檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系及其檢測(cè)試劑盒，本發(fā)該擴(kuò)增體系包括通用—特異嵌合引物對(duì)和通用引物的混合物，通用—特異嵌合引物對(duì)分別針對(duì)D1S468、D1S436、D1S489、D19S112、D19S217和D19S902基因位點(diǎn)；通用引物是FluD5-Up，通用—特異嵌合引物對(duì)中的各個(gè)正向引物5’端設(shè)有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up為熒光標(biāo)記引物；本發(fā)明的復(fù)合擴(kuò)增體系及其檢測(cè)試劑盒克服了不同引物需多種熒光標(biāo)記的不足，在一個(gè)PCR體系內(nèi)采用單熒光標(biāo)記一次檢測(cè)6個(gè)1p19q基因位點(diǎn)，結(jié)果直觀可靠，省時(shí)高效，可有效的對(duì)染色體1p19q雜合性缺失進(jìn)行檢測(cè)分析。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系及其檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種PCR擴(kuò)增體系，以及使用該擴(kuò)增體系的檢測(cè)產(chǎn)品，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]源自神經(jīng)上皮的腫瘤統(tǒng)稱為腦膠質(zhì)瘤(膠質(zhì)細(xì)胞瘤)，占顱腦腫瘤的40~50%，是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，年發(fā)病率約為3~8人/10萬(wàn)人口。世界衛(wèi)生組織(WHO)將膠質(zhì)瘤分為4級(jí)，惡性度從低度到高度，WHOI級(jí)為良性，WHOII級(jí)為低度惡性，WHOIII級(jí)和WHOIV級(jí)為高度惡性。近年來(lái)有關(guān)膠質(zhì)瘤(glioma)發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)研究日漸深入，膠質(zhì)瘤的神經(jīng)病理學(xué)評(píng)估，不再局限于為臨床提供關(guān)于腫瘤的組織學(xué)類型和惡性級(jí)別的信息，可能需要越來(lái)越多的以組織學(xué)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)志物的便捷檢測(cè)。
[0003]少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤占膠質(zhì)瘤的5~18%，是膠質(zhì)瘤的一種獨(dú)立類型。大多數(shù)少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤存在I號(hào)染色體短臂(Ip)和19號(hào)染色體長(zhǎng)臂(19q)的雜合性缺失(loss ofheterozygosity, L0H)。Ip和19q雜合性缺失檢測(cè)可用于對(duì)腫瘤初發(fā)的早期診斷?？傮w而言，大約80%的WHOII級(jí)的少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，60%的WHOIII級(jí)的間變型少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，30%~50%的少突星形細(xì)胞瘤和20%~30%的間變型少突星形細(xì)胞瘤出現(xiàn)Ip和19q的缺失，另外小于10 %的彌漫性星形細(xì)胞瘤，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中攜帶這種遺傳改變。研究還發(fā)現(xiàn),惡性膠質(zhì)瘤的一種亞類具有少突膠質(zhì)瘤源性,而這種亞類與其他的惡性膠質(zhì)瘤在基因型上最大的不同在于這種亞類的Ip和19q具有較高的雜合性缺失率，分別為40%和60%。
[0004]Ip和19q雜合性缺失檢測(cè)還可用于腫瘤復(fù)發(fā)的診斷，且具有這一分子遺傳學(xué)改變的病人，其放化療敏感性較 高，預(yù)后較好。Caimcross (1988)和Macdonald (1990)研究表明lp/19q雜合性缺失(loss of heterozygosity, L0H)是預(yù)后良好和PCV化療方案(甲基芐肼+洛莫司汀+長(zhǎng)春新堿)敏感的重要標(biāo)志。三個(gè)前瞻性隨機(jī)III期試驗(yàn)也證實(shí)lp/19q聯(lián)合性缺失在WHOIV級(jí)的膠質(zhì)瘤中是一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)后指標(biāo)。研究顯示染色體lp/19q雜合性缺失的少突膠質(zhì)瘤患者對(duì)化療敏感，預(yù)后好，生存期長(zhǎng)，手術(shù)后先行PCV方案或TMZ (替莫唑胺)組成的方案化療，放療可推遲，作為復(fù)發(fā)時(shí)的挽救治療。
