專利名稱：白細(xì)胞的分析方法及其使用的分析試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種白細(xì)胞的分析方法及其使用的分析試劑。
背景技術(shù)：
醫(yī)療診斷中通常進(jìn)行血液分析。所述血液分析的分析項(xiàng)目中，有白細(xì)胞、紅細(xì) 胞、血紅蛋白濃度、血細(xì)胞比容值等。可以由這些分析對(duì)象的數(shù)目、濃度、比率等診斷 例如紅細(xì)胞增多癥、貧血等血液疾病、感染癥等疾病。其中，白細(xì)胞的數(shù)目、比率是感 染癥等疾病診斷中的重要指標(biāo)。因此，以提高血液中白細(xì)胞的分類以及計(jì)數(shù)的精度為目 的，開(kāi)發(fā)了各種分析方法。作為所述白細(xì)胞的分析方法，提出了使溶解劑與白細(xì)胞以及 紅細(xì)胞反應(yīng)的方法(例如專利文獻(xiàn)1)等。另一方面，近年來(lái)在醫(yī)療診斷中的生物試樣的分析等中，正在研究微全化學(xué)分 析系統(tǒng)(Micro Total Analysis System,以下稱為“ μ TAS”)。所述μ TAS是一種將微
小的流路、泵、閥、傳感器等集成到硅等基板上的化學(xué)分析系統(tǒng)，具有試樣的少量化、 測(cè)定用測(cè)試盒(Catridge)的一次性化、裝置的小型化等優(yōu)點(diǎn)。所述白細(xì)胞是集體體檢等 中的分析項(xiàng)目，因此期望開(kāi)發(fā)使用所述μ TAS的分析方法，但由于所述μ TAS為微全系 統(tǒng)，因而試樣的稀釋率變低，并且分析時(shí)的流速變慢。現(xiàn)有的白細(xì)胞的分析方法中，試 樣的稀釋率低時(shí)，所述試樣中的紅細(xì)胞有可能影響白細(xì)胞與分析試劑的反應(yīng)，根據(jù)紅細(xì) 胞含有率(血細(xì)胞比容值等)，所述白細(xì)胞的測(cè)定結(jié)果有時(shí)產(chǎn)生變化。因此不能穩(wěn)定地分 析。另外，所述分析時(shí)的流速慢時(shí)，則由于可以測(cè)定的白細(xì)胞數(shù)少，分析精度變低。因 此，為提高分析精度，需要延長(zhǎng)測(cè)定時(shí)間以增加總流量。然而，在現(xiàn)有的白細(xì)胞的分析 方法中，若如上所述延長(zhǎng)測(cè)定時(shí)間，則所述白細(xì)胞與所述分析試劑的反應(yīng)在測(cè)定時(shí)間內(nèi) 進(jìn)行，不能穩(wěn)定地分析。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本專利第3143064號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題因此，本發(fā)明的目的為提供一種白細(xì)胞的分析方法及其使用的分析試劑，所述 分析方法例如即使在所述包含白細(xì)胞以及紅細(xì)胞的試樣的稀釋率低的情況下，或者在分 析時(shí)的流速慢的情況下，也可以穩(wěn)定地進(jìn)行白細(xì)胞的分類以及計(jì)數(shù)。用于解決問(wèn)題的方案為達(dá)成所述目的，本發(fā)明的分析方法，其特征在于，其是包括如下工序的白細(xì) 胞的分析方法混合工序，將包含白細(xì)胞和紅細(xì)胞的試樣以及包含與白細(xì)胞反應(yīng)的表面 活性劑的分析試劑混合；以及測(cè)定工序，使所述試樣與所述分析試劑的混合液通過(guò)微 孔，測(cè)定在所述通過(guò)時(shí)檢出的信號(hào)，對(duì)所述試樣中的白細(xì)胞進(jìn)行分類以及計(jì)數(shù)；所述分
4析試劑進(jìn)一步包含非離子表面活性劑，所述非離子表面活性劑具有作為親水部的糖殘基 和作為疏水部的脂肪鏈。本發(fā)明的分析試劑，其特征在于，其是用于本發(fā)明的分析方法的、包含與白細(xì) 胞反應(yīng)的表面活性劑的分析試劑，其進(jìn)一步包含非離子表面活性劑，所述非離子表面活 性劑具有作為親水部的糖殘基和作為疏水部的脂肪鏈。發(fā)明效果利用本發(fā)明，例如，即使在包含白細(xì)胞以及紅細(xì)胞的試樣的稀釋率低的情況 下，也可以抑制紅細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞與分析試劑反應(yīng)的影響，穩(wěn)定地分析白細(xì)胞。另外，利 用本發(fā)明，例如，即使在分析時(shí)的流速慢的情況下，由于分析試劑對(duì)白細(xì)胞的反應(yīng)緩慢 發(fā)生，因此也可以延長(zhǎng)設(shè)定測(cè)定時(shí)間，可以在分析中獲得充分的流量，可以穩(wěn)定地進(jìn)行 分析。進(jìn)一步，本發(fā)明由于可以用于μ TAS，因而，例如試樣的少量化、一次性測(cè)試盒 的利用、分析裝置的小型化成為可能。


圖1之(A)為表示本發(fā)明的分析方法中使用的測(cè)試盒的一個(gè)實(shí)施方式的平面圖。 圖1之(B)為圖1之(A)中表示的測(cè)試盒的透視圖。圖2是表示本發(fā)明的分析方法中使用的白細(xì)胞分析裝置的一個(gè)實(shí)施方式的截面 圖。圖3之(A)為表示本發(fā)明的一例中反應(yīng)時(shí)間為30秒時(shí)白細(xì)胞的粒度分布的直方 圖。圖3之(B)為表示本發(fā)明的一例中反應(yīng)時(shí)間為60秒時(shí)白細(xì)胞的粒度分布的直方圖。 圖3之(C)為表示本發(fā)明的一例中反應(yīng)時(shí)間為30秒以及60秒時(shí)白細(xì)胞的粒度分布的直方 圖。圖4之(A)為表示本發(fā)明的另外一例中反應(yīng)時(shí)間為30秒時(shí)白細(xì)胞的粒度分布的 直方圖。圖4之(B)為表示本發(fā)明的另外一例中反應(yīng)時(shí)間為60秒時(shí)白細(xì)胞的粒度分布的 直方圖。圖4之(C)為表示本發(fā)明的另外一例中反應(yīng)時(shí)間為30秒以及60秒時(shí)白細(xì)胞的 粒度分布的直方圖。圖5之(A)為表示比較例中反應(yīng)時(shí)間為30秒時(shí)白細(xì)胞的粒度分布的直方圖。圖 5之(B)為表示比較例中反應(yīng)時(shí)間為60秒時(shí)白細(xì)胞的粒度分布的直方圖。圖5之(C)為 表示比較例中反應(yīng)時(shí)間為30秒以及60秒時(shí)白細(xì)胞的粒度分布的直方圖。圖6之(A)為表示另外的比較例中反應(yīng)時(shí)間為30秒時(shí)白細(xì)胞的粒度分布的直方 圖。圖6之(B)為表示另外的比較例中反應(yīng)時(shí)間為60秒時(shí)白細(xì)胞的粒度分布的直方圖。 圖6之(C)為表示另外的比較例中反應(yīng)時(shí)間為30秒以及60秒時(shí)白細(xì)胞的粒度分布的直方 圖。圖7為表示本發(fā)明的分析方法中使用的白細(xì)胞分析裝置的另一實(shí)施方式的截面 圖。圖8為本發(fā)明的分析方法中使用的白細(xì)胞分析裝置的微孔部分的其它例子的截 面圖。圖9之(A) (C)為表示通過(guò)使用比較例的各種分析試劑進(jìn)行分析而得到的白細(xì) 胞的粒度分布的直方圖。圖9之(A)為表示使用基本試劑的分析結(jié)果的直方圖，圖9之(B)為表示使用添加有月桂基三甲基氯化銨的分析試劑的分析結(jié)果的直方圖，圖9之(C) 為表示使用添加有聚氧乙烯月桂基醚的分析試劑的分析結(jié)果的直方圖。圖10之(A) (D)為表示通過(guò)使用本發(fā)明的各種分析試劑進(jìn)行分析而得到的白 細(xì)胞的粒度分布的直方圖。圖10之(A)為表示使用添加有蔗糖月桂酸酯的分析試劑的 分析結(jié)果的直方圖，圖10之(B)為表示使用添加有蔗糖單月桂酸酯的分析試劑的分析結(jié) 果的直方圖，圖10之(C)為表示使用添加有蔗糖單癸酸酯的分析試劑的分析結(jié)果的直方 圖，圖10之(D)為表示使用添加有十二烷基麥芽糖苷的分析試劑的分析結(jié)果的直方圖。圖11之(A) (F)為表示通過(guò)使用添加了規(guī)定濃度蔗糖月桂酸酯的各種分析試 劑進(jìn)行分析而得到的白細(xì)胞的粒度分布的直方圖。圖11之(A)為表示使用添加0w/v% 的分析試劑(無(wú)添加)的分析結(jié)果的直方圖，圖11之(B)為表示使用添加0.0125w/v% 的分析試劑的分析結(jié)果的直方圖，圖11之(C)為表示使用添加0.025w/V%的分析試劑的 分析結(jié)果的直方圖，圖11之(D)為表示使用添加0.05w/V%的分析試劑的分析結(jié)果的直 方圖，圖11之(E)為表示使用添加0.1w/V%的分析試劑的分析結(jié)果的直方圖，圖11之 (F)為表示使用添加0.2w/V%的分析試劑的分析結(jié)果的直方圖。附圖標(biāo)記說(shuō)明1 測(cè)試盒；2 上基板；3 下基板；4 試樣計(jì)量部；41 試樣導(dǎo)入部； 42:試樣導(dǎo)入流路；43:分支部；44:溢出流路；45、55、58、65:排液部；46: 試樣計(jì)量流路；47 節(jié)流孔；5 稀釋部；51 試劑槽；52 試劑導(dǎo)入流路；53 :分 支部；54:溢出流路；56:試劑計(jì)量流路；57:錐形部；59:稀釋槽；6:分析部； 61、62:電極、電極配置部；14、63、84微孔；64:流量測(cè)量流路；7:連接器； 8、88:白細(xì)胞分析裝置；9:主槽；10:副槽；11:抽吸部；12、13:電極；15:定 量部；16 :基板部；17 攪拌槽；18 攪拌管；19 抽吸管；21a、21b 貫通孔、導(dǎo) 入口； 22a、22b、22c、22d、22e 貫通孔；90:主槽部；100:副槽部；160:攪拌 部；91a、91b、101a、101b、161a、161b 基板；840 彈性體；
