Y染色體azf區(qū)微缺失檢測(cè)引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用gDNA或外周血游離DNA檢測(cè)男性Y 染色體AZF區(qū)微缺失的引物系統(tǒng)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 有研究報(bào)告指出，不育夫婦占已婚育齡夫婦的15%，其中男性因素約占一半，而男 性不育癥35%是由于遺傳因素造成。Y染色體微缺失是除克式綜合征外男性不育的最主要 遺傳因素。Y染色體大量的重復(fù)序列和回文結(jié)構(gòu)在維持Y染色體進(jìn)化穩(wěn)定性的同時(shí)，也使Y 染色體更容易發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，導(dǎo)致染色體部分缺失或重復(fù)。Y染色體微缺失主要發(fā)生在Y染 色體上的AZF(azoospermia factor)區(qū)。AZF區(qū)包括AZFa、AZFb、AZFc三個(gè)亞區(qū)，這些位置 包括許多與精子形成有關(guān)的基因，這些區(qū)域的完全缺失或部分缺失可引起男性精子發(fā)生障 礙、少精、弱精甚至無精癥狀。
[0003] 檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失現(xiàn)在已經(jīng)成為男性不育?？频某Ｒ?guī)檢查，可以為男性 不育患者找出病因，為遺傳咨詢提供依據(jù)；也為臨床醫(yī)生的診斷與后續(xù)治療提供指導(dǎo)。所以 一種簡單快速、準(zhǔn)確度高且低成本的檢測(cè)方法對(duì)臨床具有重大意義。
[0004] 目前檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的方法有很多，例如多重PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、 芯片雜交、MLPA等技術(shù)，最常用的是使用多重PCR擴(kuò)增序列標(biāo)簽位點(diǎn)（Sequence Tagged Site, STS)。該方法選擇AZFa、AZFb、AZFc區(qū)的STS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 電泳，根據(jù)條帶的有無判斷AZF各區(qū)是否發(fā)生缺失。歐洲男科協(xié)會(huì)（European Academy of Andrology，EAA)和歐洲分子遺傳質(zhì)控網(wǎng)（European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)聯(lián)合發(fā)布的《Y染色體微缺失分子診斷實(shí)踐指南》推薦了多重PCR檢測(cè)Y染 色體厶2卩區(qū)微缺失的6個(gè)5了5仏2卩3:8￥84,8丫86 42卩13:8￥127,8￥134 42卩。：8￥254,8￥255)。 在此基礎(chǔ)上，各個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室可選擇性地增加 STS的數(shù)量進(jìn)行更精確的檢測(cè)。這種方法簡 單易行，目前使用最廣泛。但是這種方法擴(kuò)增的STS位點(diǎn)較少（6個(gè)或以上），而且電泳只能 定性檢測(cè)目的產(chǎn)物是否存在，不能檢測(cè)拷貝數(shù)的變化，這對(duì)于Y染色體AZF區(qū)部分缺失的情 況可能檢測(cè)不精確，所以這種方法在檢測(cè)準(zhǔn)確度和靈敏度上還有待提高。其中一個(gè)方法是 增加檢測(cè)的STS數(shù)量，但這需要進(jìn)行多次多重PCR反應(yīng)，從而大大增加實(shí)驗(yàn)工作量和檢測(cè)成 本。
[0005] 檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失還可以使用多重實(shí)時(shí)熒光PCR，這種方法簡便快速更準(zhǔn) 確，但是探針設(shè)計(jì)繁瑣并且需要報(bào)告基團(tuán)修飾，價(jià)格昂貴，不適合臨床推廣使用。
[0006] 有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)采用芯片雜交技術(shù)檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失，相比于多重PCR技術(shù)， 可以極大地提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度。但缺點(diǎn)是該方法需要設(shè)計(jì)大量的探針，成本較高， 另外檢測(cè)信號(hào)分析也較為復(fù)雜，不適合臨床醫(yī)生判讀。
[0007] MRC-Holland 公司推出一款 SALSA MLPA probe-mix kit Ρ360-Α1 試劑盒，用于 Y 染色體AZF區(qū)微缺失的檢測(cè)，通過雜交、連接手段獲取探針相對(duì)拷貝數(shù)信號(hào)，并根據(jù)產(chǎn)物長 度識(shí)別對(duì)應(yīng)探針，最終通過探針信號(hào)給出檢測(cè)結(jié)論。該技術(shù)手段與芯片雜交技術(shù)一樣，面臨 著檢測(cè)信號(hào)分析復(fù)雜的缺陷，另外由于需要根據(jù)產(chǎn)物長度識(shí)別探針，在探針設(shè)計(jì)和識(shí)別上 有著一定的局限性。