[0005]2009年NCCN顱內(nèi)腫瘤臨床治療指南建議IP LOH或lp/19q LOH的少突膠質(zhì)瘤切除后可以選擇單純化療。2012年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)年會(huì)中專家稱，lp/19q聯(lián)合缺失的腫瘤患者，聯(lián)合放化療是最新的標(biāo)準(zhǔn)治療。鑒于lp/19q缺失在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤接受輔助治療的患者中無(wú)可爭(zhēng)議的預(yù)后意義，國(guó)外目前已經(jīng)將lp/19q LOH檢測(cè)作為常規(guī)檢測(cè)，而國(guó)內(nèi)近幾年剛開展lp/19q LOH的檢測(cè)。
[0006]目前，常用于檢測(cè)lpl9q LOH的方法包括:突光原位雜交(fluorescent in situhybridization, FISH)、I:匕較基因組雜交(comparative genomic hybridization, CGH)矛口以 PCR 為基礎(chǔ)的雜合性缺失檢測(cè)(polymerasechain reaction-loss of heterozygosity,PCR-L0H)，三者的檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性。FISH檢測(cè)時(shí)僅需很小的腫瘤樣本，且不需要外周血作對(duì)照，但在分析時(shí)要考慮細(xì)胞斷面對(duì)結(jié)果的影響，同時(shí)不同于血液系統(tǒng)腫瘤，實(shí)體瘤染色體的制備和顯帶都比較困難，需要有豐富經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員操作。CGH檢測(cè)是比腫瘤細(xì)胞核型分析更敏感的檢測(cè)基因組獲得與缺失的方法，但非腫瘤細(xì)胞的摻雜會(huì)顯著降低CGH的敏感性，因此使用時(shí)需要結(jié)合纖維切割技術(shù)，而不能實(shí)現(xiàn)便捷、簡(jiǎn)單的檢測(cè)。PCR—LOH檢測(cè)是一項(xiàng)比較成熟的分子生物學(xué)技術(shù)，以檢測(cè)者的淋巴細(xì)胞或正常組織DNA作對(duì)照，通過(guò)有無(wú)擴(kuò)增片斷的出現(xiàn)判斷是否存在某種缺失。常用的判斷方法包括:限制性酶切法、銀染變性聚丙酰胺凝膠電泳法、熒光標(biāo)記測(cè)序、凝膠電泳法和定量PCR電泳法。但是，由于限制性酶切法與銀染凝膠電泳法操作相當(dāng)繁雜，且結(jié)果分析摻雜因素較多，不能便捷、準(zhǔn)確的判定測(cè)試結(jié)果。
[0007]鑒于上述情況，提供一種改良的、便捷的、高靈敏度的染色體lpl9q雜合性缺失檢測(cè)試劑盒的發(fā)明是勢(shì)在必行的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有特定核苷酸序列的通用一特異嵌合引物組合，可以有效地減弱引物間的競(jìng)爭(zhēng)與干擾因素，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和靈敏度高的檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系及其檢測(cè)試劑盒，該擴(kuò)增體系可以實(shí)現(xiàn)在一個(gè)PCR體系內(nèi)采用單突光標(biāo)記一次檢測(cè)6個(gè)lpl9q基因位點(diǎn)。
[0009]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是:一種檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系，包括通用一特異嵌合引物對(duì)和通用引物的混合物；
所述通用一特異嵌合引物對(duì)分別針對(duì)D1S468、D1S436、D1S489、D19S112、D19S217和D19S902基因位點(diǎn)；所述通用一特異嵌合引物對(duì)中的正向引物是Up-DIS468、Up-DIS436、Up-DlS489、Up-D19S112、Up_D19S217 和 Up_D19S902，相應(yīng)的反向引物是 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、 D19S112-R、D19S217-R和 D19S902-R ；
所述通用引物是FluD5-Up，所述通用一特異嵌合引物對(duì)中的各個(gè)正向引物5’端設(shè)有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up為熒光標(biāo)記引物；
所述通用一特異嵌合引物對(duì)和通用引物的核苷酸序列如下:
Prime Name Prime Sequences (5’ -3’)
Up-DIS468 CTATACTGAGTCGTTGATCCGACACACACTTCCCTCTCC D1S468-R TTAACCGTTTTGGTCCTACC
