專利名稱：男性y染色體微缺失基因檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因缺失檢測領域，尤其涉及一種男性Y染色體微缺失基因檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
全世界約有15％的夫婦被不育所困擾，其中男性因素約占一半。在排除輸精管梗阻、克氏癥和其他泌尿生殖系統(tǒng)原因后，嚴重少精癥和無精子癥最有可能的原因就是精子發(fā)生基因的異常。關于精子發(fā)生基因，特別關注Y染色體長臂11間隔。Y染色體構成人類基因組的2％， 由短臂(Yp)和長臂(Yq)組成。無精子癥和嚴重少精子癥的細胞遺傳學和分子生物學研究也證實Y染色體上存在著無精子因子(azoospermia factor，AZF)，它有四個清楚的、非重疊的亞區(qū)，即AZFa、AZFb、AZFc和AZFd區(qū)。這些區(qū)域的基因微缺失可引起精子發(fā)生障礙，繼而引起男性不育。因此Y染色體微缺失現(xiàn)在被認為是男性特發(fā)性不育最重要的遺傳學病因。隨著輔助生殖技術的進展，卵細胞胞漿內(nèi)精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術被認為是男性不育癥治療上的一次革命。然而該技術可能將攜帶染色體畸形、缺失或基因突變的精子注入到卵胞漿內(nèi)，使卵子受精，從而將上述各種遺傳缺陷傳給下一代。因此，為了確定是否需要治療，臨床醫(yī)生建議所以精子濃度＜5×106/mL的男性都要進行Y染色體微缺失的分子診斷。
AZF的片段較小，常規(guī)核型分析不易發(fā)現(xiàn)其缺失，故一般通過對STSs進行PCR擴增來獲取Y染色體微缺失信息。常用的技術有1.多重PCR電泳多重PCR是目前Y染色體微缺失檢測應用得最廣泛的方法，具有簡單、快速、靈敏、特異、經(jīng)濟和高通量的特點，是檢測AZF的理想方法，但與常規(guī)PCR相比有更高的技術要求，且缺少標準篩查方案，各實驗室結果不盡相同。
2.探針技術用特異探針進行Southern blot或Northern blot是研究AZF微缺失與男性不育關系的有效方法，但方法過于繁瑣，難以推廣，多用于實驗室研究。
3.其他(1)基因芯片技術個別報道用基因芯片技術同時對多個熱點基因進行研究，有助于篩選和研究無精子癥相關基因，詳盡了解無精子癥的發(fā)病機制。(2)毛細管電泳技術具有高通量、高靈敏度、快速及進樣量少的優(yōu)點，但需要專門的毛細管電泳儀。
中國專利200410043918.0公開了特異性擴增Y染色體上微缺失STS中的sY87和sY143的兩對引物序列，但作為Y染色體微缺失檢測方法，不符合歐洲生殖學會檢測至少6個STS(sY254、sY255、sY84、sY86、sY127、sY134)的最低要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種男性Y染色體微缺失基因檢測試劑盒，該試劑盒能穩(wěn)定、高效地對男性Y染色體微缺失基因進行檢測。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種男性Y染色體微缺失基因檢測方法，該方法建立在多重PCR和凝膠電泳基礎上，提高了多重PCR的穩(wěn)定性和均一性。
為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案一種男性Y染色體微缺失基因檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括特異性擴增Y染色體AZFa亞區(qū)sY82序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO25和SEQ ID NO26所示；特異性擴增Y染色體AZFa亞區(qū)sY84序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示；特異性擴增Y染色體AZFa亞區(qū)sY86序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO15和SEQ ID NO16所示；特異性擴增Y染色體AZFb亞區(qū)sY124序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO21和SEQ ID NO22所示；特異性擴增Y染色體AZFb亞區(qū)sY127序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO17和SEQ ID NO18所示；特異性擴增Y染色體AZFb亞區(qū)sY128序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO27和SEQ ID NO28所示；特異性擴增Y染色體AZFb亞區(qū)sY133序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO29和SEQ ID NO30所示；特異性擴增Y染色體AZFb亞區(qū)sY134序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO23和SEQ ID NO24所示；特異性擴增Y染色體AZFb亞區(qū)sY143序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示；
