專利名稱：Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，特別是涉及Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物、該檢測方法以及檢測用試劑盒。
背景技術(shù)：
約15%育齡夫婦存在生育障礙，其中男性因素引起的生育障礙約占一半。在已知的導(dǎo)致男性不育的遺傳學(xué)因素中，發(fā)病率最高的兩種是Y染色體的微缺失和克氏綜合癥，在無精癥或少精癥患者中發(fā)病率在10-15%。Y染色體具有大量重復(fù)序列和回文結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)在維持Y染色體進(jìn)化穩(wěn)定性的同時也使回文結(jié)構(gòu)內(nèi)部基因易于丟失，進(jìn)而導(dǎo)致不育。缺失率最高的三個影響精子發(fā)生的區(qū)域被命名為AZFa，AZFb和AZFc，它們之中任何一個出現(xiàn)缺失都有可能導(dǎo)致不育癥。除AZF·各區(qū)的完全缺失外，還存在發(fā)生率很高的AZFb和/或AZFc區(qū)部分缺失或復(fù)制。近年研究工作表明，其中部分類型的缺失或復(fù)制與男性不育相關(guān)，如gl/g3 (b2/b3)缺失或gr/gr復(fù)制與漢人種不育相關(guān)。Y染色體微缺失檢測已成為男性不育患者的常規(guī)檢查項目。隨著輔助生殖技術(shù)的進(jìn)展，卵細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射(ICSI)技術(shù)和其他人工輔助生殖治療時也要求對Y染色體微缺失進(jìn)行檢測，以避免將缺陷遺傳給下一代及避免無謂的治療。目前檢測Y微缺失的方法有多種，包括核型分析、FISH、芯片、多重PCR等方法，其中使用最為廣泛的是多重PCR聯(lián)合瓊脂糖電泳檢測的方法。該方法是在PCR反應(yīng)體系中同時加入3-5對引物，在同一反應(yīng)體系中一次實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增多個區(qū)域片段DNA的基因擴(kuò)增，通過瓊脂糖電泳檢測有無目的產(chǎn)物以判斷是否存在微缺失。國內(nèi)外眾多產(chǎn)品或?qū)＠际腔诖朔椒ㄩ_發(fā)出來的(200410043918，Y染色體細(xì)微缺失診斷試劑和對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法；200910094618. 8，一種Y染色體微缺失的基因檢測方法)。目前采用的方法的主要缺點(diǎn)在于①，檢測一個樣品需要多個PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢測成本高、操作強(qiáng)度大。由于采用瓊脂糖電泳檢測，方法分辨率和靈敏度限制，每一個擴(kuò)增反應(yīng)中難以同時進(jìn)行更大量位點(diǎn)擴(kuò)增，目前市場上產(chǎn)品和相關(guān)專利中每個擴(kuò)增反應(yīng)只擴(kuò)增4-5個位點(diǎn)。所以，即使只檢測EAA/EMQN標(biāo)準(zhǔn)的位點(diǎn)也需要2個擴(kuò)增反應(yīng)，而且隨著檢測位點(diǎn)的增加會需要更多的擴(kuò)增反應(yīng)(如亞能試劑盒需要4個反應(yīng)，Promega試劑盒檢測一個樣本需要5個擴(kuò)增反應(yīng)和5個檢測)，這就大大增加了操作強(qiáng)度和檢測成本，對于大規(guī)模樣本篩查來說，工作量非常龐大。②，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳檢測，檢測效率低、靈敏度低、錯誤率高。瓊脂糖電泳需要大量人工操作，從制膠到點(diǎn)樣、電泳和讀取信號需要1-2小時，不便于大量樣本檢測；而且瓊脂糖電泳檢測靈敏度低，產(chǎn)物量較少的時候條帶不容易判別，難以區(qū)分弱陽性與陰性，容易造成假陽性或假陰性；如果電泳條件不穩(wěn)定或操作不當(dāng)容易造成樣本混淆，得出錯誤判斷。③，不能檢測部分缺失和復(fù)制。區(qū)分Y染色體AZF區(qū)域的部分缺失和復(fù)制是有重大應(yīng)用意義的。一方面，部分缺失或復(fù)制在人群中發(fā)生比例很高。據(jù)文獻(xiàn)和我們的數(shù)據(jù)，幾種常見部分缺失或復(fù)制的在無精癥少精癥患者中的比例超過10%，而能被多重定性PCR技術(shù)有效檢測的AZF各區(qū)完全缺失，公認(rèn)的比例也只有10%左右。另一方面，近年研究工作表明一些常見部分缺失或復(fù)制和育性及染色體遺傳穩(wěn)定性直接相關(guān)，如gl/g3 (b2/b4)缺失或gr/gr復(fù)制與漢人種不育相關(guān)。但是，由于部分缺失和復(fù)制高發(fā)的AZFb/c區(qū)序列由高度一致的回文結(jié)構(gòu)組成，難以選擇單拷貝的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測；同時，由于多重定性PCR技術(shù)只能檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的有或者無，無法通過定量檢測區(qū)分染色體上重復(fù)DNA片段部分缺失和復(fù)制。因此多重定性PCR技術(shù)難以檢測部分缺失和復(fù)制，會將部分缺失和復(fù)制誤判為正常，影響后續(xù)診療或相關(guān)處 理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物，在高度復(fù)合的擴(kuò)增體系中可以擴(kuò)增多至30個與Y染色體微缺失檢測相關(guān)的位點(diǎn)，且通過重定量熒光PCR(QF-PCR)技術(shù)擴(kuò)增Y染色體微缺失檢測相關(guān)的位點(diǎn)，并根據(jù)有無擴(kuò)增產(chǎn)物及擴(kuò)增產(chǎn)物劑量確定是否存在Y染色體微缺失異常。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種Y染色體微缺失檢測試劑盒。