[0008] 綜上所述，目前Y染色體AZF區(qū)微缺失的檢測(cè)方法存在的缺陷主要有準(zhǔn)確度和靈 敏度低、成本高、檢測(cè)結(jié)果判讀復(fù)雜等。因此亟需開發(fā)一種Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測(cè)的新 方法，來解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種采用gDNA或外周血游離DNA檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺 失的引物系統(tǒng)、檢測(cè)試劑、試劑盒和檢測(cè)方法，以克服上述現(xiàn)有技術(shù)方法所存在的不足。
[0010] 本發(fā)明的第一方面提供了一種檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的引物組合物，其引物 位點(diǎn)包括至少6個(gè)Y染色體AZF區(qū)位點(diǎn)，以及至少一個(gè)Y染色體其他特異性區(qū)域的內(nèi)參位 點(diǎn)。其中，根據(jù)每個(gè)引物位點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)上、中、下游三條引物，每條引物長10~50bp，優(yōu)選 為20bp ;每個(gè)引物位點(diǎn)的所述上、中、下游三條引物在參考基因組序列上自5'到3'方向是 連續(xù)的。所述參考基因組序列為hgl8或hgl9版本。
[0011] 優(yōu)選地，所述引物的GC含量均為30 %~70%，更優(yōu)選50 %。
[0012] 優(yōu)選地，每個(gè)引物位點(diǎn)的所述中游和下游引物的5'端分別進(jìn)行磷酸化修飾。
[0013] 優(yōu)選地，每個(gè)引物位點(diǎn)的所述上游引物的5'端延伸15~30bp的保護(hù)序列，更優(yōu) 選為20bp。
[0014] 優(yōu)選地，每個(gè)引物位點(diǎn)的所述上游引物的5'端和下游引物的3'端分別延伸通用 擴(kuò)增引物序列。
[0015] 本發(fā)明的引物系統(tǒng)的引物位點(diǎn)按照AZF區(qū)可劃分到AZFa、AZFb及AZFc區(qū)的bl、 匕2、匕3、匕4、81、82、83、1'1、12、13、14、71、5^2等不同的亞區(qū)（如圖2所示）。其中13、8、1'等 亞區(qū)是本發(fā)明用來判定AZFc區(qū)詳細(xì)缺失信息的重要參考區(qū)域。
[0016] 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，針對(duì)Y染色體AZF區(qū)域和其他作為內(nèi)部參考的特異性 區(qū)域（包括SRY基因、ZFY基因和TBLlY基因等）選定的148個(gè)引物位點(diǎn)，共設(shè)計(jì)了 148組 引物序列。這些引物序列的特點(diǎn)為：（1)每組引物均是以基因組上一段序列為模板來設(shè)計(jì) 三條連續(xù)的引物，這三條引物連接后形成PCR模板；（2)在正常人染色體目標(biāo)區(qū)域，引物位 點(diǎn)序列存在已知且不變的拷貝數(shù)，且在目標(biāo)區(qū)域之外的其他染色體區(qū)域不存在該序列；（3) 這些序列引物具有接近的退火溫度，波動(dòng)范圍<5°C ; (4)與通用擴(kuò)增引物序列不存在互補(bǔ) 性；（5)內(nèi)參位點(diǎn)僅在目標(biāo)區(qū)域唯一出現(xiàn)，在基因組其他區(qū)域不存在該位點(diǎn)。
[0017] 所述引物位點(diǎn)的上、中、下游三條引物的序列分別選自SEQ ID N0:n、SEQ ID NO: (n+148)、SEQ ID NO: (n+296)，其中 η 為 1 ~148 的自然數(shù)。
[0018] 最優(yōu)實(shí)施方式中，所述引物組合物包括序列分別為SEQ ID N0:l-444的全部引物。
[0019] 本發(fā)明的第二方面提供了上述引物組合物組合物的用途。
[0020] 上述引物組合物可用于制備用于檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的診斷試劑或試劑 盒。
[0021] 上述引物組合物可用于體外檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失。所述檢測(cè)可以是診斷目 的（例如診斷男性不育等），也可以是非診斷目的（例如實(shí)驗(yàn)室研究等）。
[0022] 本發(fā)明的第三部分提供了一種檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的檢測(cè)試劑，其包括上 述引物組合物。