特異性擴增Y染色體AZFc亞區(qū)sY239序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO11和SEQ ID NO12所示；特異性擴增Y染色體AZFc亞區(qū)sY242序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示；特異性擴增Y染色體AZFc亞區(qū)sY254序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；特異性擴增Y染色體AZFc亞區(qū)sY255序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示；特異性擴增Y染色體AZFd亞區(qū)sY145序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO19和SEQ ID NO20所示；特異性擴增Y染色體AZFd亞區(qū)sY152序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO13和SEQ ID NO14所示；和特異性擴增男性特有Sry基因的引物，其堿基序列如SEQ IDNO31和SEQ ID NO32所示；上述所有序列可由其堿基互補序列替換。
所述試劑盒還包括PCR擴增所需試劑MgCl2、甜菜堿、熱啟動酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP和PCR反應緩沖液。
所述MgCl2反應終濃度為1.5mM。
所述甜菜堿反應終濃度為1.3M。
所述dATP反應終濃度為200μM、dCTP反應終濃度為200μM、dGTP反應終濃度為200μM、dUTP反應終濃度為400μM。
一種男性Y染色體微缺失基因檢測方法，包括以下步驟
1)從抗凝全血中提取人基因組DNA；2)以步驟1)所得DNA為模板，利用權利要求1所述特異性擴增Y染色體AZF的引物進行PCR擴增；3)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。
所述PCR擴增分四管進行，第一管包括10條引物，其堿基序列如SEQ ID NO1-8和SEQ ID NO31-32所示；第二管包括8條引物，其堿基序列如SEQ ID NO9-14和SEQ ID NO31-32所示；第三管包括10條引物，其堿基序列如SEQ ID NO15-22和SEQ ID NO31-32所示；第四管包括10條引物，其堿基序列如SEQ ID NO23-30和SEQ ID NO31-32所示。
所述PCR反應體系中含有甜菜堿，其反應終濃度為1.3M。
所述PCR擴增條件為 本發(fā)明設計了15對PCR引物分別特異地擴增AZF STSs序列，并同時設計1對內(nèi)控PCR引物，擴增男性特有的SRY(sex-determiningregion of Y-chromesome)基因，以指示PCR正常進行。為了解決多重PCR擴增不穩(wěn)定、不均一的問題，本發(fā)明將該15個STSs分屬到4個PCR反應當中，并都添加SRY PCR引物，在同一條件下進行4個獨立的擴增反應，最后再一起進行電泳分析。通過反復實驗，調(diào)整各引物對濃度，使用熱啟動酶，并在PCR反應液里添加甜菜堿等增效劑，最終實現(xiàn)穩(wěn)定和均一地擴增。本發(fā)明PCR產(chǎn)物用普通瓊脂糖凝膠電泳來進行檢測，因此設計的各引物對擴增產(chǎn)物片段大小必須能夠被肉眼識別。本專利將15個STSs分屬4個PCR反應，在每一個反應中各PCR產(chǎn)物片段大小必須相差至少30bp，所有片段大小不超過400bp(不包括SRY引物擴增產(chǎn)物，SRY擴增片段為470bp)。各引物對Tm值相差不超過2℃。因為采用了熱啟動酶和UNG酶(防污染)所以在PCR程序上也作了相應的變化。
采用本發(fā)明所述試劑盒對男性Y染色體微缺失基因進行檢測，具有高效、低成本、結果穩(wěn)定等優(yōu)點。


圖1是正常男性Y染色體微缺失基因檢測結果。
圖2是非正常男性Y染色體微缺失基因檢測結果。
附圖標號說明I、第一管PCR；II、第二管PCR；III、第三管PCR；IV、第四管PCR；1，5，9，13正常對照；2，6，10，14樣品1；3，7，11，15樣品2；4，8，12，16陰性對照。
具體實施例方式
實施例1一、材料1.儀器PCR儀、離心機2.引物設計本發(fā)明設計了15對PCR引物分別特異地擴增AZFSTSs序列，并同時設計1對內(nèi)控PCR引物，擴增男性特有的Sry(sex-determining region of Y-chromesome)基因，以指示PCR正常進行。