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的分析方法中，所述非離子表面活性劑優(yōu)選所述糖殘基是二糖的殘基。本發(fā)明的分析方法中，所述非離子表面活性劑優(yōu)選所述脂肪鏈?zhǔn)侵舅釟埢驘喕１景l(fā)明的分析方法中，優(yōu)選所述非離子表面活性劑為選自由蔗糖單月桂酸酯、 蔗糖月桂酸酯、蔗糖單癸酸酯以及十二烷基麥芽糖苷組成的組中的至少一種。本發(fā)明的分析方法中，優(yōu)選所述非離子表面活性劑為蔗糖單月桂酸酯或蔗糖月 桂酸酯。本發(fā)明的分析方法中，優(yōu)選所述試樣與所述分析試劑的所述混合液中的所述非 離子表面活性劑的濃度為0.001 范圍。本發(fā)明的分析方法中，優(yōu)選所述與白細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑為季銨鹽。本發(fā)明的分析方法中，優(yōu)選所述試樣與所述分析試劑的所述混合液中的、所述 與白細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑的濃度為0.01 范圍。本發(fā)明的分析方法中，優(yōu)選所述分析試劑進(jìn)一步包含與紅細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑。本發(fā)明的分析方法中，優(yōu)選所述與紅細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑為皂角苷。本發(fā)明的分析方法中，優(yōu)選所述試樣與所述分析試劑的所述混合液中的所述皂 角苷的濃度為0.05 5*八％的范圍。本發(fā)明的分析方法的所述混合工序中，優(yōu)選所述試樣(X)和所述分析試劑(Y) 的混合體積比(X Y)為1 0.4 1 99的范圍。本發(fā)明的分析方法的所述測(cè)定工序中，優(yōu)選將所述白細(xì)胞按照其體積分類為3 種。本發(fā)明的分析方法的所述測(cè)定工序中，優(yōu)選使用具有所述微孔的測(cè)試盒，并使 所述混合液通過(guò)所述測(cè)試盒內(nèi)的所述微孔。本發(fā)明的分析方法中，優(yōu)選所述測(cè)試盒為微全分析系統(tǒng)。本發(fā)明的分析試劑中，優(yōu)選所述糖殘基為二糖。本發(fā)明的分析試劑中，優(yōu)選所述脂肪鏈為脂肪酸殘基或烷基。本發(fā)明的分析試劑中，優(yōu)選所述非離子表面活性劑為選自由蔗糖單月桂酸酯、 蔗糖月桂酸酯、蔗糖單癸酸酯以及十二烷基麥芽糖苷組成的組中的至少一種。本發(fā)明的分析試劑中，優(yōu)選所述與白細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑為季銨鹽。本發(fā)明的分析試劑中，優(yōu)選所述分析試劑進(jìn)一步包含與紅細(xì)胞反應(yīng)的表面活性 劑。本發(fā)明的分析試劑中，優(yōu)選所述與紅細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑為皂角苷。接下來(lái)舉例說(shuō)明本發(fā)明。<分析方法>如上所述，本發(fā)明的分析方法，其特征在于，其是包括如下工序的白細(xì)胞的分 析方法混合工序，將包含白細(xì)胞以及紅細(xì)胞的試樣以及包含與白細(xì)胞反應(yīng)的表面活性 劑的分析試劑混合；以及測(cè)定工序，使所述試樣與所述分析試劑的混合液通過(guò)微孔，測(cè) 定在所述通過(guò)時(shí)檢出的信號(hào)，對(duì)所述試樣中的白細(xì)胞進(jìn)行分類以及計(jì)數(shù)，所述分析試劑 進(jìn)一步包含非離子表面活性劑，所述非離子表面活性劑具有作為親水部的糖殘基和作為 疏水部的脂肪鏈。另外，本發(fā)明的分析方法中使用的所述分析試劑相當(dāng)于本發(fā)明的分析 試齊LU通過(guò)本發(fā)明，例如，不易受到紅細(xì)胞含量(血細(xì)胞比容值等)的影響，可以穩(wěn)定 地分析。另外，通過(guò)本發(fā)明，例如，可以提高比淋巴細(xì)胞還要小的脈沖下檢出的血液成 分(噪音)與淋巴細(xì)胞的分離精度，另外可以提高粒細(xì)胞的分離精度。因而通過(guò)本發(fā)明 例如可以提高分析精度?；旌瞎ば蛩龌旌瞎ば蛑校旌纤鲈嚇优c所述分析試劑，使所述試樣中的所述白細(xì)胞 以及所述紅細(xì)胞與所述分析試劑反應(yīng)。作為對(duì)所述白細(xì)胞的反應(yīng)，例如可以列舉出白細(xì) 胞的細(xì)胞膜溶解引起的裸核化，滲透壓變化引起的收縮或膨脹等。另外，本發(fā)明中，作 為對(duì)所述紅細(xì)胞的反應(yīng)，例如可列舉出溶血、紅細(xì)胞膜的溶解等。作為包含所述白細(xì)胞以及所述紅細(xì)胞的試樣，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出血 液試樣、血液試樣處理后的試樣等。所述血液試樣例如可列舉出全血、血細(xì)胞等。作為所述處理，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出稀釋處理等。所述稀釋處理沒(méi)有特別限定，作 為稀釋液例如可以使用生理鹽水、緩沖液等。所述稀釋倍率沒(méi)有特別限定，例如為1 500倍的范圍，優(yōu)選為5 400倍的范圍，更優(yōu)選為200 300倍的范圍。另外，例如 在稀釋全血時(shí)，混合所述稀釋試樣與所述分析試劑時(shí)，優(yōu)選使得全血被稀釋至5 1000 倍，進(jìn)一步優(yōu)選15 400倍。另外，此時(shí)混合所述稀釋試樣與所述分析試劑而得到的所 述混合液內(nèi)所述分析試劑的各成分的濃度范圍優(yōu)選為下述范圍。作為所述緩沖液沒(méi)有特別限定，例如可列舉出ADA(N-(2-乙酰胺)亞氨基 二乙酸)緩沖液、MES (2-嗎啉代乙烷磺酸)緩沖液、Bis-Tris (雙_ (2-羥乙基)亞 氨基-三_(羥甲基甲烷)緩沖液、PIPES(哌嗪-1，4-雙(2-乙烷磺酸))緩沖液、 ACES (N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙烷磺酸)緩沖液、MOPSO (2-羥基-3-嗎啉代丙烷磺酸) 緩沖液、BES(N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙烷磺酸)緩沖液、HEPES(2-[4-(2-羥乙 基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸)緩沖液、磷酸緩沖液等。所述緩沖液的pH例如為pH2 12 的范圍，優(yōu)選為pH5 7.5的范圍。所述試樣的動(dòng)物種類沒(méi)有特別限定，例如可列舉出人、牛、馬、犬、貓等哺乳類等。本發(fā)明中，所述分析試劑包含所述白細(xì)胞反應(yīng)性表面活性劑以及所述非離子表 面活性劑。所述白細(xì)胞反應(yīng)性表面活性劑沒(méi)有特別限定，例如可列舉出季銨鹽、皂角苷、 聚氧乙烯系非離子表面活性劑、聚氧乙烯系陰離子表面活性劑等，優(yōu)選為季銨鹽。所述 白細(xì)胞反應(yīng)性表面活性劑例如可以為任意一種，也可以兩種以上組合使用。所述季銨鹽沒(méi)有特別限定，例如可列舉出月桂基三甲基氯化銨、鯨蠟基三甲基 氯化銨、四(三甲基)氯化銨、硬脂基三甲基氯化銨、山?；谆然@、椰油基芐基 二甲基氯化銨、二癸基二甲基氯化銨、肉豆蔻基三甲基溴化銨等，優(yōu)選為月桂基三甲基 氯化銨、鯨蠟基三甲基氯化銨、四(三甲基)氯化銨。所述季銨鹽例如可以為任意一種， 也可以兩種以上組合使用。所述試樣與所述分析試劑的所述混合液中的所述白細(xì)胞反應(yīng)性表面活性劑的濃 度沒(méi)有特別限定，例如可以根據(jù)表面活性劑的種類適當(dāng)?shù)卦O(shè)定，例如為0.01