該試劑盒利用多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增體系，通過該試劑盒可實(shí)現(xiàn)僅以一個擴(kuò)增檢測反應(yīng)完成對樣品Y染色體微缺失進(jìn)行簡便、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、精細(xì)、聞效地檢測。Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物，其特征在于所述擴(kuò)增組合物中包括8對引物，可同時擴(kuò)增8個與Y染色體微缺失檢測相關(guān)的位點(diǎn)所述擴(kuò)增的位點(diǎn)包括sY86、sY84、sY127、sY134、sY254、sY255、SRY和 ZFX/ZFY 位占.特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa區(qū)sY86位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 3和SEQIDNo. 4 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa區(qū)sY84位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 5和SEQIDNo. 6 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)SY127位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 21和SEQ IDNo. 22 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)SY134位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 29和SEQ IDNo. 30 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)SY254位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 43和SEQ IDNo. 44 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)SY255位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 45和SEQ IDNo. 46 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體短臂SRY位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 53和SEQ IDNo. 54所示；特異性擴(kuò)增ZFX/ZFY的引物，其中ZFY位于Y染色體短臂和ZFX位于X染色體，其堿基序列如SEQ ID No. 55和SEQ ID No. 56所示。所述引物可被分組，同一組中每個位點(diǎn)對應(yīng)的一條引物的5’末端帶有相同顏色的熒光標(biāo)記物，不同組對應(yīng)的熒光標(biāo)記物顏色不同。其中一種優(yōu)選 方案是，將引物分為兩組，第一組為 sY86、sY127、sY255、SRY,第二組為 sY84、sY134、sY254、ZFX/ZFY。其中一種優(yōu)選方案是,第一組采用FAM或FL(fluorescein)標(biāo)記；第二組采用HEX、VIC或JOE標(biāo)記。所述擴(kuò)增組合物還可在上述8對引物基礎(chǔ)上再增加7對引物，能同時擴(kuò)增另外10個與Y染色體微缺失檢測相關(guān)的位點(diǎn)。所述的另外9 個位點(diǎn)包括sY81、sY1161、sY157、sY1191、SMCX/SMCY、DAZ、DAZL、CDYl和CDY2位點(diǎn)；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa區(qū)sY81位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. I和SEQIDNo. 2 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)SY1161位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 33和SEQID No. 34 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)SY157位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 51和SEQ IDNo. 52 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)SY1191位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 37和SEQID No. 38 所示；特異性擴(kuò)增SMCX/SMCY的引物，其中SMCY位于Y染色體短臂和SMCX位于X染色體，其堿基序列如SEQ ID No. 17和SEQ ID No. 18所示。特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)DAZ位點(diǎn)和3號染色體DAZL位點(diǎn)的引物，其堿基序列如 SEQ ID No. 47 和 SEQ ID No. 48 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)⑶Y2位點(diǎn)和AZFc區(qū)⑶Yl位點(diǎn)的引物，其堿基序列如 SEQ ID No. 13 和 SEQ ID No. 14 所示。所述引物可被分組，同一組中每個位點(diǎn)對應(yīng)的一條引物的5’末端帶有相同顏色的熒光標(biāo)記物，不同組對應(yīng)的熒光標(biāo)記物顏色不同。其中一種優(yōu)選方案是，將引物分為三組，第一組為 sY81、sY86、SMCX/SMCY、sY127、sY1161、sY255、sY157、SRY 和 sY1191，第二組為sY84、sY134、sY254、CDYl、CDY2、ZFX/ZFY，第三組為 DAZ、DAZL。