Up-DIS436 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAATGTGTCTCCAGTGTTAGC
DIS436-R CTGTAGAGCAATCTGGCAATATGT
Up-DIS489 CTATACTGAGTCGTTGATCAGCCAGACCAAGTCTCAACA
D1S489-R CGCGTTAACATTGCTTATCAC
Up-D19Sl12 CTATACTGAGTCGTTGATCCAGTCATTTGAAGACCAAAGA
D19S112-R GATGGACCCACAGAAACTGA
Up-D19S217 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAAGGGGGACCTTGAAACT
D19S217-R ATCTGGGGTTGGGGTTGATT
Up-D19S902 CTATACTGAGTCGTTGATCCCATCCTAATGAGGGCAA
D19S902-R TGCGTAGAAAATTCCCAGG
FluD5-Up CTATACTGAGTCGTTGATC。[0010]上述技術(shù)方案的一種優(yōu)選是:上述引物FluD5-Up的濃度是0.9μΜ~2.ΟμΜ。
[0011]一種上述技術(shù)方案的進(jìn)一步優(yōu)選是:所述引物Up-DlS468、Up_D19S217的濃度與引物FluD5-Up的濃度的比值為I: 25至I: 15 ;所述引物Up_DlS436和Up_DlS489的濃度與引物FluD5-Up的濃度的比值為I: 200至I: 150 ;所述引物Up_D19S902的濃度與引物FluD5-Up的濃度的比值為I: 120至I: 70 ;所述引物Up_D19S112的濃度與引物FluD5_Up的濃度的比值為 I: 300 至 I: 250 ;所述引物 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和D19S902-R的濃度與引物FluD5-Up的濃度的比值為1: 5至1: 4。
[0012]一種上述技術(shù)方案的更進(jìn)一步優(yōu)選是:所述引物FluD5_Up的濃度是1.8μΜ，引物D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R 和 D19S902-R 的濃度是 0.4μΜ，引物Up-DlS468 和 Up-D19S217 的濃度是 0.08μΜ，引物 Up_DlS436、Up_DlS489 的濃度是 0.Ο?μΜ,Up-D19S902 的濃度是 0.02μΜ，引物 Up_D19S112 的濃度是 0.007μΜ。
[0013]上述FluD5_Up的熒光標(biāo)記為Cy5、Cy3或FAM。
[0014]上述擴(kuò)增體系的總體積為ΙΟμΙ~20μ1。
[0015]上述檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系還包括PCR緩沖液、1.5mM~2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、0.4U~0.6U的熱啟動(dòng)酶和IOng~200ng的DNA模板。
[0016]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的另一種技術(shù)方案是:一種采用上述復(fù)合擴(kuò)增體系的檢測(cè)染色體缺失的試劑盒。
[0017]本發(fā)明的積極效果在于:
I)本發(fā)明檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系利用熒光標(biāo)記通用引物結(jié)合6對(duì)特異性引物建立的多重PCR-CE體系，克服了普通PCR只能在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)檢測(cè)一個(gè)基因位點(diǎn)的不足，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)PCR體系內(nèi)同時(shí)檢測(cè)6個(gè)lpl9q基因位點(diǎn)，節(jié)約了成本，提高了效率。由于采用了特定的通用一特異嵌合引物，并且應(yīng)用非生物源性通用引物做單熒光標(biāo)記，避免了普通多重PCR需進(jìn)行引物多種熒光標(biāo)記的繁瑣，既減弱了引物間的競(jìng)爭(zhēng)與干擾因素，又節(jié)約了費(fèi)用。
[0018]2)本發(fā)明的擴(kuò)增體系中通用-特異嵌合引物對(duì)中的正向引物和反向引物的濃度會(huì)直接影響多重PCR的結(jié)果，尤為重要。本發(fā)明的擴(kuò)增體系在配制時(shí)，使得正向引物Up-DlS468、Up-DlS436、Up_DlS489、Up_D19S112、Up_D19S217 和 Up_D19S902 的濃度低于通用引物FluD5-Up濃度，并且各個(gè)引物的濃度控制在適宜的范圍內(nèi)。引物FluD5-Up的濃度優(yōu)選 1.8μΜ，引物 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R 和 D19S902-R的濃度優(yōu)選0.4μΜ，引物Up-DlS468和Up_D19S217的濃度優(yōu)選0.08μΜ,引物Up_DlS436、Up-DlS489的濃度優(yōu)選0.0^M,Up-D19S902的濃度優(yōu)選(λ 02μΜ，引物Up_D19S112的濃度優(yōu)選0.007μΜ，該濃度配比可以有效地減弱了引物間的競(jìng)爭(zhēng)與干擾因素，使得多重PCR的結(jié)果更加可靠。
