專利名稱：：一種用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒核苷酸片段的引物和探針序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒核苷酸片段的引物和探針序列。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，豬的疫病日益呈現(xiàn)復(fù)雜化和嚴(yán)重化趨勢(shì)，而出于豬繁殖育種的需要，種豬流通貿(mào)易量則大大增加，諸多因素的共同作用，使得豬繁殖障礙疾病呈愈演愈烈之勢(shì)，每年由此造成的損失不可估量，已對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。豬的繁殖障礙性疾病主要包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和一些微形體，其中病毒性疫病危害最大，這類疫病包括豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)、豬細(xì)小病毒(PPV)感染、偽狂犬病(PR)、豬瘟(CSF)、豬圓環(huán)病毒(PCV—2)感染、日本乙型腦炎(JE)等。這些病原在國(guó)內(nèi)均廣泛存在，可通過(guò)多種途徑使豬感染，臨床特點(diǎn)都可表現(xiàn)為妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎及木乃伊胎等繁殖障礙，病毒由1頭公豬最終傳染給許多母豬及其所產(chǎn)仔豬，造成疫病的流行和擴(kuò)散。而且，近年來(lái)這些疫病在臨床表現(xiàn)及流行病學(xué)方面出現(xiàn)了新的變化，隱性感染病例顯著上升，持續(xù)性感染在豬群中較為普遍，更增加了控制工作的難度。豬細(xì)小病毒(Porcineparvovirus,簡(jiǎn)稱PPV)為引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，可引起胚胎或胎兒的感染和死亡，導(dǎo)致母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、胎兒木乃伊化及新生仔豬的死亡。PPV基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，為單鏈線狀DNA，大小約為5.0kb，兩端均含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。近年來(lái)，PPV感染呈擴(kuò)大趨勢(shì)，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于缺乏有效的疫苗，因而及時(shí)診斷疾病、及時(shí)處理疫情就變得十分重要，這就需要有一種既準(zhǔn)確又快速的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法來(lái)確定病原.這也是臨床診斷與流行病學(xué)研究的一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)。目前常見(jiàn)的病毒分離和血清學(xué)診斷方法，操作繁瑣、耗時(shí)、敏感性低、特異性差，不適宜作為病毒的早期診斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，普通PCR方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷，但該技術(shù)需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行后處理，極易導(dǎo)致PCR產(chǎn)物污染，同時(shí)有一定的非特異性擴(kuò)增。而熒光PCR技術(shù)則是在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，在擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入一對(duì)特異性引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針，使用實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的熒光PCR檢測(cè)儀來(lái)檢測(cè)靶核苷酸序列的技術(shù)。除了具有普通PCR的優(yōu)點(diǎn)外，它還具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)特異性更強(qiáng)，靈敏度更高。由于多使用了一條可與模板互補(bǔ)配對(duì)的熒光探針，提高了特異性，并且由自動(dòng)化儀器收集熒光信號(hào)，避免了人工判斷的主觀性，又可進(jìn)一步提高靈敏度。(2)全封閉反應(yīng)，在線式實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光，無(wú)須PCR產(chǎn)物的后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性。(3)數(shù)據(jù)分析選在核酸擴(kuò)增的對(duì)數(shù)期，擯棄普通PCR方法的受多因素干擾的終點(diǎn)分析法，使得定量更準(zhǔn)確可靠。(4)可實(shí)現(xiàn)單管雙檢或多檢，還可設(shè)計(jì)針對(duì)性內(nèi)標(biāo)，監(jiān)控抽提效率及排除抑制劑干擾。(5)不接觸有毒試劑，操作安全。(6)有利于規(guī)模化、自動(dòng)化及聯(lián)網(wǎng)管理。(7)適用范圍更廣，理論上可檢測(cè)任何病毒的核酸。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒核苷酸片段的引物和探針序列?；谏鲜瞿康?，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒核苷酸片段的引物和探針序列包括由上游引物PPVpf序列為CAACTACGCAGCAACTCCAATAC和下游引物PPVpr序列為GGTTGGTGAAAGTTGGTGTTGTT組成的引物對(duì)。