其中一種優(yōu)選方案是,第一組采用FAM或FL(Fluorescein)標(biāo)記；第二組采用HEX、VIC或JOE標(biāo)記；第三組采用TAMRA或NED標(biāo)記。所述擴(kuò)增組合物還可在上述15對引物基礎(chǔ)上再增加13對引物，能同時擴(kuò)增另外13個與Y染色體微缺失檢測相關(guān)的位點(diǎn)。所述另外13 個位點(diǎn)為USP9Y、DBY、KAL-Y, sY117、sY124、elFlAY、sY128、sY130、sY627、sY145、BPY2、sY242 和 sY1291 位點(diǎn)；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa區(qū)USP9Y位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 7和SEQ IDNo. 8 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa區(qū)DBY位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 9和SEQIDNo. 10 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體位于AZFa和AZFb區(qū)之間KAL-Y位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQID No. 11 和 SEQ ID No. 12 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)SY117位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 15和SEQ IDNo. 16 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)SY124位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 19和SEQ IDNo. 20 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)elFlAY位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 23和SEQID No. 24 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)SY128位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 25和SEQ IDNo. 26 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)SY130位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 27和SEQ IDNo. 28 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)SY627位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 31和SEQ IDNo. 32 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)SY145位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 35和SEQ IDNo. 36 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)BPY2位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 39和SEQ IDNo. 40 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)SY242位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 41和SEQ IDNo. 42 所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)SY1291位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 49和SEQID No. 50 所示。所述引物可被分組，同一組中每個位點(diǎn)對應(yīng)的一條引物的5’末端帶有相同顏色的熒光標(biāo)記物，不同組對應(yīng)的熒光標(biāo)記物顏色不同。其中一種優(yōu)選方案是，將引物分為三組，sY81、sY86、USP9Y、SMCX/SMCY、sY127、elFlAY、sY128、sY130、sY1161、sY255、sY157、SRY、sY1191 和 sY1291，第二組為 sY84、DBY、sY124、sY134、BPY2、CDYl、CDY 2、sY242、sY254、KAL-Y、ZFX/ZFY，第三組為 sY117、sY627、sY 145、DAZ、DAZL。其中一種優(yōu)選方案是,第一組采用FAM或FL(fluorescein)標(biāo)記；第二組采用HEX、VIC或JOE標(biāo)記；第三組采用TAMRA或NED標(biāo)記。所述擴(kuò)增組合物還包括I X PCR反應(yīng)緩沖液，dNTP (2. 5mM/各組分)，5 IOng模板DNA, 5U/ μ I Taq 酶。Y染色體微缺失檢測試劑盒，包括上述擴(kuò)增組合物。所述檢測試劑盒還包括PCR反應(yīng)緩沖液，dNTP (2. 5mM/各組分)和5單位/ μ I Taq酶。所述檢測試劑盒還包括一個女性對照和男性陽性對照DNA，所述女性對照包所述女性對照DNA為濃度5 IOng正常女性DNA，；所述陽性對照DNA為濃度5 IOng正常男性DNA。本發(fā)明的擴(kuò)增組合物中，在一個擴(kuò)增體系中含有8對特異性擴(kuò)增引物，能擴(kuò)增出8個位點(diǎn)，根據(jù)這8個位點(diǎn)可以判定各AZF區(qū)是否存在缺失，以此判定男性不育的原因。