[0019]3)本發(fā)明試劑盒進(jìn)行片段分析應(yīng)用的毛細(xì)管電泳片段分析技術(shù)不同于傳統(tǒng)凝膠電泳分析模式，使PCR結(jié)果分析更直觀、簡(jiǎn)潔、可靠，易于識(shí)別判斷，更有利于標(biāo)準(zhǔn)化操作。
[0020]4)本發(fā)明檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作便捷、使用條件可以模式化，便于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0021]圖1是本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的多重PCR反應(yīng)原理示意圖；
圖2是實(shí)施例1的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣本I的血樣的分型圖譜；
圖3是實(shí)施例1的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣本I的腫瘤組織DNA的分型圖譜；
圖4是實(shí)施例1的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣本I的血樣和腫瘤組織DNA疊加的分型圖譜；
圖5是實(shí)施例1的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣本2的血樣的分型圖譜；
圖6是實(shí)施例1的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣本2的腫瘤組織DNA的分型圖譜；
圖7是實(shí)施例1的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣本2的血樣和腫瘤組織DNA疊加的分型圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1
本實(shí)施例的檢測(cè)染色體缺失的檢測(cè)試劑盒至少由固定在紙質(zhì)包裝盒內(nèi)的六只裝有相應(yīng)試劑的試管組成，六只試管分別是擴(kuò)增緩沖液試管、Mg2+試管、dNTP試管、熱啟動(dòng)酶試管、引物混合物試管和超純水試管。上述試管在包裝盒內(nèi)的排列放置的順序沒(méi)有特別要求，只要清楚標(biāo)示即可。
[0023]本實(shí)施例的檢測(cè)試劑盒的開發(fā)原理及使用方法為:
A.腦膠質(zhì)瘤lpl9q LOH基因位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)、合成及篩選: 根據(jù)國(guó)際癌癥學(xué)會(huì)推薦的腦膠質(zhì)瘤lpl9q的6個(gè)基因(D1S468、D1S436、D1S489、D19S112、D19S217、D19S902)位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。收集腦膠質(zhì)瘤者靜脈全血(抗凝全血)及組織標(biāo)本(新鮮腫瘤組織或石蠟切片)，使用DNA裂解液和蛋白酶K提取上述兩種不同性質(zhì)的人源基因組DNA，獲得樣本濃度區(qū)間為lOng/μΙ~lOOng/μΙ，高濃度樣本用水稀釋至IOOng/μ? ;以上述2例待測(cè)DNA樣品先進(jìn)行單重?cái)U(kuò)增篩選，再進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，使用01igo7.0軟件進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，篩選出六對(duì)引物。
[0024]通用-特異嵌合引物對(duì)中的正向引物(Up-STR_F)5’端為通用引物FluD5_Up的序列，3’端為特異引物序列段，分別命名為Up-DlS468、Up_DlS436、Up_DlS489、Up_D19S112、Up-D19S217和Up-D19S902 ;其反向引物(STR-R)采用lpl9q基因位點(diǎn)特異引物即可，分別命名為 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R 和 D19S902-R。
[0025]通用引物采用文獻(xiàn)上已記載的引物。通用引物5’端做熒光素標(biāo)記，分別使用FAM、CY3和CY5報(bào)告基團(tuán)均可，此通用引物命名為FluD5-Up。
[0026]B.1pl9q LOH基因位點(diǎn)多重PCR-CE體系構(gòu)建:
本實(shí)施例的試劑盒采用的PCR反應(yīng)體系為多重PCR反應(yīng)體系，即6個(gè)基因位點(diǎn)特異引物和熒光標(biāo)記通用引物放在同一個(gè)PCR管內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。采用ΙΟμΙ~20μ1體系均可較好進(jìn)行擴(kuò)增。在考慮成本因素及經(jīng)過(guò)PCR實(shí)驗(yàn)反復(fù)調(diào)整和優(yōu)化后，優(yōu)選的多重PCR反應(yīng)體系總體積為10μ1，包括IOng~200ng基因組DNA、PCR緩沖液、2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、0.5U的熱啟動(dòng)酶，以及引物 FluD5-Up 1.8PM，D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R、D19S902-R各 0.4μΜ，Up_DlS468、Up_D19S217 各 0.08μΜ，Up_DlS436、Up_DlS489 各 0.Ο?μΜ,Up-D19S902 0.02Μ，Up-D19S112 0.007μΜ。
[0027]在多重PCR反應(yīng)體系中，通用一特異嵌合引物對(duì)中的正向引物Up-STR-F的濃度為通用引物FluD5-Up濃度的數(shù)分之一，其濃度因各個(gè)基因PCR擴(kuò)增效率的不同來(lái)調(diào)整。由于Up-STR-F具有l(wèi)pl9q位點(diǎn)互補(bǔ)的基因序列，故PCR反應(yīng)過(guò)程中，引物Up-STR-F和STR-R在熱啟動(dòng)酶作用下首先對(duì)lpl9q基因進(jìn)行5~10個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，產(chǎn)生5’端帶有Up的互補(bǔ)片段。當(dāng)Up-STR-F耗盡后，F(xiàn)luD5-Up和STR-R在熱啟動(dòng)酶作用下對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增，產(chǎn)生5’端帶有熒光標(biāo)記的互補(bǔ)基因片段。上述PCR反應(yīng)的原理如圖1所示。
[0028]本實(shí)施例的檢測(cè)試劑盒優(yōu)選的PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)熱5分鐘；然后94°C變性10秒，54°C退火10秒，72°C延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘，4°C保溫。
[0029]經(jīng)上述步驟所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)。利用多重?zé)晒釶CR結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)lpl9q基因位點(diǎn)，具有高效、穩(wěn)定、靈敏度高、分析結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選的毛細(xì)管電泳方案為:每個(gè)樣本CE體系總體積為20μ1，包括上述 PCR 產(chǎn)物 ?μ? ~5μ1、DNA-Size 標(biāo)準(zhǔn)液 0.2μ1 ~0.5μ1，及上樣緩沖液(Sample LoadingSolution, SLS)，最后覆蓋I滴石蠟油。電泳所得熒光圖譜進(jìn)行片段分析。
[0030]C.腦膠質(zhì)瘤lpl9q LOH基因片段分析判斷:
將全血和腫瘤組織標(biāo)本DNA經(jīng)擴(kuò)增后進(jìn)行毛細(xì)管電泳，所得圖譜進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)圖譜中標(biāo)示的基因片段大小和熒光峰值峰形比較，若腫瘤組織較全血樣本出現(xiàn)某一基因條帶熒光信號(hào)減少50%以上或條帶缺失即判斷為Ip或19q雜合性缺失。
[0031]本實(shí)施例的檢測(cè)試劑盒的使用步驟是:先進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及對(duì)照的DNA提取；再應(yīng)用多重?cái)U(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增；最后擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳后所得圖譜進(jìn)行l(wèi)pl9q LOH分析判斷。
[0032]以下是對(duì)兩例腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行l(wèi)p/19q LOH檢測(cè)的具體實(shí)施情況:
1、全血和腫瘤組織石蠟切片DNA提取:
取樣本I或2全血樣本400μ1，`加入Iml雙蒸水，混勻后離心5分鐘，棄去上層液1ml，加入400μ1裂解液和20μ1蛋白酶K，70°C金屬浴10分鐘，過(guò)離心柱，500μ1清洗液先后清洗兩次后，加入50μ1洗脫液離心洗脫，測(cè)樣本DNA濃度值。