表1 引物列表


3、試劑1 XPCR buffer50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH9.0，25℃)和0.1％TritonX-100MgCl2、甜菜堿、熱啟動酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP二、方法1、基因組DNA的獲取用常規(guī)分子生物學方法或市售試劑盒從抗凝全血中提取人基因組DNA。分別提取三名男子基因組DNA和一名女子基因組DNA。
2、PCR擴增取PCR反應管，在管壁上做好標記，而后分別加入已提取的樣本gDNA 4μL(含基因組DNA200-500ng)、引物及PCR反應試劑，最后加入無菌水至25μl反應總體系。該過程需在冰上操作，每個樣品同時做4個PCR擴增進行檢測，且每次檢測都應同時設立一組陽性對照(正常男性基因組DNA)及陰性對照(女性基因組DNA)，PCR反應體系見表2。
表2 PCR反應體系


PCR按以下條件進行擴增

3、電泳檢測取10μL PCR產(chǎn)物加2μL 6×上樣緩沖液，(10uLPCR產(chǎn)物是針對1mm×3mm上樣孔，可根據(jù)上樣孔的大小作適當調(diào)整)混和均勻后經(jīng)2.0％瓊脂糖電泳，先用電壓8V/cm電泳約3分鐘使DNA遷移出上樣孔，降低電壓至4v/cm至溴酚藍遷移出2-3厘米，即可在紫外燈下觀察結果，如條帶不能充分區(qū)分，可繼續(xù)電泳至能區(qū)分為止。凝膠質(zhì)量對條帶的區(qū)分十分關鍵，推薦使用Promega或Biowest等進口瓊脂糖，大多數(shù)國產(chǎn)的瓊脂糖無法獲得理想效果，并建議使用凝膠成像系統(tǒng)。
三、結果分析(1)陰性對照以女性基因組DNA為模板的反應管內(nèi)，應無任何特異性產(chǎn)物擴增(2)陽性對照以正常男性基因組DNA為模板的反應管內(nèi)應擴出以下條帶

其中男性樣品都應擴出內(nèi)控帶。若待測男性樣品中無此帶，說明其基因組DNA未抽提成功，應重新抽提DNA。
從圖1可以看出，該樣品擴增出了以正常男性基因組DNA為模板應該擴增出的全部條帶，說明該樣品正常，該男子Y染色體無微基因缺失。
從圖2可以看出，樣品1未擴增出sY84序列，樣品2未擴增出sY254、sY242、sY239、sY152和sY128序列，說明樣品1部分A座位缺失，樣品2C座位和部分B、D座位聯(lián)合缺失。
Y染色體微缺失的檢測應用在醫(yī)學領域具有如下功能(1)通過對無精子癥或少精子癥患者進行缺失篩查，指導臨床診斷及治療措施的選擇，從而避免不必要的藥物及手術治療。
(2)單精子胞漿內(nèi)注射技術(int ra2cytoplasmic sperminjection，ICSI)使許多少精癥甚至是無精癥患者可以生育下一代，但這種技術也可能將生殖缺陷人為地傳給后代，導致子代男性生殖力下降或不育，通過術前篩查可以避免這種傳遞并指導ICSI后代的生育。
SEQUENCE LISTING<110>亞能生物技術(深圳)有限公司<120>男性Y染色體微缺失基因檢測試劑盒及檢測方法<130>11<160>32<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1gggtgtgacc ataaggca 18<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2accagtatct agccaaagca gc 22<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3gcaggataga gaagggtag 19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列
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1.男性Y染色體微缺失基因檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括特異性擴增Y染色體AZFa亞區(qū)sY82序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO25和SEQ ID NO26所示；特異性擴增Y染色體AZFa亞區(qū)sY84序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示；特異性擴增Y染色體AZFa亞區(qū)sY86序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO15和SEQ ID NO16所示；特異性擴增Y染色體AZFb亞區(qū)sY124序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO21和SEQ ID