優(yōu)選在一個擴(kuò)增體系中含有15對特異性擴(kuò)增引物，能擴(kuò)增出17個基因位點(diǎn)，根據(jù)這17個位點(diǎn)可以更準(zhǔn)確的判定各AZF區(qū)是否存在缺失，并可檢測是否存在常見的AZF區(qū)部分缺失或復(fù)制，還能對克氏綜合癥作出判定。本發(fā)明還提供一種更優(yōu)的方案，擴(kuò)增體系中含有28對特異性引物，能擴(kuò)增出30個基因位點(diǎn)，更準(zhǔn)確的判定各AZF區(qū)是否存在缺失、檢測是否存在常見的AZF區(qū)部分缺失或復(fù)制、對克氏綜合癥作出判定的同時，進(jìn)一步精細(xì)區(qū)分缺失類型、提高檢測結(jié)果可信度。在每一對引物中的一條引物的5’末端帶有指定的突光標(biāo)記物，以適于毛細(xì)管電泳檢測，以方便定量判定。Y染色體微缺失檢測試劑盒，利用所述多重PCR擴(kuò)增體系，通過多重?zé)晒舛縋CR 擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測的技術(shù)路線，以一個擴(kuò)增檢測反應(yīng)完成對樣品Y染色體微缺失進(jìn)行檢測。所述檢測試劑盒包括各引物，以及所述多重PCR擴(kuò)增體系中的其他成分(除模板DNA) ο本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點(diǎn)如下( I)采用更多位點(diǎn)，結(jié)果更可靠。位點(diǎn)涵蓋了 EAA/EMQN標(biāo)準(zhǔn)建議的全部STS位點(diǎn)和對照位點(diǎn)，包含目前對Y染色體微缺失研究與檢測中所廣泛使用的大部分位點(diǎn)，同時包含了 AZF各區(qū)的重要基因。大量的位點(diǎn)數(shù)量使檢測結(jié)果更可信，為確定缺失類型提供更多、更細(xì)致的信息，而且使得檢測結(jié)果與其他研究和檢測結(jié)果具備可比性。(2)檢測靈敏度高，且可以實(shí)現(xiàn)定量檢測部分缺失和重復(fù)。使用測序儀通過毛細(xì)管電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，毛細(xì)管電泳結(jié)合使用熒光染料大幅提高了檢測靈敏度，比瓊脂糖電泳檢測靈敏度高100倍以上。能更靈敏地檢測到陽性擴(kuò)增產(chǎn)物，并且明確區(qū)分?jǐn)U增陽性和陰性，避免假陽性和假陰性。還可通過產(chǎn)物峰面積定量衡量擴(kuò)增產(chǎn)物量，進(jìn)而比較出事樣本中不同位點(diǎn)拷貝數(shù)。這使得檢測部分缺失和復(fù)制成為可能。(3)操作更加便捷、簡單，本專利利用一個多重復(fù)合PCR擴(kuò)增體系，以28對引物對超過30個位點(diǎn)同時擴(kuò)增。檢測一個樣本只需要做一個PCR擴(kuò)增和一個測序儀檢測反應(yīng)即可完成，整個過程需要4-5小時，極大降低操作強(qiáng)度和檢測時間。數(shù)據(jù)分析實(shí)現(xiàn)自動化，準(zhǔn)確性更高。所述檢測試劑盒所采用的檢測方法包括以下步驟I，基因組DNA提取通過Chelex法、CTAB法、柱式提取法等常規(guī)方法，對外周血、血痕、口腔拭子、石蠟包埋組織等來源的樣品進(jìn)行提取。5-10ngDNA即可滿足檢測需要。2，多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增所述多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系中包含多至28對引物。每一對引物中的一條引物的5’末端帶有指定的熒光標(biāo)記物。以一個多重PCR反應(yīng)，經(jīng)過PCR循環(huán)擴(kuò)增即可完成對所用待檢位點(diǎn)的擴(kuò)增。3，擴(kuò)增產(chǎn)物檢測擴(kuò)增產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合，使用ABI 3130x1或其他型號測序儀檢測通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測。
4，數(shù)據(jù)分析通過GeneMapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?？梢缘玫诫娪緢D譜，同時也可得到包含各位點(diǎn)分型結(jié)果、各產(chǎn)物峰面積量的量化表格。5，結(jié)果分析通過電泳圖譜和表格可知各樣品各位點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果。首先確認(rèn)同一批次擴(kuò)增的空對照無擴(kuò)增產(chǎn)物峰，正常男性樣本陽性對照成功擴(kuò)增所有位點(diǎn)，所有位點(diǎn)產(chǎn)物峰清晰、相關(guān)位點(diǎn)峰面積比例符合預(yù)期。在對照樣品檢測結(jié)果正常前提下，檢測樣品如果出現(xiàn)一或多個位點(diǎn)產(chǎn)物峰缺失或某些位點(diǎn)峰面積比例顯著偏離正常，則判斷該樣品缺失位點(diǎn)對應(yīng)AZF區(qū)缺失或部分缺失/復(fù)制。具體判斷標(biāo)準(zhǔn)如下表

權(quán)利要求
1.Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物，其特征在于所述擴(kuò)增組合物中包括8對引物，可同時擴(kuò)增Y染色體上8個基因位點(diǎn)和X染色體上的一個基因位點(diǎn)； 所述擴(kuò)增的位點(diǎn)為sY86、sY84、sY127、sY134、sY254、sY255、SRY 和 ZFX/ZFY 基因位點(diǎn)， 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa區(qū)sY86位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 3和SEQIDNo. 4 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa區(qū)sY84位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 5和SEQIDNo. 