[0023] 本發(fā)明的第四部分提供了一種檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的試劑盒，其包括上述 引物組合物。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括DNA提取試劑、通用PCR引物、DNA聚合酶、DNA連 接酶、末端轉(zhuǎn)移酶、dNTPs、反應(yīng)緩沖液、用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物的磁珠及緩沖液；更優(yōu)選地， 還包括陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品；最優(yōu)選地，還包括用于高通量測(cè)序的試劑。所述的高通量 測(cè)序方法選自 Ion Torrent 的 PGM、Proton 或 Illumina 的 Hiseq、Miseq0
[0024] 本發(fā)明的第五方面提供了一種體外檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的方法，其特征在 于，包括以下步驟：
[0025] (1)提取gDNA或外周血游離DNA作為模板；
[0026] (2)將本發(fā)明的引物組合物與DNA模板進(jìn)行雜交反應(yīng)；
[0027] (3)雜交產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)；
[0028] (4)將連接產(chǎn)物進(jìn)行純化；
[0029] (5)將純化后的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建文庫；
[0030] (6)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序；
[0031] (7)測(cè)序數(shù)據(jù)分析。
[0032] 優(yōu)選地，包括以下步驟：
[0033] (1)分離、提取待檢測(cè)樣本的組織細(xì)胞gDNA或外周血的游離DNA片段；
[0034] (2)將樣本DNA模板末端采用生物素標(biāo)記，標(biāo)記后的DNA模板和磁珠結(jié)合；
[0035] (3)將權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)中定義的引物組合物與DNA模板進(jìn)行雜交、連接反應(yīng)， 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)成文庫；
[0036] (4)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序；
[0037] (5)數(shù)據(jù)分析：將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域的定位，即與用來設(shè)計(jì)引物的參考基因 組序列片段進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果計(jì)算每個(gè)目標(biāo)區(qū)域的測(cè)序序列條數(shù)，根據(jù)目標(biāo)區(qū)域的 測(cè)序序列條數(shù)計(jì)算AZF區(qū)各小區(qū)域的拷貝數(shù)信息，通過與正常人理論值比較分析拷貝數(shù)的 變化，從而判定AZF區(qū)微缺失檢測(cè)信息。
[0038] 檢測(cè)結(jié)論的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0039] (1)若AZFa區(qū)所有或部分位點(diǎn)拷貝數(shù)為0,其余區(qū)域位點(diǎn)拷貝數(shù)不變，則檢測(cè)結(jié)論 為AZFa區(qū)缺失或部分缺失；
[0040] (2)若AZFb區(qū)的y3、y4、b5、b6和/或Ul亞區(qū)位點(diǎn)拷貝數(shù)變?yōu)?或部分拷貝數(shù)發(fā) 生變化，AZFa區(qū)及AZFc區(qū)位點(diǎn)拷貝數(shù)不變，則檢測(cè)結(jié)論根據(jù)變化信息相應(yīng)為AZFb區(qū)缺失 或部分缺失；
[0041] (3)若gl、g2、g3區(qū)位點(diǎn)拷貝數(shù)減少1/3~2/3，rl、r2、r3、r4區(qū)位點(diǎn)拷貝數(shù)減少 1/2以上，bl、b2、b3、b4區(qū)位點(diǎn)拷貝數(shù)減少l/4，yl、y2區(qū)位點(diǎn)拷貝數(shù)減少1/2,其余區(qū)域位 點(diǎn)拷貝數(shù)不變，則檢測(cè)結(jié)論為gr/gr缺失；
[0042] (4)若 bl、b2、b3、b4 區(qū)位點(diǎn)拷貝數(shù)減少 1/2 左右，gl、g2、g3、rl、r2、r3、r4、yl、 y2、tl、t2區(qū)位點(diǎn)拷貝數(shù)為0,其余區(qū)域位點(diǎn)拷貝數(shù)不變，則檢測(cè)結(jié)論為b2/b4缺失，亦稱作 AZFc區(qū)缺失；
[0043] (5)若同時(shí)存在⑵與⑷的拷貝數(shù)變化信息，則檢測(cè)結(jié)論為AZFb+c區(qū)缺失，具體 缺失的亞區(qū)區(qū)域可根據(jù)位點(diǎn)拷貝數(shù)變化來判定。
[0044] 所述檢測(cè)可以是診斷目的（例如診斷男性不育等），也可以是非診斷目的（例如實(shí)