范圍，優(yōu)選為0.075 范圍。所述白細(xì)胞反應(yīng)性表面活性劑為所述季銨鹽時(shí)， 所述試樣與所述分析試劑的所述混合液中的所述季銨鹽的濃度沒(méi)有特別限定，例如為上 述的濃度范圍。本發(fā)明中，如上所述，所述非離子表面活性劑具有作為親水部的糖殘基和作為 疏水部的脂肪鏈。作為所述糖殘基沒(méi)有特別限定，例如可列舉出單糖、二糖、寡糖等的糖殘基。 所述糖殘基內(nèi)單糖數(shù)沒(méi)有特別限定，例如可以為1 20個(gè)的范圍。作為所述單糖的糖殘 基，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出葡萄糖殘基、半乳糖殘基、甘露糖殘基、硫代葡萄糖 殘基、阿拉伯糖殘基、木糖殘基、葡萄糖醛酸殘基、葡萄糖胺殘基等。作為所述二糖的 糖殘基，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出蔗糖殘基(蔗糖殘基)、乳糖殘基、麥芽糖殘基、 硫代麥芽糖殘基等，優(yōu)選為蔗糖殘基。作為所述脂肪鏈，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出脂肪酸殘基、烷基等。作為所述脂肪酸殘基，沒(méi)有特別限定，例如可以為飽和脂肪酸殘基，也可以為不飽和脂肪酸殘 基。另外，所述脂肪酸殘基，例如可列舉出直鏈脂肪酸殘基、支鏈脂肪酸殘基、環(huán)狀脂 肪酸殘基等，沒(méi)有特別限定。所述脂肪酸殘基的碳原子數(shù)沒(méi)有特別限定，例如為4 28的范圍，優(yōu)選為10 22的范圍。作為所述飽和脂肪酸殘基，沒(méi)有特別限定，例如 可列舉出癸酸殘基、月桂酸殘基、肉豆蔻酸殘基、十五酸殘基、棕櫚酸殘基、硬脂酸殘 基、花生酸殘基、山崳酸殘基等，優(yōu)選為癸酸殘基、月桂酸殘基，這些例如優(yōu)選為癸酰 基、十二?；?、十四?；?、十五酰基、十六酰基、十八酰基、二十?；?、二十二?；??；?。作為所述不飽和脂肪酸殘基，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出油酸殘基、亞油酸殘 基等，這些例如優(yōu)選為順-9-十八碳烯?；㈨?，順-9，12-十八碳二烯?；弱；?。作為所述烷基，沒(méi)有特別限定，例如可以為直鏈狀烷基，也可以為支鏈狀烷 基。所述烷基的碳原子數(shù)沒(méi)有特別限定，例如可以為1 18個(gè)的范圍。作為所述烷基 的具體例，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁 基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、 十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷 基等ο作為所述非離子表面活性劑的具體例沒(méi)有特別限定，例如可列舉出蔗糖脂肪酸
酯、烷基糖苷、烷基寡糖等。作為所述蔗糖脂肪酸酯沒(méi)有特別限定，例如可列舉出蔗糖癸酸酯、蔗糖月桂酸 酯、蔗糖肉豆蔻酸酯、蔗糖棕櫚酸酯、蔗糖硬脂酸酯、蔗糖山崳酸酯、蔗糖油酸酯、蔗 糖亞油酸酯等，優(yōu)選為蔗糖癸酸酯、蔗糖月桂酸酯。所述蔗糖脂肪酸酯，例如可列舉出 單酯、二酯、三酯等，沒(méi)有特別限定。作為所述蔗糖脂肪酸單酯，沒(méi)有特別限定，例如 可列舉出蔗糖單癸酸酯、蔗糖單月桂酸酯、蔗糖單肉豆蔻酸酯、蔗糖單棕櫚酸酯、蔗糖 單硬脂酸酯、蔗糖單山崳酸酯、蔗糖單油酸酯、蔗糖單亞油酸酯等，優(yōu)選為蔗糖單癸酸 酯、蔗糖單月桂酸酯。作為所述蔗糖脂肪酸二酯，沒(méi)有特別限定，例如可例舉出蔗糖二 癸酸酯、蔗糖二月桂酸酯、蔗糖二肉豆蔻酸酯、蔗糖二棕櫚酸酯、蔗糖二硬脂酸酯、蔗 糖二山崳酸酯、蔗糖二油酸酯、蔗糖二亞油酸酯等，優(yōu)選為蔗糖二癸酸酯、蔗糖二月桂 酸酯。作為所述蔗糖脂肪酸三酯，沒(méi)有特別限定，例如可例舉出蔗糖三癸酸酯、蔗糖三 月桂酸酯、蔗糖三肉豆蔻酸酯、蔗糖三棕櫚酸酯、蔗糖三硬脂酸酯、蔗糖三山崳酸酯、 蔗糖三油酸酯、蔗糖三亞油酸酯等，優(yōu)選為蔗糖三癸酸酯、蔗糖三月桂酸酯。所述蔗糖脂肪酸酯，例如可以為單酯、二酯、三酯等任意一種，還可以為這些 的混合物。所述蔗糖脂肪酸酯，例如優(yōu)選為包含所述單酯的蔗糖脂肪酸酯，所述蔗糖脂 肪酸單酯的比例沒(méi)有特別限定，例如為50 100體積％的范圍，優(yōu)選為70 100體積％ 的范圍。作為所述烷基糖苷，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出正辛基-D-葡糖苷、正 十二烷基-β-麥芽糖苷、正癸基麥芽糖苷、正辛基-D-麥芽糖苷、3-氧雜十三 烷基-a-D-甘露糖苷、正庚基-β-硫代葡糖苷、正壬基-β-D-硫代麥芽糖苷、正辛 基-β-D-硫代葡糖苷等。所述非離子表面活性劑，例如，可以為任意一種，也可以兩種以上組合使用。所述試樣與所述分析試劑的所述混合液中的所述非離子表面活性劑的濃度沒(méi)有
9特別限定，例如為0.001 范圍，優(yōu)選為0.001 范圍，更優(yōu)選為 0.01 1\￥八％的范圍。如上所述，所述分析試劑優(yōu)選不僅包含所述白細(xì)胞反應(yīng)性表面活性劑以及所述 非離子表面活性劑，還包含與所述紅細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑(以下稱為紅細(xì)胞反應(yīng)性表 面活性劑)。本發(fā)明中，作為所述紅細(xì)胞反應(yīng)性表面活性劑，沒(méi)有特別限定，例如可以為化 學(xué)合成的表面活性劑，也可以為來(lái)自天然物質(zhì)的表面活性劑。作為所述化學(xué)合成的表面 活性劑，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出陽(yáng)離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、兩 性表面活性劑等。作為所述陽(yáng)離子性表面活性劑，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出十二烷 基溴化吡啶、鯨蠟基氯化吡啶等。作為所述陰離子性表面活性劑，沒(méi)有特別限定，例如 可列舉出十二烷基硫酸鈉、十四烷基磺酸鈉等。作為所述兩性表面活性劑，沒(méi)有特別 限定，例如可列舉出CHAPS (硫酸-3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨]-1_丙烷)、十二烷 基-N-甜菜堿等。另外，所述來(lái)自天然物質(zhì)的表面活性劑沒(méi)有特別限定，例如可列舉 出皂角苷、酪蛋白、卵磷脂等。作為所述紅細(xì)胞反應(yīng)性表面活性劑，在其中優(yōu)選為皂角 苷。而且，所述皂角苷可以兼作所述白細(xì)胞反應(yīng)性表面活性劑和所述紅細(xì)胞反應(yīng)性表面 活性劑。所述試樣與所述分析試劑的所述混合液中的所述紅細(xì)胞反應(yīng)性表面活性劑的濃 度沒(méi)有特別限定，例如可以根據(jù)使用的表面活性劑適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。所述試樣與所述分析試 劑的所述混合液中的所述紅細(xì)胞反應(yīng)性表面活性劑的濃度沒(méi)有特別限定，例如為0.05
范圍，優(yōu)選為0.1 范圍。在使用所述皂角苷時(shí)，所述試樣與所述 分析試劑的所述混合液中的所述皂角苷的濃度沒(méi)有特別限定，例如為前述的濃度范圍。本發(fā)明中，所述分析試劑的上述表面活性劑以外的組成沒(méi)有特別限定，例如可 以包含緩沖液、添加劑等。作為所述緩沖液，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出前述的緩沖 液等。所述緩沖液的pH沒(méi)有特別限定，例如與前述的pH范圍一樣。作為所述添加劑，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出防再凝集劑、血紅蛋白測(cè)定用 的添加劑等。所述防再凝集劑例如為用于防止血液試樣成分的再凝集的溶液。作為所述防再 凝集劑，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出檸檬酸鈉、肝素、EDTA(乙二胺四乙酸)、氟化 鈉、ACD (檸檬酸-葡萄糖(dextrose)液)等。所述試樣與所述分析試劑的所述混合液中的所述防再凝集劑的濃度沒(méi)有特別限 定，可以根據(jù)所使用的成分適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。所述試樣與所述分析試劑的所述混合液中的所 述防再凝集劑的濃度沒(méi)有特別限定，例如為0.05 范圍，優(yōu)選為0.1 0.5w/