6 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)sY127位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 21和SEQIDNo. 22 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)sY134位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 29和SEQIDNo. 30 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)sY254位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 43和SEQIDNo. 44 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)sY255位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 45和SEQIDNo. 46 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體短臂SRY位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 53和SEQ IDNo. 54所示； 特異性擴(kuò)增ZFX/ZFY的引物，其中ZFY位于Y染色體短臂和ZFX位于X染色體，其堿基序列如 SEQ ID No. 55 和 SEQ ID No. 56 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物，所述引物分為二組，二組引物分別在每一對引物的其中一條引物的5’末端帶有不同顏色的熒光標(biāo)記物，所述第一組為 sY86、sY127、sY255、sY84、SRY，第二組為 sY134、sY254、ZFX 和 ZFY。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物，所述擴(kuò)增組合物中還包括7對引物，還能同時擴(kuò)增Y染色體上另外9個基因位點(diǎn)和X染色體上的另一個基因位點(diǎn)； 所述另外 IO 個基因位點(diǎn)為S Y81、S Y1161、S Y15 7、S Y1191、SMCX/SMCY、DAZ、DAZL、CDYI和CDY2基因位點(diǎn)； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa區(qū)sY81位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. I和SEQIDNo. 2 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)SY1161位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 33和SEQIDNo. 34所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)sY157位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 51和 SEQ IDNo. 52 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)SY1191位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 37和SEQIDNo. 38所示； 特異性擴(kuò)增SMCX/SMCY的引物，其中SMCY位于Y染色體短臂和SMCX位于X染色體，其堿基序列如SEQ ID No. 17和SEQ ID No. 18所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)DAZ位點(diǎn)和3號染色體DAZL位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 47 和 SEQ ID No. 48 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)⑶Y2位點(diǎn)和AZFc區(qū)⑶YI位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQID No. 13 和 SEQ ID No. 14 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物，所述引物分為三組，三組引物分別在每一對引物的其中一條引物的5’末端帶有不同顏色的熒光標(biāo)記物，所述第一組為 sY81、sY84、sY86、SMCX、SMCY、sY127、sY1161、sY255、sY157、SRY 和 sY1191，第二組為sY134、sY254、CDY1、CDY2、ZFX 和 ZFY，第三組為 DAZ、DAZL。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物，所述擴(kuò)增組合物中還包括13對引物，還能同時擴(kuò)增Y染色體上另外13個基因位點(diǎn)， 所述另外 13 個位點(diǎn)為USP9Y、DBY、KAL-Y、sY117、sY124、elFlAY、sY128、sY130、sY627、sY145、BPY2、sY242 和 sY1291 位點(diǎn)； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa區(qū)USP9Y位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 7和SEQIDNo. 8 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa區(qū)DBY位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 9和SEQIDNo. 10 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體位于AZFa和AZFb區(qū)之間KAL-Y位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQIDNo. 