(shí)后，離心收獲細(xì)胞，于室溫重懸于1/10初始體積的Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)中。細(xì)胞再離心，再重懸于1/100初始體積的HBSS中。向緩沖的細(xì)胞懸液中，加入福爾馬林，使其濃度達(dá)0.075％通過(guò)室溫下攪拌懸液6h，然后將溶液冷卻至4℃18小時(shí)而滅活細(xì)胞。在0，7和14天或在0，7和21天，向6-8周齡雌性Balb/c無(wú)卷旋桿菌小鼠口服施用3個(gè)劑量的這種滅活的完整細(xì)胞疫苗來(lái)日常地測(cè)量保護(hù)潛能。評(píng)價(jià)了與大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素組合的109細(xì)菌顆粒/劑的劑量。第三次免疫劑量后的14天，動(dòng)物用單劑量(107CFU/劑量)活H.felis口服攻擊。攻擊后兩周，處死動(dòng)物，竇胃節(jié)用于分析脲酶活性以確定H.felis的曲現(xiàn)。通過(guò)于室溫下將竇組織樣品于0.5mlStuart′s脲酶肉湯(Remel)中溫孵4-24小時(shí)來(lái)確定脲酶活性。發(fā)生于此階段內(nèi)的由澄清至紅色的顏色轉(zhuǎn)變作為陽(yáng)性脲酶結(jié)果。如表20所示，施用由H.pylori菌株G1-4制備的提高的卷旋桿菌完整細(xì)胞疫苗保護(hù)動(dòng)物免受H.felis口服攻擊。表20用含有按本發(fā)明的方法生長(zhǎng)的，滅活的H.pylori的疫苗保護(hù)免受卷旋桿菌感染免疫劑攻擊生物體(10CFU)移生/總數(shù)保護(hù)百分比實(shí)驗(yàn)1H.pyloribH.felis4/1371PBS+LTH.felis9/90實(shí)驗(yàn)2H.pyloribH.felis2/1587PBS+LTH.felis10/100a.所有的化學(xué)劑以7天的間隔，3個(gè)口服劑量，和10μgLT(ETEC的熱不穩(wěn)定毒素)給予b.以0.25ml劑量中1×109CFU的G1-4菌株給予。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明了提高的腸細(xì)菌特性和體內(nèi)免疫原性的相關(guān)性。本發(fā)明的方法產(chǎn)生了能夠誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫原性應(yīng)答，因而可以用作疫苗的細(xì)菌。16.微生物保藏下列微生物已保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，12301ParklawnDrive，Rockville，馬里蘭州20852，美國(guó)，具有如下保藏號(hào)微生物保藏號(hào)保藏日期HelicobacterPyloriNB3-21995年9月29日HelicobacterPyloriG1-41995年9月29本發(fā)明的方法的其他等價(jià)物可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員輕而易舉地確定，本發(fā)明試圖包括這些等價(jià)物。以上的公開(kāi)內(nèi)容包括本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求的發(fā)明所確實(shí)必需的所有信息。因?yàn)橐玫膶＠虺霭嫖锟赡芴峁┢渌杏眯畔?，所有引述的資料在此全文引入作為參考。權(quán)利要求1.一種產(chǎn)生具有提高的抗原特性的卷旋桿菌屬細(xì)菌的方法，該方法包括在體外在一些條件的組合之下生長(zhǎng)卷旋桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)物，這些條件包括a)大約0.05％至大約3％膽汁或大約0.025％至大約0.6％一種或多種膽汁酸或其鹽；b)溫度在大約30℃至大約42℃之間；c)在空氣中或在微需氧條件下，其中微需氧條件包括i)大約5％至大約20％CO2和大約80％至95％空氣；或ii)大約5％至大約10％O2和大約10％至大約20％CO2和大約70％至大約85％N2；和d)一種二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑，選自0至100μM的BAPTA/AM，0至大約10mM的EGTA，和0至大約100μM的EGTA/AM，生長(zhǎng)一段足夠的時(shí)間，這樣，培養(yǎng)物處于一個(gè)在大約是對(duì)數(shù)早期，在對(duì)數(shù)早期和穩(wěn)定期之間，或在大約是穩(wěn)定期的生長(zhǎng)期。