范圍。在使用所述檸檬酸鈉作為所述防再凝集劑時(shí)，所述試樣與所述分析試劑的所 述混合液中的所述檸檬酸鈉的濃度沒(méi)有特別限定，例如為前述的濃度范圍。作為所述血紅蛋白測(cè)定用的添加劑，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出亞硝酸鈉、 高氯酸、硫氰酸、碘化鉀、溴化鉀、三氯乙酸、三氟乙酸等。所述試樣與所述分析試劑 的所述混合液中的所述血紅蛋白測(cè)定用的添加劑濃度沒(méi)有特別限定，例如為0.01 Iw/ 乂％的范圍，優(yōu)選為0.01 范圍。使用所述亞硝酸鈉時(shí)，所述試樣與所述分 析試劑的所述混合液中的所述亞硝酸鈉的濃度沒(méi)有特別限定，例如為所述的濃度范圍。
本發(fā)明的分析方法中，在所述反應(yīng)工序中，所述試樣(X)與所述分析試劑(Y) 的混合體積比沒(méi)有特別限定，例如為X Y=I 0.4 1 99的范圍，優(yōu)選為X Y =1 9 1 99的范圍，更優(yōu)選為X Y = 1 19 1 49的范圍。所述混合液中，例如，相對(duì)于IyL全血，所述白細(xì)胞反應(yīng)性表面活性劑例如優(yōu) 選為0.02 2mg的范圍，所述非離子表面活性劑優(yōu)選為0.001 0.25mg的范圍，所述紅 細(xì)胞反應(yīng)性表面活性劑優(yōu)選為0.004 0.4mg的范圍。在所述反應(yīng)工序中，混合所述試樣和所述分析試劑，使所述分析試劑與所述白 細(xì)胞以及紅細(xì)胞反應(yīng)的時(shí)間沒(méi)有特別限定，例如為10 300秒的范圍，優(yōu)選為30 120 秒的范圍。通過(guò)使所述反應(yīng)時(shí)間在所述時(shí)間的范圍內(nèi)，從而使白細(xì)胞與分析試劑反應(yīng)至 適于分類的程度，且該反應(yīng)狀態(tài)保持固定，因而可以穩(wěn)定地分析白細(xì)胞。本發(fā)明的分析試劑的劑型沒(méi)有特別限定，例如可列舉出液劑、粉劑、粒劑等。 作為所述分析試劑的制備方法，例如，可以采用目前公知的制造方法，沒(méi)有特別限定。 作為所述液劑的制備方法，沒(méi)有特別限定，例如可以將所述的表面活性劑混合于所述的 緩沖液中而制備。作為所述粉劑的制備方法，沒(méi)有特別限定，例如可以使所述液劑干燥 而制備。另外，作為所述粒劑的制備方法，沒(méi)有特別限定，例如可以將造粒劑等助劑添 加到所述粉劑內(nèi)，使用造粒裝置等而制備。本發(fā)明的分析試劑為例如粉劑或粒劑時(shí)，通 過(guò)將所述試樣與所述分析試劑混合，可以使所述分析試劑的成分溶解、懸浮或分散于所 述混合液中，也可以預(yù)先溶解、懸浮或分散于緩沖液等中，再與所述試樣混合。測(cè)定工序所述測(cè)定工序中，使所述試樣與所述分析試劑的所述混合液通過(guò)微孔，測(cè)定在 所述通過(guò)時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)，對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分類以及計(jì)數(shù)。另外，本發(fā)明例如也可以說(shuō)是如 下方法對(duì)所述試樣與所述分析試劑的所述混合液，檢出與所述試樣中的細(xì)胞的大小相 關(guān)的信息以及與形態(tài)相關(guān)的信息中的至少一者，由此對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分類以及計(jì)數(shù)。這些 信息可以作為下述的信號(hào)檢出。所述混合液的微孔的通過(guò)以及所述通過(guò)時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)的測(cè)定，沒(méi)有特別限定。 所述微孔，例如，可以為流路的一部分(一點(diǎn))。即，例如，在使所述混合液通過(guò)流路 時(shí)，可以將所述流路的需要的部位(一點(diǎn))作為所述微孔部，測(cè)定通過(guò)該部位時(shí)的信號(hào)。 另外，所述微孔也可以為流路途中變細(xì)而形成。即，可以使流路上的“變細(xì)部分”成為 微孔。這樣，所述流路在具有所述微孔時(shí)，例如，從所述流路的一端側(cè)向所述流路內(nèi)導(dǎo) 入、填充所述試樣與所述分析試劑的所述混合液。然后，使所述試樣向所述流路的另一 端側(cè)移動(dòng)。由此，使所述混合液通過(guò)所述微孔，測(cè)定使所述混合液通過(guò)所述微孔時(shí)產(chǎn)生 的信號(hào)。將所述混合液導(dǎo)入流路內(nèi)的方法沒(méi)有特別限定，例如，可以通過(guò)在所述流路的 另一端側(cè)連接減壓泵等抽吸空氣而導(dǎo)入，也可以通過(guò)在電極和電極之間配置所述微孔， 并在所述兩電極間施加電壓而導(dǎo)入。在后者的情況下，例如，優(yōu)選在所述電極間填充電 泳溶液后，通過(guò)電泳使所述混合液移動(dòng)。所述流路例如優(yōu)選設(shè)置于測(cè)試盒中，作為測(cè)試 盒，優(yōu)選為μ TAS等微芯片。另外，所述微孔例如也可以為設(shè)置于用于隔開(kāi)相連的液槽的隔壁上的貫通孔 (節(jié)流孔)。這種情況下，例如，向一方的所述液槽內(nèi)注入所述試樣以及所述分析試劑， 向另一方的所述液槽內(nèi)填充生理鹽水。接著，通過(guò)與所述另一方的液槽相連的減壓泵，對(duì)所述液槽內(nèi)部進(jìn)行減壓，使所述試樣與所述分析試劑的所述混合液向所述另一方的液 槽移動(dòng)。由此，使所述白細(xì)胞通過(guò)所述微孔，測(cè)定使所述混合液通過(guò)所述微孔時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)。所述微孔的大小沒(méi)有特別限定，可以根據(jù)所使用的分析裝置適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。例 如，使用所述μ TAS作為所述分析裝置時(shí)，在與所述混合液的移動(dòng)方向垂直的方向上， 所述微孔的截面形狀沒(méi)有特別限定，例如可列舉出矩形、圓形等。所述截面形狀為矩形 時(shí)，所述微孔沒(méi)有特別限定，例如其寬度為10 200 μ m的范圍，其深度為10 200 μ m 的范圍，優(yōu)選其寬度為50 100 μ m的范圍，其深度為50 100 μ m的范圍。所述截 面形狀為圓形時(shí)，所述微孔的孔徑(直徑)例如為10 200μιη的范圍，優(yōu)選為50 IOOym的范圍。另外，所述微孔的在所述移動(dòng)方向上的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限定，例如為10 200 μ m的范圍，優(yōu)選為50 100 μ m的范圍。所述微孔例如為所述隔壁的貫通孔(節(jié)流孔)的情況下，在與所述混合液的移 動(dòng)方向垂直的方向上，所述貫通孔的截面形狀沒(méi)有特別限定，例如可列舉出矩形、圓形 等。所述截面形狀為矩形時(shí)，所述微孔沒(méi)有特別限定，例如其寬度為10 200 μ m的范 圍，其高度為10 200 μ m的范圍，優(yōu)選其寬度為50 100 μ m的范圍，其高度為50 100 μ m的范圍。所述截面形狀為圓形時(shí)，所述微孔的孔徑(直徑)例如為10 200 μ m 的范圍，優(yōu)選為50 100 μ m的范圍。另外，所述微孔的在所述移動(dòng)方向上的長(zhǎng)度沒(méi)有 特別限定，例如為10 200 μ m的范圍，優(yōu)選為50 IOOym的范圍。作為通過(guò)所述微孔時(shí)檢出的信號(hào)，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出DC電阻 (impedance) > RF電阻等電阻、前向散射光、側(cè)向散射光、熒光等。