NO22所示；特異性擴增Y染色體AZFb亞區(qū)sY127序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO17和SEQ ID NO18所示；特異性擴增Y染色體AZFb亞區(qū)sY128序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO2 7和SEQ ID NO28所示；特異性擴增Y染色體AZFb亞區(qū)sY133序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO29和SEQ ID NO30所示；特異性擴增Y染色體AZFb亞區(qū)sY134序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO23和SEQ ID NO24所示；特異性擴增Y染色體AZFb亞區(qū)sY143序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示；特異性擴增Y染色體AZFc亞區(qū)sY239序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO11和SEQ ID NO12所示；特異性擴增Y染色體AZFc亞區(qū)sY242序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示；特異性擴增Y染色體AZFc亞區(qū)sY254序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；特異性擴增Y染色體AZFc亞區(qū)sY255序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示；特異性擴增Y染色體AZFd亞區(qū)sY145序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO19和SEQ ID NO20所示；特異性擴增Y染色體AZFd亞區(qū)sY152序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO13和SEQ ID NO14所示；和特異性擴增男性特有Sry基因的引物，其堿基序列如SEQ ID NO31和SEQ ID NO32所示；上述所有序列可由其堿基互補序列替換。
2.根據(jù)權利要求1所述的男性Y染色體微缺失基因檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括PCR擴增所需試劑MgCl2、甜菜堿、熱啟動酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP和PCR反應緩沖液。
3.根據(jù)權利要求2所述的男性Y染色體微缺失基因檢測試劑盒，其特征在于所述MgCl2反應終濃度為1.5mM。
4.根據(jù)權利要求2所述的男性Y染色體微缺失基因檢測試劑盒，其特征在于所述甜菜堿反應終濃度為1.3M。
5.根據(jù)權利要求2所述的男性Y染色體微缺失基因檢測試劑盒，其特征在于所述dATP反應終濃度為200μM、dCTP反應終濃度為200μM、dGTP反應終濃度為200μM、dUTP反應終濃度為400μM。
6.男性Y染色體微缺失基因檢測方法，包括以下步驟1)從抗凝全血中提取人基因組DNA；2)以步驟1)所得DNA為模板，利用權利要求1所述特異性擴增Y染色體AZF的引物進行PCR擴增；3)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。
7.根據(jù)權利要求5所述的男性Y染色體微缺失基因檢測方法，其特征在于所述PCR擴增分四管進行，第一管包括10條引物，其堿基序列如SEQ ID NO1-8和SEQ ID NO31-32所示；第二管包括8條引物，其堿基序列如SEQ ID NO9-14和SEQ ID NO31-32所示；第三管包括10條引物，其堿基序列如SEQ ID NO15-22和SEQ ID NO31-32所示；第四管包括10條引物，其堿基序列如SEQ ID NO23-30和SEQ ID NO31-32所示。
8.根據(jù)權利要求5所述的男性Y染色體微缺失基因檢測方法，其特征在于所述PCR反應體系中含有甜菜堿，其反應終濃度為1.3M。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因缺失檢測領域，尤其涉及一種男性Y染色體微缺失基因檢測試劑盒及檢測方法。該試劑盒包括特異性擴增Y染色體AZF的30條引物，和特異性擴增男性特有Sry基因的2條引物。采用本發(fā)明所述試劑盒對男性Y染色體微缺失基因進行檢測，具有高效、低成本、結果穩(wěn)定等優(yōu)點。
文檔編號C12N15/11GK101092648SQ20071007431
公開日2007年12月26日 申請日期2007年5月10日 優(yōu)先權日2007年5月10日
發(fā)明者田潔, 任維, 向筑, 廖生赟, 鄒耀東 申請人:亞能生物技術(深圳)有限公司