探針PPVpb序列為CTCGCTCCACGGCTCCAAGGCTAA。本發(fā)明的具體原理是利用一對(duì)靶核苷酸序列的特異性引物和一個(gè)特異性熒光探針，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTP)等成分，并應(yīng)用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)耙核苷酸序列的核酸片段擴(kuò)增。所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(R)和熒光淬滅基團(tuán)(Q)的寡核苷酸。在探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，而在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，Taq酶的5'端外切酶活性將特異結(jié)合在靶核苷酸片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，脫離了熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽作用，熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)就可以由儀器檢測(cè)到，熒光信號(hào)量的變化與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，從而判定待測(cè)樣本中靶核苷酸序列的存在。附圖利用引物對(duì)PPVpf/PPVpr和探針PPVpb檢測(cè)豬細(xì)小病毒陽(yáng)性樣品的熒光PCR擴(kuò)增圖。具體實(shí)施例方式1.引物和探針設(shè)計(jì)通過(guò)分別對(duì)所有已知的豬細(xì)小病毒基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段，設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針，引物長(zhǎng)度一般為20個(gè)堿基左右，引物間和引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列。最優(yōu)引物、探針序列組合如下上游弓I物PPVpf:CAACTACGCAGCAACTCCAATAC下游引物PPVpr:GGTTGGTGAAAGTTGGTGTTGTT探針PPVpb:CTCGCTCCACGGCTCCAAGGCTAA2.反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化豬細(xì)小病毒實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化靶區(qū)域模板以如下方法獲得利用滅活的豬細(xì)小病毒毒株作為待檢樣品，用酚氯仿的提取方法提取病毒基因組DNA，分裝后儲(chǔ)存于_2(TC備用。2.1引物濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中，將豬細(xì)小病毒的引物濃度分別從0.1ymol/L至0.8pmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0.2umol/L。2.2鎂離子濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件不變的前提下，將MgCl2的濃度從1mmol/L至2.5mmol/L以0.5隨ol/L遞增，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)選定2.5mmol/L為試劑盒反應(yīng)體系中的鎂離子濃度。2.3TaqDNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化通過(guò)比較Taq酶用量(以單位Unit計(jì))的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定2U作為試劑盒反應(yīng)體系中Taq酶的用量。2.4dNTPs濃度的優(yōu)化通過(guò)使用不同濃度的dNTPs進(jìn)行檢測(cè)，綜合評(píng)估后選0.2mmol/L作為試劑盒反應(yīng)體系中dNTPs的使用量。2.5探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中，將豬細(xì)小病毒的探針濃度分別從0.05iimol/L至0.2pmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0.lumol/L。利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的熒光PCR反應(yīng)體系為4Gnl體系，所需各組分及相應(yīng)濃度見(jiàn)表l。表1優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注a.在熒光PCR反應(yīng)體積^F同時(shí)，各試劑應(yīng)按比例調(diào)整。b.使用的儀器不同，應(yīng)將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。3.儀器檢測(cè)通道的選擇在進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)對(duì)所用儀器中反應(yīng)管熒光信號(hào)的收集進(jìn)行設(shè)置，選擇的熒光檢測(cè)通道與探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)一致。具體設(shè)置方法因儀器而異，應(yīng)參照儀器使用說(shuō)明書(shū)。4.PCR條件選擇如下95°C2分鐘，l個(gè)循環(huán)；95°C5秒，6G°C40秒，4G個(gè)循環(huán)。5.