作為測(cè)定所述信號(hào)的方法，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出測(cè)定電壓或電流值的 電化學(xué)方法，測(cè)定光、染料的強(qiáng)度的光學(xué)方法等。所述電阻，例如為在含有血細(xì)胞的溶液通過(guò)所述微孔時(shí)電極間的電阻。具體 地，例如，在所述兩電極之間通有電流的狀態(tài)下，所述溶液通過(guò)配置在電極和電極之間 的微孔時(shí)產(chǎn)生的電阻。所述溶液中懸浮的白細(xì)胞等血細(xì)胞通過(guò)所述微孔時(shí)電阻發(fā)生變 化，因此通過(guò)測(cè)定電阻檢出該變化，可以分析所述試樣中含有的白細(xì)胞。通直流電流作 為電流時(shí)的電阻為DC電阻，通常，根據(jù)血細(xì)胞的容積而變化。另外，通高頻電流作為 電流時(shí)的電阻為RF電阻，通常，根據(jù)血細(xì)胞的容積以及內(nèi)部狀態(tài)而變化。本發(fā)明中， 所述包含血細(xì)胞的溶液為包含本發(fā)明的分析試劑和試樣的混合液。包含所述分析試劑或 所述血細(xì)胞的溶液(即所述混合液)的電導(dǎo)率沒(méi)有特別限定，例如為11 20mS/cm的范 圍，優(yōu)選為13 18mS/cm的范圍。另外，所述散射光以及熒光的檢出方法沒(méi)有特別限定，例如可以采用常規(guī)的方 法，可以使用流式細(xì)胞儀，對(duì)通過(guò)所述微孔的血細(xì)胞照射光而檢出。作為所述光的光 源，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出水冷高功率激光、低功率風(fēng)冷激光、二極管激光、氙燈等。所述白細(xì)胞的分類以及計(jì)數(shù)沒(méi)有特別限定，例如可以使用能夠由所述信號(hào)的信 息進(jìn)行分析的方法適當(dāng)?shù)貙?shí)施。作為所述信號(hào)，例如，在測(cè)定所述DC電阻時(shí)，從檢出 的脈沖(電阻變化)的大小，按尺寸大小將白細(xì)胞分類，從所述脈沖的頻率，可以算出所 述白細(xì)胞的按尺寸大小的比率。所述白細(xì)胞一般可列舉出嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞以及嗜堿性粒細(xì)胞等粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞這類無(wú)顆粒白細(xì)胞等。本發(fā)明中， 白細(xì)胞的分類類別沒(méi)有特別限定，例如可列舉出分為粒細(xì)胞和無(wú)顆粒白細(xì)胞2種(即白細(xì) 胞的2分類)，分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞以及粒細(xì)胞3種(即白細(xì)胞的3分類)，分為嗜 中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞5種(即白細(xì)胞的5 分類)。本發(fā)明的分析方法中，所述白細(xì)胞的分類沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選為3分類。本發(fā)明的分析方法可以與其它的血液分析同時(shí)實(shí)施。作為所述其它血液分析的 對(duì)象，沒(méi)有特別限定，例如可列舉出紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板等。下面針對(duì)本發(fā)明的分析方法舉例說(shuō)明。但是，本發(fā)明的分析方法并不限于下述 的例子。(實(shí)施方式1)以下說(shuō)明使用μ TAS測(cè)試盒的本發(fā)明的分析方法的一個(gè)實(shí)施方式。首先圖1所 示為本實(shí)施方式的所述測(cè)試盒的一例。本例的測(cè)試盒是可以安裝于分析裝置(未圖示) 的一次性的測(cè)試盒。圖1之(A)為所述測(cè)試盒的平面圖。圖1之(B)為所述測(cè)試盒的 透視圖。圖1之(A)以及(B)中，同一部分附加同一標(biāo)記。兩圖為為了便于理解的簡(jiǎn) 圖，各構(gòu)成元素的大小、比率等，不限于此，可以不同。如兩圖所示，所述測(cè)試盒1具 有下基板3、上基板2和連接器7，在所述下基板3上層疊有所述上基板2而形成的層疊 體的一個(gè)側(cè)面上配置了連接器7。在所述下基板3上形成了布線圖案(未圖示)。在所述上基板2上形成了 5個(gè)貫通孔。所述5個(gè)貫通孔的底部被所述下基板3 密封而形成5個(gè)液槽。所述5個(gè)液槽分別為試樣導(dǎo)入部41、排液部45、排液部55、排液 部58和排液部65。另外，所述上基板2的底面上形成有大小4個(gè)凹部。在所述4個(gè)凹 部中2個(gè)凹部的開(kāi)口面被所述下基板3密封而形成2個(gè)液槽。所述2個(gè)液槽分別為試劑 槽51和稀釋槽59。在所述試劑槽51中封入有分析試劑。在所述稀釋槽59中封入有攪 拌子(未圖示)。在所述4個(gè)凹部中剩余的2個(gè)凹部的開(kāi)口面被所述下基板3密封所得的 空隙內(nèi)，分別配置了連接所述布線圖案中線路的電極61和62。所述空隙為電極配置部。 上述圖中，61和62為所述電極，也為所述電極配置部。進(jìn)而，在所述上基板2的底面形 成多條溝。所述多條溝的開(kāi)口面被所述下基板3密封而形成流路，連通由所述5個(gè)貫通 孔和所述2個(gè)凹部形成的7個(gè)液槽以及2個(gè)所述電極配置部。所述試樣導(dǎo)入部41依次通過(guò)試樣導(dǎo)入流路42、分支部43、溢出流路44連通到 所述排液部45。另外，所述試樣導(dǎo)入部41還從所述分支部43經(jīng)由試樣計(jì)量流路46連通 到所述稀釋槽59。所述試樣導(dǎo)入部41的開(kāi)口部為用于將作為分析對(duì)象的試樣導(dǎo)入到測(cè)試 盒中的導(dǎo)入口。而且，所述試樣計(jì)量流路46的所述稀釋槽59側(cè)的端部形成了流路截面 積狹小的節(jié)流孔47。所述測(cè)試盒1，例如，可以如下所述計(jì)量所述試樣并導(dǎo)入到稀釋槽59內(nèi)。首 先，將試樣導(dǎo)入所述試樣導(dǎo)入部41中后，通過(guò)連接到所述排液部45的減壓泵等(未圖 示)抽吸空氣，對(duì)連通于所述排液部45的流路內(nèi)部減壓，從所述試樣導(dǎo)入部41導(dǎo)入試 樣。通過(guò)所述抽吸使超過(guò)所述分支部43和所述節(jié)流孔47之間的所述試樣計(jì)量流路46的 容積的所述試樣流出到溢出流路44。接著，關(guān)閉所述排液部45，通過(guò)連接到所述試樣導(dǎo) 入部41的加壓泵等(未圖示)噴出空氣，對(duì)連通于所述試樣導(dǎo)入部41的流路內(nèi)部加壓。 由此，將與所述試樣計(jì)量流路46的容積相當(dāng)?shù)脑嚇訉?dǎo)入到所述稀釋槽59中。因此，所述導(dǎo)入量例如設(shè)定為所述試樣計(jì)量流路46的容積，可以計(jì)量導(dǎo)入。所述試劑槽51依次通過(guò)試劑導(dǎo)入流路52、分支部53、溢出流路54連通到所述 排液部55。另外，所述試劑槽51還從所述分支部53通過(guò)試劑計(jì)量流路56連通到所述稀 釋槽59。在所述試劑槽51中封入有分析試劑(未圖示)。所述試劑計(jì)量流路56在該所 述稀釋槽側(cè)的端部與所述稀釋槽59之間分支，在該分支末端形成所述排液部58。由所述 試劑槽51、試劑導(dǎo)入流路52、分支部53、溢出流路54、排液部55、試劑計(jì)量流路56、 排液部58和稀釋槽59構(gòu)成稀釋部5。另外，在所述試劑計(jì)量流路56的所述稀釋槽側(cè)的 部分形成有錐形部57。在所述稀釋部5中可以如下所述計(jì)量所述分析試劑并導(dǎo)入到所述稀釋槽59內(nèi)。 首先，使所述排液部55和排液部65為關(guān)閉狀態(tài)，使所述排液部58為打開(kāi)狀態(tài)，通過(guò)連 接到所述試劑槽51的加壓泵(未圖示)等噴出空氣，對(duì)連通到所述試劑槽51的流路內(nèi)部 加壓。由此，將所述分析試劑填充到所述試劑計(jì)量流路56中。進(jìn)而，關(guān)閉所述排液部 58，使所述排液部65為打開(kāi)狀態(tài)，通過(guò)連接于所述排液部55的加壓泵(未圖示)等噴出 空氣，對(duì)連通到所述排液部55的流路內(nèi)部加壓。由此，將與所述試劑計(jì)量流路56的容 積相當(dāng)?shù)姆治鲈噭?dǎo)入到所述稀釋槽59中。因此，所述導(dǎo)入量例如設(shè)定為所述試樣計(jì)量 流路56的容積，可以計(jì)量導(dǎo)入。進(jìn)而，如前所述將所述試樣導(dǎo)入到所述稀釋槽59中。 