[0033]取樣本I或2的腫瘤組織石蠟切片5片，刮片入1.5ml離心管，加Iml 二甲苯脫臘，Iml乙醇清洗兩次后，加400μ1裂解液和20μ1蛋白酶K，60°C金屬浴16小時(shí)，過(guò)離心柱，500μ1清洗液先后清洗兩次后，加入50μ1洗脫液離心洗脫，測(cè)樣本DNA濃度值。
[0034]2、lp/19q LOH檢測(cè)，具體操作步驟如下:
A.每個(gè)反應(yīng)體系中加入 10XPCR 緩沖液 ?μ1、100πιΜ Mg2+。.2μ1、2.5mM dNTP 0.8μ1、5υ熱啟動(dòng)酶 0.?μ? ；10μΜ 的 Up_DlS468、Up_DlS436、Up_DlS489、Up_D19S112、Up_D19S217 和Up-D19S902 分別按 1: 5、1:40、1:40、1:60、1: 5、1:20 的稀釋比例稀釋后各取 0.4μ1 ； 10μΜ 的D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R 和 D19S902-R 各取 0.4μ1 ；50μΜ 的FluD5-Up取0.36μ1 ;上述DNA模板2μ1 ;最后補(bǔ)水至ΙΟμΙ。
[0035]所采用引物的序列如下(5’ -3’ ):
D1S468引物
Up-DIS468 CTATACTGAGTCGTTGATCCGACACACACTTCCCTCTCC D1S468-R TTAACCGTTTTGGTCCTACC D1S436引物
Up-DIS436 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAATGTGTCTCCAGTGTTAGC DIS436-R CTGTAGAGCAATCTGGCAATATGT D1S489引物Up-DIS489 CTATACTGAGTCGTTGATCAGCCAGACCAAGTCTCAACA D1S489-R CGCGTTAACATTGCTTATCAC D19S112 引物
Up-D19Sl12 CTATACTGAGTCGTTGATCCAGTCATTTGAAGACCAAAGA D19S112-R GATGGACCCACAGAAACTGA D19S217 引物
Up-D19S217 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAAGGGGGACCTTGAAACT D19S217-R ATCTGGGGTTGGGGTTGATT D19S902 引物
Up-D19S902 CTATACTGAGTCGTTGATCCCATCCTAATGAGGGCAA D19S902-R TGCGTAGAAAATTCCCAGG 帶熒光標(biāo)記的通用引物 FluD5-Up CTATACTGAGTCGTTGATC。
[0036]B.將PCR反應(yīng)管置于擴(kuò)增儀上，運(yùn)行的PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)熱5分鐘；然后94°C變性10秒，54°C退火10秒，72°C延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。4°C保存。
[0037]C.所得PCR產(chǎn)物置于Beckman GenomelabGeXP遺傳分析儀上，按儀器使用說(shuō)明進(jìn)行毛細(xì)管電泳，每個(gè)CE體系總體積為20μ1，包括上述PCR產(chǎn)物?μ?、DNA_Size標(biāo)準(zhǔn)液0.5μ1、Sample Loading Solution 18.5μ1，最后覆蓋I滴石蠟油。CE所得熒光圖譜進(jìn)行基因片段分析。`
[0038]3、腦膠質(zhì)瘤lpl9q基因片段分析:
將上述樣本I或2的全血和腫瘤組織樣本CE圖譜進(jìn)行基因片段分析，根據(jù)圖譜中標(biāo)示的基因片段大小和熒光峰值峰形作同步比較，如圖2至圖7所示，橫坐標(biāo)為基因片段堿基數(shù)值，縱坐標(biāo)為熒光數(shù)值，橫坐標(biāo)從左到右的基因片段順序依次為針對(duì)D19S112、D1S489、D1S468、D1S436、D19S217、D19S902的擴(kuò)增片段，其中圖2和圖5為全血樣本基因片段分析圖，圖3和圖6為腫瘤組織樣本片段分析圖，圖4和圖7為疊加后的比較圖。其中樣本I均未出現(xiàn)基因片段的缺失現(xiàn)象，故判定為Ip和19q未缺失；樣本2的腫瘤組織樣本D19S902基因片段出現(xiàn)條帶缺失現(xiàn)象，故此判定為19q L0H。
[0039]對(duì)樣本I和2的血樣和腫瘤組織樣本，分別采用:(1)D1S468引物+通用引物；(2)D1S436引物+通用引物；(3)D1S489引物+通用引物；(4)D19S112引物+通用引物；(5)D19S217引物+通用引物；(6)D19S902引物+通用引物，進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增后采用毛細(xì)管電泳分析，判定結(jié)果與上述多重PCR結(jié)果一致。
[0040]實(shí)施例2