11 和 SEQ ID No. 12 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)sY117位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 15和SEQIDNo. 16 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)sY124位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 19和SEQIDNo. 20 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)elFlAY位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 23和SEQIDNo. 24所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)sY128位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 25和SEQIDNo. 26 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)sY130位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 27和SEQIDNo. 28 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb區(qū)sY627位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 31和SEQIDNo. 32 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)sY145位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 35和SEQIDNo. 36 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)BPY2位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 39和SEQIDNo. 40 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)sY242位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 41和SEQIDNo. 42 所示； 特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc區(qū)SY1291位點(diǎn)的引物，其堿基序列如SEQ ID No. 49和SEQIDNo. 50所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物，所述引物分為三組，三組引物分別在每一對引物的其中一條引物的5’末端帶有不同顏色的熒光標(biāo)記物，所述第一組為 sY81、sY84、sY86、USP9Y、SMCX、SMCY、sY127、elFlAY、sY128、sY130、sY1161、sY255、sY157、SRY、sY1191 和 sY1291，第二組為 DBY、sY124、sY134、CDYU CDY 2、sY242、sY254、KAL-Y、BPY2、ZFX 和 ZFY，第三組為 sY117、sY627、sY145、DAZ、DAZL。
7.根據(jù)權(quán)利要求2、4、6任一所述的Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物，其中第一組采用FAM或FL標(biāo)記；第二組采用HEX、VIC或JOE標(biāo)記；第三組采用TAMRA或NED標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物，所述擴(kuò)增組合物還包括PCR反應(yīng)緩沖液，2. 5mM各dNTP，5 IOng模板DNA和5單位/ μ I Taq酶。
9.Y染色體微缺失檢測試劑盒，包括權(quán)利要求1-7任一所述的擴(kuò)增組合物和PCR反應(yīng)緩沖液，2. 5mM各dNTP和5單位/ μ I Taq酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的Y染色體微缺失檢測試劑盒，所述檢測試劑盒還包括一個女性對照DNA和男性陽性對照DNA，所述女性對照DNA為濃度5 IOng正常女性模板DNA ;所述陽性對照DNA為濃度5 IOng正常男性模板DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及“Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物及檢測試劑盒”，屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域。本發(fā)明的Y染色體微缺失檢測的擴(kuò)增組合物，可以通過一個反應(yīng)擴(kuò)增多至30個與Y染色體微缺失檢測相關(guān)的位點(diǎn)。本發(fā)明的檢測試劑盒，通過定量熒光PCR方法，利用所述擴(kuò)增復(fù)合物，對Y染色體微缺失進(jìn)行檢測。根據(jù)有無擴(kuò)增產(chǎn)物及擴(kuò)增產(chǎn)物劑量確定是否存在Y染色體微缺失異常。大量的位點(diǎn)數(shù)量使檢測結(jié)果更可信，為確定缺失類型提供更多、更細(xì)致的信息，可以實(shí)現(xiàn)定量檢測部分缺失和重復(fù)。涉及到操作更加便捷、簡單，檢測一個樣本只需要做一個PCR擴(kuò)增和一個測序儀檢測反應(yīng)即可完成，整個過程需要4-5小時，極大降低操作強(qiáng)度和檢測時間。
文檔編號C12Q1/68GK102912028SQ20121043935
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者陳初光 申請人:北京閱微基因技術(shù)有限公司