然后，利用磁力攪拌器(未圖示)使所述稀釋槽59內(nèi)的所述攪拌子(未圖示)旋轉(zhuǎn)，從 而可以混合所述試樣和所述分析試劑。另外，本例中為了能夠進(jìn)行溶血處理，所述分析 試劑中可以添加表面活性劑。在連通所述稀釋槽59和所述排液部65的流路上形成微孔63。并且，在所述 微孔63兩端的流路上形成所述電極配置部61和62 (2個(gè)凹部)。所述電極配置部61和 62(凹部)中分別配置了通過(guò)所述電線與電阻檢測(cè)儀(未圖示)相連的所述電極61、62。 另外，通過(guò)所述微孔63和所述2個(gè)電極61、62，在所述排液部65側(cè)形成流量測(cè)量流路 64。由所述電極61和62、微孔63、流量測(cè)量流路64和排液部65構(gòu)成分析部6。所述測(cè)試盒1中，所述上基板2的長(zhǎng)度和寬度沒(méi)有特別限定，例如為10 200mm的范圍，優(yōu)選為20 IOOmm的范圍。另外，所述上基板2的厚度沒(méi)有特別限 定，例如為0.1 IOmm的范圍，優(yōu)選為1 5mm的范圍。所述測(cè)試盒1中，所述下基板3的長(zhǎng)度和寬度沒(méi)有特別限定，例如為與所述上基 板2同樣的長(zhǎng)度和寬度。所述下基板3的厚度沒(méi)有特別限定，例如為0.1 IOmm的范 圍，優(yōu)選為1 5mm的范圍。所述測(cè)試盒1中所述上基板2以及下基板3的材質(zhì)，例如只要為不妨礙所述吸 光度測(cè)定的材質(zhì)就沒(méi)有特別限定。作為所述上基板2以及下基板3的材質(zhì)，例如可以使 用由玻璃、聚合物材料等形成的材質(zhì)。作為所述玻璃材料沒(méi)有特別限定，例如可列舉出 合成石英玻璃、熔融二氧化硅、硼硅酸玻璃等。作為所述聚合物材料沒(méi)有特別限定，例 如可列舉出聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等丙烯酸類樹(shù)脂、環(huán)烯烴聚合物(COP)、聚碳酸 酯(PC)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PS)、聚乳酸(PLA)、環(huán)氧樹(shù)脂、聚乙烯 (PE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚醚醚酮(PEEK)等。另外，所述下基板3層疊有由所述材 質(zhì)形成的多個(gè)基板。所述多個(gè)基板之間形成由銅箔等構(gòu)成的布線圖案。所述測(cè)試盒1中所述試樣導(dǎo)入部41的直徑和深度沒(méi)有特別限定，例如為直徑0.1 IOmm的范圍、深度0.1 IOmm的范圍，優(yōu)選為直徑1 5mm的范圍、深度1 5mm的范圍。所述測(cè)試盒1中所述試劑槽51的直徑和深度沒(méi)有特別限定，例如為直徑0.5 50mm的范圍、深度0.1 IOmm的范圍，優(yōu)選為直徑1 20mm的范圍、深度1 5mm 的范圍。所述測(cè)試盒1中所述稀釋槽59的直徑和深度沒(méi)有特別限定，例如為直徑0.5 50mm的范圍、深度0.1 IOmm的范圍，優(yōu)選為直徑1 IOmm的范圍、深度1 5mm 的范圍。所述測(cè)試盒1中所述排液部45、55、58以及65的直徑以及深度沒(méi)有特別限定， 例如分別為直徑0.1 IOmm的范圍、深度0.1 IOmm的范圍，優(yōu)選分別為直徑1 5mm 的范圍、深度1 5mm的范圍。所述測(cè)試盒1中，所述試樣導(dǎo)入部41、所述試劑槽51、所述稀釋槽59和所述排 液部45、55、58以及65的液槽的形狀為圓柱狀，但本發(fā)明不限于此。本發(fā)明中各液槽 的形狀沒(méi)有特別限定，例如可列舉出圓柱狀、四棱柱狀、四棱錐狀、圓錐狀等。所述各 液槽的形狀可以完全相同也可以不同，沒(méi)有特別限定。所述測(cè)試盒1中所述試劑計(jì)量流路56的流路的寬度和深度沒(méi)有特別限定，截面 積的最大部分處例如寬度為0.1 IOmm的范圍、深度為0.1 IOmm的范圍，優(yōu)選寬度 為0.5 5mm、深度為0.1 5mm。所述測(cè)試盒1中所述節(jié)流孔47的寬度和深度沒(méi)有特別限定，例如寬度為1 200 μ m的范圍、深度為0.1 IOmm的范圍，優(yōu)選寬度為10 100 μ m、深度為0.1 5mm。所述測(cè)試盒1中所述微孔63的寬度、深度以及長(zhǎng)度如前所述。所述測(cè)試盒1中所述試劑計(jì)量流路56、所述節(jié)流孔47以及微孔63以外的流路的 寬度和深度沒(méi)有特別限定，例如寬度為10 1000 μ m的范圍、深度為0.1 IOmm的范 圍，優(yōu)選寬度為100 500 μ m、深度為0.1 5mm。所述測(cè)試盒1中，所述測(cè)試盒總體的最大厚度為所述上基板2以及所述下基板3 的厚度的總和。所述上基板2以及所述下基板3的厚度如前所述。所述測(cè)試盒1的制造方法沒(méi)有特別限定，例如可采用目前公知的方法。接下來(lái)，針對(duì)使用所述測(cè)試盒1的本例的白細(xì)胞的分析方法進(jìn)行說(shuō)明。首先，將所述測(cè)試盒1通過(guò)連接器7安裝到分析裝置(未圖示)中。另外，與 上述同樣地從所述試樣導(dǎo)入部41導(dǎo)入作為所述試樣的人類全血。并且，如上所述計(jì)量與 所述試樣計(jì)量流路46的容量相當(dāng)?shù)牧康娜祟惾?dǎo)入到所述稀釋槽59中。進(jìn)而，如 上所述計(jì)量與所述試劑計(jì)量流路56的容量相當(dāng)?shù)牧康乃龇治鲈噭┎?dǎo)入到所述稀釋槽 59中。在所述稀釋槽59中混合所導(dǎo)入的所述試樣以及所述分析試劑，用所述磁力攪拌器 (未圖示)使所述攪拌子(未圖示)旋轉(zhuǎn)、攪拌，使所述試樣中的所述白細(xì)胞和紅細(xì)胞與 所述分析試劑反應(yīng)。接下來(lái)，在所述電極61和62之間施加電壓，通過(guò)連接到所述排液部65的減壓 泵等(未圖示)抽吸空氣，對(duì)連通到所述排液部65的流路內(nèi)部減壓。由此，使混合了所 述試樣和所述分析試劑的溶液(混合液)通過(guò)所述微孔63，進(jìn)而流出到所述流量測(cè)量流路
1564。通過(guò)電阻檢測(cè)儀(未圖示)測(cè)定所述混合液通過(guò)所述微孔63時(shí)產(chǎn)生的脈沖(電阻變 化)，制作以所述脈沖的大小以及頻率為兩軸的直方圖。根據(jù)所制作的所述直方圖的彎 曲狀態(tài)將白細(xì)胞按尺寸大小分為三類，累加每種所述分類的脈沖頻率。用所述累加的脈 沖頻率除以流出到所述流量測(cè)量流路64的流量，算出所述試樣中的所述三類白細(xì)胞的比 率。另外，所述三類白細(xì)胞以脈沖小的順序依次為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞以及粒細(xì)胞。(實(shí)施方式2)接下來(lái)說(shuō)明本發(fā)明分析方法的其它實(shí)施方式。首先，圖2表示本實(shí)施方式的分 析方法中使用的白細(xì)胞分析裝置的一例。圖2為所述白細(xì)胞分析裝置的截面圖。圖2為 為了便于理解的簡(jiǎn)圖，各構(gòu)成元素的大小、比率等，不限于此，可以不同。如圖2所示，所述白細(xì)胞分析裝置8由主槽9和副槽10這2個(gè)槽、抽吸部11、 電極12和電極13這2個(gè)電極以及分析部(未圖示)構(gòu)成。所述主槽9和所述副槽10通 過(guò)隔壁隔開(kāi)配置。在所述隔壁上形成作為微孔14的貫通孔而連通所述兩槽的內(nèi)部。所 述主槽9的上面處于開(kāi)口狀態(tài)。所述副槽10在與所述隔壁相異的側(cè)面上形成貫通孔，通 過(guò)所述貫通孔連通所述抽吸部11。所述抽吸部11的另一端配置泵(未圖示)。另外， 所述電極12以及13分別配置在所述主槽9以及所述副槽10上。所述電極12以及13配 置在連接到所述分析部(未圖示)的電線(僅圖示一部分)的末端。作為所述主槽9以及所述副槽10的材質(zhì)，例如可以使用與前述測(cè)試盒的上基板 同樣的材質(zhì)等。所述主槽9以及所述副槽10的形狀沒(méi)有特別限定，例如可列舉出長(zhǎng)方 體、圓筒狀等。所述主槽9以及所述副槽10的形狀可以完全相同也可以不同，沒(méi)有特別 限定。另外，所述主槽9如上所述例如上面可以處于開(kāi)放狀態(tài)。所述微孔14是例如直徑為1 500 μ m的范圍、長(zhǎng)度為1 200 μ m的范圍，優(yōu) 選為直徑10 IOOym的范圍、長(zhǎng)度10 100 μ m的范圍的貫通孔。