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述膽汁鹽或酸包括甘膽酸鹽或甘氨膽酸。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述卷旋桿菌是Helicobacterpylori或Helicobacterfelis。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述卷旋桿菌是Helicobacterpylori菌株49503，NB3-2，或G1-4。5.權(quán)利要求4的方法，其中條件組合包括a)大約0.05％膽汁鹽，它是甘膽酸鹽或大約0.1％至大約0.2％膽汁；b)溫度是大約37℃；c)在大約10％至大約20％CO2和大約80％至大約90％空氣，或大約10％CO2和大約5％O2和大約85％N2；和培養(yǎng)物生長(zhǎng)一段足夠時(shí)間，這樣，培養(yǎng)物處于對(duì)數(shù)期。6.一種產(chǎn)生具有提高的抗原特性的卷旋桿菌屬細(xì)菌的方法，該方法包括在體外在一些條件的組合之下生長(zhǎng)卷旋桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)物，這些條件包括a)一種二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑，選自1.0至25μM的BAPTA/AM，0.5至大約10mM的EGTA，和1.0至大約100μM的EGTA/AM；b)溫度在大約30℃至大約42℃之間；和c)在空氣中或在微需氧條件下，其中微需氧條件包括i)大約5％至大約20％CO2和大約80％至大約95％空氣；或ii)大約5％至大約10％O2和大約10％至大約20％CO2和大約70％至大約85％N2；生長(zhǎng)一段足夠的時(shí)間，這樣，培養(yǎng)物處于一個(gè)在大約是對(duì)數(shù)早期，在對(duì)數(shù)早期和穩(wěn)定期之間，或在大約是穩(wěn)定期的生長(zhǎng)期。7.一種具有提高的抗原特征的卷旋桿菌細(xì)菌，它是從在體外，在以下條件組合之下生長(zhǎng)的卷旋桿菌細(xì)菌培養(yǎng)物中收獲的，條件組合包括a)大約0.05％至大約3％膽汁或大約0.025％至大約0.6％一種或多種膽汁酸或其鹽；b)溫度在大約30℃至大約42℃之間；c)在空氣中或在微需氧條件下，其中微需氧條件包括i)大約5％至大約20％CO2和大約80％至95％空氣；或ii)大約5％至大約10％O2和大約10％至大約20％CO2和大約70％至大約85％N2；和d)一種二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑，選自0至25μM的BAPTA/AM，0至大約10mM的EGTA，和0至大約100μM的EGTA/AM，其中所述卷旋桿菌的培養(yǎng)物處于一個(gè)在大約是對(duì)數(shù)早期，在對(duì)數(shù)早期和穩(wěn)定期之間，或在大約是穩(wěn)定期的生長(zhǎng)期。8.權(quán)利要求7的卷旋桿菌細(xì)菌，其中所述膽汁鹽或酸包括甘膽酸鹽或甘氨膽酸。9.權(quán)利要求7的卷旋桿菌細(xì)菌，其中所述卷旋桿菌是Helicobacterpylori或Helicobacterfelis。10.權(quán)利要求9的卷旋桿菌細(xì)菌，其中所述卷旋桿菌是Helicobacterpylori菌株49503，NB3-2，或G1-4。11.權(quán)利要求7的卷旋桿菌細(xì)菌，其中條件組合包括a)大約0.05％膽汁鹽，它是甘膽酸鹽或大約0.1％至大約0.2％膽汁；b)溫度是大約37℃；c)在大約10％至大約20％CO2和大約80％至大約90％空氣，或大約10％CO2和大約5％O2和大約85％N2；和培養(yǎng)物處于對(duì)數(shù)期。12.權(quán)利要求11的卷旋桿菌細(xì)菌，其中所述的卷旋桿菌是Helicobacterpylori或Helicebacterfelis。