本實(shí)施例的檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合檢測(cè)試劑盒的其余部分與實(shí)施例1相同，不同之處在于:通用一特異嵌合引物對(duì)中的正向引物和反向引物的濃度不同。
[0041]實(shí)施例3
本實(shí)施例的檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合檢測(cè)試劑盒的其余部分與實(shí)施例1相同，不同之處在于:通用一特異嵌合引物對(duì)中的正向引物和反向引物的濃度不同。
[0042]對(duì)比例I至對(duì)比例3對(duì)比例I至對(duì)比例3的檢測(cè)試劑盒的其余部分與實(shí)施例1相同，不同之處在于:通用一特異嵌合引物對(duì)中的正向引物和反向引物的濃度不同。
[0043]實(shí)施例1至3以及對(duì)比例I至3的檢測(cè)試劑盒中的正向引物和反向引物的濃度如表1所示:
表1引物濃度表
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系，其特征在于:包括通用一特異嵌合引物對(duì)和通用引物的混合物； 所述通用一特異嵌合引物對(duì)分別針對(duì)D1S468、D1S436、D1S489、D19S112、D19S217和D19S902基因位點(diǎn)；所述通用一特異嵌合引物對(duì)中的正向引物是Up-DIS468、Up-DIS436、Up-DlS489、Up-D19S112、Up_D19S217 和 Up_D19S902，相應(yīng)的反向引物是 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和 D19S902-R ； 所述通用引物是FluD5-Up，所述通用一特異嵌合引物對(duì)中的各個(gè)正向引物5’端設(shè)有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up為熒光標(biāo)記引物； 所述通用一特異嵌合引物對(duì)和通用引物的核苷酸序列如下:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系，其特征在于:所述引物FluD5-Up 的濃度是 0.9μΜ ~2.ΟμΜ。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系，其特征在于:所述引物Up-DlS468、Up-D19S217的濃度與引物FluD5-Up的濃度的比值為I: 25至I: 15 ;所述引物Up-DlS436和Up-DlS489的濃度與引物FluD5_Up的濃度的比值為1: 200至1: 150 ;所述引物Up-D19S902的濃度與引物FluD5-Up的濃度的比值為1: 120至1: 70 ;所述引物Up-D19S112的濃度與引物FluD5-Up的濃度的比值為I: 300至I: 250 ;所述引物 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R 和 D19S902-R 的濃度與引物FluD5-Up的濃度的比值為1: 5至1: 4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系，其特征在于:所述引物FluD5-Up 的濃度是 1.8μΜ,引物 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和D19S902-R的濃度是0.4μΜ,引物Up_DlS468和Up_D19S217的濃度是0.08μΜ,引物Up-DlS436 和 Up-DlS489 的濃度是 0.Ο?μΜ, Up-D19S902 的濃度是 0.02μΜ，引物 Up_D19S112的濃度是0.007μΜ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系，其特征在于:所述FluD5-Up的熒光標(biāo)記為Cy5、Cy3或FAM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系，其特征在于:所述擴(kuò)增體系的總體積為10μL~20μ1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的檢測(cè)染色體缺失的復(fù)合擴(kuò)增體系，其特征在于:還包括PCR緩沖液、1.5mM~2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、0.4U~0.6U的熱啟動(dòng)酶和IOng~200ng的DNA模板。
8.一種采用如權(quán)利要求1所述的復(fù)合擴(kuò)增體系的檢測(cè)染色體缺失的試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103805707SQ201410055170
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月19日
【發(fā)明者】趙新泰, 王明 申請(qǐng)人:上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司