另外，所述直徑例 如為垂直于所述微孔14貫通方向的截面直徑，所述長(zhǎng)度為所述微孔14貫通方向的長(zhǎng)度， 并且為隔開(kāi)所述主槽9和所述副槽10的所述隔壁的厚度。作為所述抽吸部11的材質(zhì)沒(méi)有特別限定，例如可以使用與所述的兩槽相同的材 料等。所述抽吸部11的形狀沒(méi)有特別限定，例如為圓筒狀。本例的白細(xì)胞分析裝置8的制造方法沒(méi)有特別限定，例如可以適當(dāng)?shù)厥褂媚壳?公知的方法。接下來(lái)，針對(duì)使用所述白細(xì)胞分析裝置8的本例白細(xì)胞分析方法進(jìn)行說(shuō)明。首先，向所述主槽9和所述副槽10注入本發(fā)明的分析試劑。并且，將人類的全 血作為所述試樣添加到所述主槽9中混合30秒鐘。接下來(lái)，在兩個(gè)所述電極之間施加電 壓，通過(guò)連接于所述抽吸部11的所述泵抽吸，對(duì)所述副槽10內(nèi)部減壓。由此，使所述 混合液通過(guò)所述微孔14從所述主槽9向所述副槽10移動(dòng)。使用所述分析部(未圖示) 測(cè)定所述混合液通過(guò)所述微孔14時(shí)產(chǎn)生的脈沖(電阻變化)。與實(shí)施方式1同樣地制作 直方圖，對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分類并計(jì)數(shù)，算出被分類的白細(xì)胞的比率。(實(shí)施方式3)接下來(lái)，說(shuō)明本發(fā)明的分析方法的另一實(shí)施方式。首先，圖7表示本實(shí)施方式 的分析方法中使用的白細(xì)胞分析裝置的一例。圖7為所述白細(xì)胞分析裝置的截面圖。圖 7為為了便于理解的簡(jiǎn)圖，各構(gòu)成元素的大小、比率等不限于此，可以不同。
如圖7所示，所述白細(xì)胞分析裝置88包含主槽部90、副槽部100、攪拌部160、 抽吸部11、電極12和13。另外，所述攪拌部160包含基板部16和攪拌管18。所述抽 吸部11包含抽吸管19和注射筒(未圖示)。所述主槽部90由使基板91a和基板91b這2個(gè)基板并列重疊而成的兩層體構(gòu)成， 并具備在上方開(kāi)口且可以容納液體的空隙部9。該空隙部成為主槽9。所述主槽部90 中，在所述主槽9的側(cè)面即基板91a和基板91b上分別形成了連通所述主槽9內(nèi)部的貫通 孔22a和貫通孔22c。所述攪拌管18的一端與所述貫通孔22c連接。所述主槽9內(nèi)配置 有電極12。所述電極12通過(guò)電線與電壓器連接(未圖示)。所述副槽部100由使基板IOla和基板IOlb這2個(gè)基板并列重疊而成的兩層體構(gòu) 成，與所述主槽部90鄰接配置。所述副槽部100內(nèi)部具備可以導(dǎo)入液體的空隙部10。該 空隙部成為副槽10。所述副槽部100內(nèi)，在所述副槽10的側(cè)面即基板IOla上，在縱向 上形成與所述副槽10的內(nèi)部連通的3個(gè)貫通孔。所述3個(gè)貫通孔中，正中的貫通孔22b 與鄰接的所述主槽部90的貫通孔22a連接。由此，連通所述主槽部90內(nèi)部和所述副槽 部100內(nèi)部。另外，本例白細(xì)胞分析裝置88中，所述副槽部100的貫通孔22b與所述主 槽部90的貫通孔22a的連接部分成為微孔14。所述3個(gè)貫通孔中，上方的貫通孔21a以 及下方的貫通孔21b分別成為導(dǎo)入口 21a以及導(dǎo)入口 21b。抽吸管(未圖示)的一端與所 述導(dǎo)入口 21a連接，所述抽吸管的另一端與所述注射筒(未圖示)連接。另外，所述導(dǎo) 入口 21a和21b可以能夠開(kāi)關(guān)，也可以與用于將導(dǎo)入到所述副槽部100內(nèi)的溶液排出的溶 液槽連接。所述空隙部10中，從所述導(dǎo)入口 21a連通所述貫通孔22b的空隙部分例如可 以作為定量部15使用。所述副槽10內(nèi)配置有電極13。所述電極13通過(guò)電線連接到所 述電壓器(未圖示)。圖8表示所述白細(xì)胞分析裝置88的所述微孔14部分的其他例子。圖8是表示 圖7中虛線圍住部分的其他例子的放大圖。如圖8所示，在連通所述主槽部90的貫通孔 22a和所述副槽部100的貫通孔22b的區(qū)域，可以配置具有貫通孔的彈性體840。在這種 情況下，在所述彈性體840上形成的所述貫通孔成為所述微孔84。所述彈性體840的材 質(zhì)沒(méi)有特別限定，例如可列舉出硅橡膠等。所述基板部16由基板161a和基板161b這2個(gè)基板并列重疊而成的兩層體構(gòu)成， 其內(nèi)部具備可以容納液體的空隙部17。該空隙部成為攪拌槽17。所述基板部16中所述 攪拌槽17的側(cè)面即基板161b上，在縱向上形成有連通所述攪拌槽17內(nèi)部的兩個(gè)貫通孔 22d和22e。所述抽吸管19的一端連接于所述貫通孔22d，所述抽吸管19的另一端連接 所述注射筒(未圖示)。所述攪拌管18的一端連接于所述貫通孔22e，所述攪拌管18的 另一端如上所述與所述主槽部90的所述貫通孔22c連接。通過(guò)該攪拌管18連通所述基 板部16和所述主槽部90的內(nèi)部。本例的白細(xì)胞分析裝置88中，作為所述基板91a、91b、101a、101b、161a以及 161b的材質(zhì)沒(méi)有特別限定，例如可列舉出所述的玻璃、聚合物材料等。所述主槽部90的大小沒(méi)有特別限定，例如其高度為3 IOOmm的范圍、其寬度 為3 50mm的范圍、其厚度為3 50mm的范圍。另外，所述主槽9的體積沒(méi)有特別 限定，例如為10 5000 μ L的范圍，優(yōu)選為100 1000 μ L。所述副槽部100的大小沒(méi)有特別限定，例如其高度為10 200mm的范圍、其寬度為3 50mm的范圍、其厚度為3 50mm的范圍。另外，所述副槽10的體積沒(méi)有 特別限定，例如為10 5000 μ L的范圍，優(yōu)選為100 1000 μ L。另外，從所述貫通孔 22b至所述導(dǎo)入口 21a的空隙部，可以作為定量部15，在這種情況下，所述定量部15，優(yōu) 選設(shè)定為適于定量的所期望的體積。所述基板部16的大小沒(méi)有特別限定，例如其高度為3 200mm的范圍、其寬度 為3 50mm的范圍、其厚度為3 50mm的范圍。另外，所述攪拌槽17的體積沒(méi)有特 別限定，例如優(yōu)選為100 1000 μ L。所述微孔14的大小例如直徑為1 500 μ m的范圍、長(zhǎng)度為1 200 μ m的范 圍，優(yōu)選直徑為10 200 μ m的范圍、長(zhǎng)度為10 IOOym的范圍。另外，所述直徑例 如為垂直于所述微孔14的貫通方向的截面的直徑，所述長(zhǎng)度為所述微孔14部分中的所述 基板91b和所述基板IOla厚度的總和。另外，例如圖8中微孔84的大小也相同。所述導(dǎo)入口 21a和21b的直徑，例如為0.1 2mm的范圍，優(yōu)選為0.5 Imm 的范圍。所述貫通孔22c、22d和22e的直徑，例如為0.1 2mm的范圍，優(yōu)選為0.5 Imm的范圍。作為所述攪拌管18和所述抽吸管19的材質(zhì)沒(méi)有特別限定，例如可以使用不銹鋼 等。作為所述不銹鋼沒(méi)有特別限定，例如可列舉出SUS等。所述攪拌管18和抽吸管19 的形狀沒(méi)有特別限定，例如為圓筒狀。在為所述圓筒狀時(shí)，所述攪拌管和所述抽吸管的 內(nèi)徑，例如為1 500 μ m的范圍，優(yōu)選為10 200 μ m的范圍。所述攪拌管和所述抽 吸管的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限定，例如為1 500mm的范圍，優(yōu)選為10 200mm的范圍。本例白細(xì)胞分析裝置88的制造方法沒(méi)有特別限定，例如可以適當(dāng)?shù)厥褂媚壳肮?知的方法。接下來(lái)，針對(duì)使用所述白細(xì)胞分析裝置88的本例白細(xì)胞分析方法進(jìn)行說(shuō)明。首先，用生理鹽水稀釋人類全血以配制所述試樣。使用注射筒(未圖示)從所 述導(dǎo)入口 21b導(dǎo)入生理鹽水并填充至所述副槽10內(nèi)的所述電極13的上部，關(guān)閉所述導(dǎo)入 口 21b。將所述試樣注入到所述主槽9。通過(guò)連接于所述抽吸管19的所述注射筒(未圖 示)，對(duì)連通于所述主槽9的各槽和管減壓(抽吸)。由此，將所述主槽9內(nèi)的所述試樣 導(dǎo)入到所述攪拌槽17。接下來(lái)，在所述主槽9中注入本發(fā)明的分析試劑。通過(guò)所述注射 筒對(duì)連通于所述主槽9的槽和管加壓(噴出)。由此，使所述攪拌槽17內(nèi)的所述試樣再 次導(dǎo)入到所述主槽9內(nèi)。