檢測(cè)步驟(1)選取引物和探針；(2)制備待測(cè)模板,可采用酚一氯仿法提取各種來(lái)源樣品中豬細(xì)小病毒的基因組DNA;(3)反應(yīng)體系的建立a、確定最佳引物濃度；b、確定鎂離子濃度；C、確定TaqDNA聚合酶(Taq酶)用量；d、確定dNTPs濃度；e、確定探針濃度；(4)選擇儀器的檢測(cè)通道；(5)上機(jī)檢測(cè)。6.實(shí)施例選取引物對(duì)PPVpf/PPVpr和探針PPVpb，將待檢的豬細(xì)小病毒培養(yǎng)液用酚一氯仿法抽提基因組DNA。具體步驟如下(1)剪取50-100mg新鮮組織樣本，加入裝有500ulHanks液的研缽中緩慢研成勻漿，取勻漿液作為樣本進(jìn)行下一步處理。如果樣本為血液，取血清作為樣本進(jìn)行下一步處理。(2)加入DM裂解液70Gul,充分混勻重懸，水浴煮沸5分鐘。(3)加入等體積的酚一氯仿(V/V-1:1)溶液，充分混勻后離心，13Q00轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。(4)將上清液移入另一個(gè)1.5ml的離心管中，加入等體積的氯仿，混勻，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。(5)將上清液移入另一個(gè)1.5ml的離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻，13GQG轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。(6)棄上清后用70%乙醇沖洗，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，小心吸棄上清，倒置晾干。(7)在干燥后的離心管中加入50ulDNA溶解液充分混勻，作為DNA模板待用。在40ul熒光PCR反應(yīng)體系中，加入以上提取的豬細(xì)小病毒基因組DNA2ul，根據(jù)前述PCR反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。經(jīng)檢測(cè)，若待檢培養(yǎng)液中含有豬細(xì)小病毒則顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1000個(gè)拷貝/ml;若待檢培養(yǎng)液中不含有豬細(xì)小病毒則無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物對(duì)和探針具有良好的靈敏度和特異性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明提供的引物和探針的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1000個(gè)拷貝/ml，說(shuō)明其具有良好的靈敏度。(2)本發(fā)明提供的引物和探針對(duì)于不含有豬細(xì)小病毒的檢測(cè)樣本均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，說(shuō)明其具有良好的特異性。(3)由于本發(fā)明分別對(duì)所有已知的豬細(xì)小病毒基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)，避免了假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。(4)由于本發(fā)明采用熒光PCR技術(shù)作為檢測(cè)方法，整個(gè)反應(yīng)均在封閉的反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，避免了其他核酸檢測(cè)方法如PCR—電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽(yáng)性結(jié)果；由于對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，大大節(jié)省了監(jiān)測(cè)時(shí)間，節(jié)約了人力物力。SEQUENCELISTING<110>深圳太太基因工程有限公司<120〉一種用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒核苷酸片段的引物和探針序列<130〉2<160〉3<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211>23<212>DM<213>人工序列<400>1caactacgcagcaactccaatac23<210〉2<211〉23<212>■<213>人工序列<400〉2ggttggtgaaag"ggtgttgtt<210>3<211>24<212>DM<213>人工序列<400〉3ctcgctccacggctccaaggctaa權(quán)利要求1.一種用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物PPVpf序列為CAACTACGCAGCAACTCCAATAC和下游引物PPVpr序列為GGTTGGTGAAAGTTGGTGTTGTT組成的引物對(duì)。2.—種用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針PPVpb序列為CTCGCTCCACGGCTCCAAGGCTAA。全文摘要一種用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒核苷酸片段的引物和探針序列。引物序列包括由上游引物PPVpf序列為CAACTACGCAGCAACTCCAATAC和下游引物PPVpr序列為GGTTGGTGAAAGTTGGTGTTGTT組成的引物對(duì)。探針PPVpb序列為CTCGCTCCACGGCTCCAAGGCTAA。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101294224SQ20071007419公開(kāi)日2008年10月29日申請(qǐng)日期2007年5月8日優(yōu)先權(quán)日2007年5月8日發(fā)明者斌吳,張經(jīng)緯,葉李,李振榮,肖性龍,胡傳偉,赟賈申請(qǐng)人:深圳太太基因工程有限公司;中華人民共和國(guó)遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局