13.一種產(chǎn)生具有提高的抗原特性的卷旋桿菌屬細(xì)菌，該細(xì)菌是從在體外在一些條件的組合之下生長(zhǎng)卷旋桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)物中收獲的，這些條件包括a)一種二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑，選自1.0至25μM的BAPTA/AM，0.5至大約10mM的EGTA，和1.0至大約100μM的EGTA/AM，b)溫度在大約30℃至大約42℃之間；和c)在空氣中或在微需氧條件下，其中微需氧條件包括i)大約5％至大約20％CO2和大約80％至95％空氣；或ii)大約5％至大約10％O2和大約10％至大約20％CO2和大約70％至大約85％N2；其中所述卷旋桿菌培養(yǎng)物處于一個(gè)在大約是對(duì)數(shù)早期，在對(duì)數(shù)早期和穩(wěn)定期之間，或在大約是穩(wěn)定期的生長(zhǎng)期。14.一種包括權(quán)利要求7，9，11，12或13的卷旋桿菌，或其免疫原性片段或其衍生物的疫苗。15.權(quán)利要求14的疫苗，還包含可藥用載體或稀釋劑。16.權(quán)利要求14的疫苗，其中所述卷旋桿菌細(xì)菌是滅活的。17.權(quán)利要求16的疫苗，其中所述卷旋桿菌細(xì)菌是經(jīng)福爾馬林處理而滅活的。18.權(quán)利要求14的疫苗，其中所述疫苗適于粘膜或胃腸外或粘膜和胃腸外施用。19.權(quán)利要求14的疫苗，還包含一種佐劑。20.一種用于測(cè)試潛在的抗微生物劑的方法包括，將權(quán)利要求7，9，11，12或13的卷旋桿菌細(xì)菌與所述化學(xué)劑(agent)接觸，而且測(cè)試所述化學(xué)劑對(duì)于卷旋桿菌細(xì)菌的殺菌或制菌作用。21.一種用于檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)或由其衍生的生物學(xué)樣品中的宿主的抗卷旋桿菌細(xì)菌的抗體的方法，包括步驟a)將所述生物學(xué)樣品與權(quán)利要求7，9，11，12或13的卷旋桿菌細(xì)菌或其片段接觸，和b)篩選與卷旋桿菌細(xì)菌或其片段結(jié)合的抗體。22.一種用于檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)或由其衍生的生物學(xué)樣品中卷旋桿菌的方法，包括步驟a)將所述樣品與和權(quán)利要求7，9，11，12或13的卷旋桿菌細(xì)菌結(jié)合的抗體接觸和b)篩選與卷旋桿菌細(xì)菌或其片段結(jié)合的抗體。23.一種用于檢測(cè)宿主產(chǎn)生抗卷旋桿菌細(xì)菌抗體或檢測(cè)卷旋桿菌的診斷免疫試驗(yàn)試劑盒，包括權(quán)利要求7，9，11，12或13的卷旋桿菌或其抗體，和進(jìn)行所期望的免疫實(shí)驗(yàn)所需要的其他所有必需的試劑盒組分。24.一種用于在動(dòng)物中產(chǎn)生抗卷旋桿菌抗體的方法，包括用有效量的含有權(quán)利要求7、9、11、12或13的卷旋桿菌細(xì)菌的免疫原免疫動(dòng)物，其中，抗卷旋桿菌抗體結(jié)合所述卷旋桿菌細(xì)菌或其組分。25.一種在動(dòng)物中刺激免疫應(yīng)答的方法，包括向動(dòng)物施用有效量的含有權(quán)利要求7，9，11，12或13的卷旋桿菌細(xì)菌的免疫原，其中所述免疫應(yīng)答保護(hù)，減弱或治愈動(dòng)物中卷旋桿菌感染或疾病。全文摘要公開(kāi)了用于誘導(dǎo)或提高腸細(xì)菌抗原或毒力因子的體外進(jìn)程的方法。也公開(kāi)使用抗原性提高的細(xì)菌的方法,以及含有腸桿菌的疫苗,具體地,卷旋桿菌提供了其完整的腸細(xì)菌或組分。且有其它可用于本發(fā)明的腸細(xì)菌。圖述了一個(gè)典型空腸彎曲桿菌,顯示了空腸彎曲桿菌的表面提取物水解物的單糖的高效液相色譜結(jié)果。文檔編號(hào)G01N33/531GK1169751SQ95196594公開(kāi)日1998年1月7日申請(qǐng)日期1995年10月4日優(yōu)先權(quán)日1995年10月4日發(fā)明者J·L·佩斯,R·I·沃克,S·M·弗拉申請(qǐng)人:微卡布有限公司