進(jìn)而，通過(guò)所述注射筒對(duì)連通于所述主槽9的槽和管交替反復(fù) 進(jìn)行減壓以及加壓。由此，混合所述試樣和所述分析試劑?；旌贤瓿珊螅谒鲋鞑? 內(nèi)靜置所述試樣與所述分析試劑的混合液。在所述電極12和13間施加電壓，通過(guò)連接 于所述導(dǎo)入口 21a的注射筒(未圖示)抽吸，對(duì)所述副槽10和所述主槽9減壓。由此， 使所述混合液通過(guò)所述微孔14從所述主槽9向所述副槽10移動(dòng)。使用分析部(未圖示) 測(cè)定所述試樣通過(guò)所述微孔14時(shí)產(chǎn)生的脈沖(電阻變化)。與實(shí)施例1同樣地制作直方 圖，對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分類以及計(jì)數(shù)，算出所分類的白細(xì)胞的比率。另外，在所述副槽部100 的所述空隙部10中，將從所述貫通孔22b到所述導(dǎo)入口 21a的空隙部作為定量部15時(shí)， 例如可以對(duì)從所述主槽部90通過(guò)的所述混合液進(jìn)行定量。實(shí)施例接下來(lái)結(jié)合比較例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。但是，本發(fā)明并不限于以下的
副槽10
實(shí)施例。(實(shí)施例1)本例中，使用血細(xì)胞比容值為31.4%的人類全血作為試樣，按照以下的步驟測(cè) 定白細(xì)胞。另外，本例的白細(xì)胞的測(cè)定中，使用所述的圖2所示的白細(xì)胞分析裝置8。 在所述白細(xì)胞分析裝置8中所述微孔14為直徑50 μ m、長(zhǎng)度60 μ m的貫通孔。首先，配制如下表1所示組成的分析試劑。另外，使用氯化鈉將所述分析試劑 的電導(dǎo)率調(diào)整為11.33mS/cm。(表1)分析試劑
權(quán)利要求
1.一種白細(xì)胞的分析方法，其特征在于，其是包括如下工序的白細(xì)胞的分析方法 混合工序，將包含白細(xì)胞和紅細(xì)胞的試樣以及包含與白細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑的分析試劑混合；以及測(cè)定工序，使所述試樣與所述分析試劑的混合液通過(guò)微孔，測(cè)定在所述通過(guò)時(shí)檢出 的信號(hào)，對(duì)所述試樣中的白細(xì)胞進(jìn)行分類以及計(jì)數(shù)； 其中，所述分析試劑進(jìn)一步包含非離子表面活性劑， 所述非離子表面活性劑具有作為親水部的糖殘基和作為疏水部的脂肪鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞的分析方法，所述糖殘基為二糖的殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞的分析方法，所述脂肪鏈為脂肪酸殘基或烷基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞的分析方法，所述非離子表面活性劑為選自由蔗糖 單月桂酸酯、蔗糖月桂酸酯、蔗糖單癸酸酯以及十二烷基麥芽糖苷構(gòu)成的組中的至少一 種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞的分析方法，所述試樣與所述分析試劑的所述混合液 中的所述非離子表面活性劑的濃度為0.001 范圍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞的分析方法，所述與白細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑為季銨 鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞的分析方法，所述試樣與所述分析試劑的所述混合液 中的、所述與白細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑的濃度為0.01 范圍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞的分析方法，所述分析試劑進(jìn)一步包含與紅細(xì)胞反應(yīng) 的表面活性劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的白細(xì)胞的分析方法，所述與紅細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑為皂角苷。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的白細(xì)胞的分析方法，所述試樣與所述分析試劑的所述混合 液中的所述皂角苷的濃度為0.05 范圍。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞的分析方法，所述混合工序中，所述試樣(X)與所 述分析試劑(Y)的混合體積比(X Y)為1 0.4 1 99的范圍。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞的分析方法，所述測(cè)定工序中，所述白細(xì)胞按照其 體積分類為3種。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，所述測(cè)定工序中， 使用具有所述微孔的測(cè)試盒，使所述混合液通過(guò)所述測(cè)試盒內(nèi)的所述微孔。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分析方法，所述測(cè)試盒為微全分析系統(tǒng)。
15.—種分析試劑，其特征在于，該分析試劑為用于權(quán)利要求1所述的分析方法的、 包含與白細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑的分析試劑，其進(jìn)一步包含非離子表面活性劑，所述非離子表面活性劑具有作為親水部的糖殘基和作為疏水部的脂肪鏈。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分析試劑，所述糖殘基為二糖。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分析試劑，所述脂肪鏈為脂肪酸殘基或烷基。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分析試劑，所述非離子表面活性劑為選自由蔗糖單月桂酸酯、蔗糖月桂酸酯、蔗糖單癸酸酯以及十二烷基麥芽糖苷構(gòu)成的組中的至少一種。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分析試劑，所述與白細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑為季銨鹽。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分析試劑，所述分析試劑進(jìn)一步包含與紅細(xì)胞反應(yīng)的表面 活性劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的分析試劑，所述與紅細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑為皂角苷。
全文摘要
提供一種白細(xì)胞的分析方法及其使用的分析試劑，該方法即使在含有白細(xì)胞試樣的稀釋率低的情況下，或者在分析時(shí)的流速慢的情況下，也可以穩(wěn)定地以高精度進(jìn)行白細(xì)胞的分類以及計(jì)數(shù)。本發(fā)明的分析方法的特征在于，其是包括如下工序的白細(xì)胞分析方法混合工序，將包含白細(xì)胞和紅細(xì)胞的試樣以及包含與白細(xì)胞反應(yīng)的表面活性劑的分析試劑混合；以及測(cè)定工序，使所述試樣與所述分析試劑的混合液通過(guò)微孔，并測(cè)定在所述通過(guò)時(shí)檢出的信號(hào)，對(duì)所述試樣中的白細(xì)胞進(jìn)行分類以及計(jì)數(shù)；其中，所述分析試劑進(jìn)一步包含非離子表面活性劑，所述非離子表面活性劑具有作為親水部的糖殘基和作為疏水部的脂肪鏈。
文檔編號(hào)G01N33/49GK102016576SQ20098011555
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月2日
發(fā)明者福家博司, 高木英紀(jì) 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社